本文展示了在人糖尿病供体角膜器官培养模型中，利用腺病毒基因治疗使角膜上皮干细胞标志物表达显著降低及伤口愈合延迟等异常情况趋于正常化的实例。同时，还描述了在富含干细胞的角膜缘上皮细胞培养体系中对该治疗过程的优化方法。
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本文内容
摘要
摘要
本实验方案旨在描述人类糖尿病角膜中的分子改变，并演示如何通过腺病毒基因治疗在器官培养的角膜中缓解这些改变。糖尿病性角膜病变是糖尿病的一种并发症，常表现为角膜神经异常和上皮伤口愈合障碍。我们还发现，在人类糖尿病角膜中，多种假定的上皮干细胞标志物的表达水平发生显著改变。为缓解这些变化，我们成功应用了腺病毒基因治疗，通过上调c-met原癌基因的表达和/或下调基质金属蛋白酶-10（MMP-10）与组织蛋白酶F的表达来实现干预。即使仅转导角膜缘干细胞区，该疗法也能加速糖尿病角膜的伤口愈合。联合治疗取得了最佳效果。为将来可能将恢复正常功能的干细胞用于患者移植，本文还展示了利用阳离子增强剂优化富含干细胞的培养体系中基因转导效率的一个示例。该策略不仅适用于所选基因，也可能适用于其他参与角膜上皮伤口愈合及干细胞功能调控的介质。
引言
糖尿病性角膜病变主要导致上皮（角膜病变）和神经（神经病变）的退行性改变，常表现为上皮伤口愈合异常和角膜神经减少1-4。据估计，约60%-70%的糖尿病患者存在各种角膜问题1,3。我们的研究已鉴定出若干在人类糖尿病角膜中表达发生改变的标志蛋白，包括c-met原癌基因（肝细胞生长因子受体）表达下调，以及基质金属蛋白酶-10（MMP-10）和组织蛋白酶F（cathepsin F）表达上调5,6。我们还记录到人类糖尿病角膜中多种假定的上皮干细胞标志物的表达显著降低。
在先前的研究中，我们开发了一种基于腺病毒的基因疗法，利用人糖尿病角膜器官培养系统来使糖尿病相关标志物水平恢复正常。该系统表现出伤口愈合缓慢、糖尿病标志物改变以及干细胞标志物表达减少，这些特征与ex vivo角膜相似7,8。这些持续性改变似乎源于表观遗传代谢记忆的存在9。该培养系统进一步被用于基因治疗。治疗靶点选自在糖尿病角膜中表达下调的标志物（如c-met原癌基因）或表达上调的标志物（如MMP-10和组织蛋白酶F）。
腺病毒（AV）疗法应用于全器官培养的角膜，或仅用于角膜巩膜周边的角膜缘区。该区域含有上皮干细胞，可更新角膜上皮，并积极参与伤口愈合过程4,10-15。本文提供了正常人和糖尿病患者角膜器官培养、上皮伤口愈合、富含干细胞的角膜缘细胞培养物的分离与鉴定，以及腺病毒介导的细胞和角膜转导的实验方案。我们的结果表明，该疗法在恢复正常标志物表达和促进糖尿病角膜伤口愈合方面具有可行性，可能为未来的移植治疗提供支持。此外，研究结果提示，联合疗法是恢复糖尿病角膜正常标志物表达模式和上皮愈合最有效的方法16-18。
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方案
国家疾病研究交流中心（NDRI，美国宾夕法尼亚州费城）提供了经知情同意的死后健康人和糖尿病患者的全眼及角膜组织。NDRI 的人体组织采集方案已获得管理委员会批准，并接受美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的监督。本研究依据 Cedars-Sinai 医疗中心机构审查委员会（IRB）批准的豁免协议 EX-1055 进行。合作的角膜外科医生 E. Maguen 博士和 Y. Rabinowitz 博士提供了废弃的角膜巩膜环，用于分离富含干细胞的角膜上皮细胞培养物。本研究亦依据经批准的 IRB 协议 Pro00019393 进行。
1. 人角膜器官培养
注意：正常和糖尿病患者的角膜或完整眼球以冷藏的角膜保存液接收例如，Optisol GS）在死亡后48小时内从国家供应商NDRI获取。
- 用镊子将角膜从储存容器中取出，并用抗生素-抗真菌素（ABAM）混合液清洗两次。若是完整眼球，需用弯头剪刀从眼球上剪下角膜，保留至少5 mm的结膜边缘，随后也将角膜在ABAM中清洗。
- 制备用于填充角膜凹面的混合液。该混合液由无血清最低必需培养基（MEM）组成，其中包含ABAM、1 mg/ml小牛皮胶原（由10 mg/ml溶于0.1 N乙酸的储备液配制）、1%琼脂以及胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸盐补充剂7。
- 将此混合液放入微波炉加热至沸腾，以实现灭菌和琼脂溶解。完全溶解可能需要长达1分钟。加热时试管盖应部分打开，因为混合液沸腾时容易溢出。因此，可能需要进行多次短时沸腾处理，每次10–15秒。随后将混合液冷却至37–39 °C。
- 将角膜上皮面朝下放置于无菌的60 mm培养皿中。在角膜凹面加入约0.5 ml步骤1.2中所述的混合液。混合液在角膜上约2分钟内即凝固。
- 将角膜琼脂面朝下放置于无菌60 mm培养皿中，并加入完全培养基，包含含ABAM的MEM及胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸盐补充剂7（37 °C），使液面高度维持在角膜缘附近，以进行气-液界面培养。每皿培养基体积为7–8 ml。
- 将放置角膜的培养皿置于35 °C、5% CO2的培养箱中，箱内配有水盘以维持湿度（使湿度保持在95%或更高）。每日在上皮表面添加100 μl培养基（两滴），以保持角膜湿润。
- 使用配备4倍物镜的标准显微镜，在透射光下每日一次对角膜形态及上皮细胞活力进行显微观察。
- 每三天更换一次培养基。角膜可培养至少三周。对于基因治疗实验，先将角膜培养3–5天，随后转导目的基因（步骤4.1–4.4），再根据外源基因特性及创伤愈合方案（步骤2.1–2.4）继续培养3–5天。
2. 上皮伤口愈合
注意：在糖尿病角膜中，机械刮除法进行上皮清创不可行，因为脆弱的上皮基底膜会在该过程中发生脱离，而这种情况在正常角膜中不会出现。因此，为了使正常角膜和糖尿病角膜处于相似的伤口愈合条件下，采用正庚醇化学去除上皮19。该方法可去除上皮层，同时在正常和糖尿病角膜中均保留完整的基底膜。
- 进行中央上皮清创时20，将浸有正庚醇的5 mm滤纸片置于角膜前表面中央，持续75秒。
- 移除滤纸，用完全培养基清洗角膜。在凹槽内加入0.5 ml琼脂-胶原混合物，并按1.4步骤进行培养。清创后，上皮细胞通常会死亡并脱落，显微镜下可见基底膜保持完整7。
- 在仅进行角膜缘基因治疗的实验中，使用8.5 mm直径的滤纸片以制造更大的上皮缺损，从而确保角膜缘干细胞参与修复过程。
- 显微镜下监测角膜愈合情况。自实验开始每日在4倍和10倍放大下拍照，直至上皮缺损完全愈合。愈合时间因样本状态（正常或糖尿病）及伤口大小而异，通常为2至15天。
注意：愈合过程中，在焦平面顶部可观察到黑色蜘蛛样细胞。这些是上皮去除后发生凋亡的基质角质细胞4。当新生上皮覆盖这些死亡细胞并使其不再可见时，即判定为愈合完成（图2，插图）。 - 愈合完成后，将角膜切成两半，包埋于O.C.T.包埋剂中，随后进行冰冻切片间接免疫荧光染色或Western blot分析16,21。
3. 角膜缘细胞的分离及富含干细胞的培养物的维持
注意：从角巩膜缘获取组织，制备富含角膜缘上皮干细胞（LESC）的原代培养物。组织样本来自健康供体，在角膜移植术后由合作外科医生提供，置于标准角膜保存液中。例如，Optisol）。否则，可从NDRI提供的正常或糖尿病全角膜或眼球中切除角膜缘组织，置于角膜保存液中，从而获得富含角膜缘上皮干细胞（LESC）的培养物。
- 若使用完整角膜或眼球，首先分离角膜缘区域。操作时将角膜放置于无菌塑料培养皿中，上皮面朝上，用9 mm角膜环钻（圆形角膜刀）切除中央区域，并弃去该部分。随后使用13 mm角膜环钻切取角膜缘区，弃去外部的结膜组织，保留呈 Bagel 样的角膜缘环用于细胞分离。在细胞分离前，用无菌棉签从角膜内侧（与上皮表面相对的一侧）去除内皮细胞及附着的虹膜残留组织。
- 采用dispase处理法分离角膜缘细胞片层。将每个角膜巩膜环置于含1.5 ml角质形成细胞无血清培养基（KSFM）的容器中，加入终浓度为2.4 U/ml的dispase II，并添加10%胎牛血清（FBS），于37 °C孵育2小时22。
- 在解剖显微镜下，用镊子轻轻将角膜缘上皮细胞片层从环状组织上剥离下来，随后将其置于1 ml含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的溶液中，在室温下消化30分钟以分散细胞。
- 用10 ml培养基（例如，Epilife）洗涤细胞，并在室温下以300 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。
- 将细胞重悬于含N2、B27及人角质形成细胞生长添加剂，并添加10 ng/ml表皮生长因子（EGF）的培养基中。
- 将细胞以每毫升3,000–5,000个细胞的密度接种于经人基底膜蛋白混合物（包括纤连蛋白、IV型胶原和层粘连蛋白，简称FCL）包被的培养瓶或60 mm培养皿中，FCL包被浓度为0.5–1 μg/cm2，使用KSFM培养基。
- 将细胞置于37 °C、湿润环境（湿度≥95%）的CO2培养箱中培养，直至形成完全汇合的单层细胞，此过程可能需要1–2周。
注意：应定期通过免疫细胞化学染色确认细胞身份，检测角膜缘上皮干细胞（LESC）相关标志物（如PAX6、角蛋白（K）14、K15、K17和ΔNp63α）的阳性表达。所用一抗及其他染色细节已有文献报道8,16-18,22。 - 传代汇合的细胞时，加入1 ml 0.05%胰蛋白酶溶液（将0.25%溶液按1:5稀释）于37 °C处理10分钟，随后加入5 ml用培养基按1:4稀释的大豆胰蛋白酶抑制剂溶液（终浓度10 mg/ml），参照步骤3.5进行离心。
- 用3 ml稀释的大豆胰蛋白酶抑制剂溶液洗涤细胞沉淀。将细胞以每毫升2 × 104个细胞的密度接种至FCL包被（见步骤3.7）的培养皿或玻璃腔室载玻片上。
4. 器官培养角膜的腺病毒感染转导
注意：重组腺病毒（AV）包括 AV-空载体（未插入基因）、AV-cmet（携带 c-met 基因的开放阅读框）、AV-shM10（携带针对 MMP-10 的 shRNA）和 AV-shCF（携带针对 cathepsin F 的 shRNA）。这些均为 E1/E3 缺失型 5 型腺病毒，其基因表达由巨早期人巨细胞病毒启动子调控。AV-cmet 病毒使用 AV 载体 pAd/CMV/V5-DEST16 构建而成。AV-shRNA 病毒则通过 Adeno-4 表达系统17，将 shRNA 序列连同 hH1 启动子及 GFP 标签序列从 iLenti-EGFP 载体亚克隆至复制缺陷型（-E1/-E3）人 5 型腺病毒基因组中定制构建而成。
- 将每对角膜中的一片在器官培养条件下用AV载体转导，另一片用基因表达调控型AV转导。在24孔板中，每孔加入含0.8至1.25 × 108斑块形成单位（pfu）的AV-cmet病毒颗粒，每片角膜对应一个孔，于37 °C孵育48小时，确保角膜始终浸没于培养基液面下。使用AV-shRNA病毒时，每片角膜接种量为1–2 × 108 pfu。
- 在完全培养基中进行病毒转导，并添加75 μg/ml枸橼酸西地那非。该试剂可激活小窝蛋白介导的运输途径，促进上皮细胞对病毒的摄取21。由于西地那非在水溶液中半衰期较短，需在4–5小时后向培养基中再次加入等量试剂。标准处理时间为48小时。
- 使用圆头无菌刮匙将角膜转移至新的培养皿中，并在不含AV的培养基中继续培养，保持液面位于角膜缘水平。在气液界面条件下继续培养额外4–8天后，对经AV处理的角膜进行各项分析或上皮伤口愈合检测（见上文）。培养期间应定期湿润角膜，每次在角膜表面滴加100 μl培养基（约两滴）。
- 若仅需转导角膜缘细胞，应将病毒与角膜在气液界面条件下共孵育，并控制培养基液面位于角膜缘水平，以避免中央上皮细胞被转导。
5. 培养角膜缘细胞的腺病毒感染转导
- 将富含角膜缘上皮干细胞（LESC）的培养物维持在添加了10 ng/ml EGF（见3.5）的培养基中，并接种于涂有FCL混合物（0.5 μg/cm2）的塑料培养皿上。
- 当培养细胞达到70–80%融合度时，使用携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒（AV-GFP）或携带乱序shRNA-GFP的腺病毒（AV-scrambled shRNA-GFP）进行转导，感染复数（MOI）范围为1–300 pfu/细胞，转导时培养基中含2 ng/ml EGF。先在37 °C下以最小体积（0.2 ml）孵育4小时，随后加入培养基至总体积0.5 ml，继续孵育20小时。细胞培养转导过程中无需添加穴蛋白转运激活剂西地那非（sildenafil）。
- 可选用以下任一试剂以促进腺病毒与细胞表面的结合，从而提高腺病毒转导效率：多聚阳离子（1 μg/ml 多聚-L-赖氨酸或5 μg/ml 多聚素B），或6 μl/ml 转导试剂（例如，ViraDuctin），或20 μl/ml 转导增强剂（例如，ibiBoost）。
- 更换为不含腺病毒的新鲜培养基后，将培养细胞在加湿的CO2培养箱中继续孵育4天，并使用倒置荧光显微镜评估GFP表达水平。
- 采用划痕伤口愈合实验评估腺病毒转导后培养细胞的迁移能力。将细胞培养于多孔腔室载玻片中，使用200 μl移液枪头沿直线刮划单层细胞以制造伤口。划伤后更换为新鲜培养基，以去除脱落的细胞。
- 每天使用连接在倒置显微镜上的数码相机在4倍放大倍数下拍摄伤口图像，记录伤口完全愈合的时间（即伤口两侧边缘在整个长度上完全接触）。
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结果
我们先前已证实，在角膜器官培养中，糖尿病标志物的表达存在差异（例如，正常角膜与糖尿病角膜之间的基底膜蛋白、整合素α3β1以及伤口愈合能力得以保持。该培养系统接受了基因治疗，旨在使糖尿病相关异常标志物c-met、MMP-10和组织蛋白酶F的表达水平恢复正常。
当整个角膜上皮被AV-cmet或分别或联合使用针对MMP-10或组织蛋白酶F的AV-shRNA转导后，上皮伤口愈合完成的速度显著快于来自同一供体的AV载体转导对侧角膜（与AV载体相比，配对Student t检验P<0.03）16,17。AV-cmet使愈合时间缩短了一半，与正常角膜的愈合时间无显著差异（图1）。AV-shM10和AV-shCF的作用较小。然而，AV-cmet联合AV-shM10和AV-shCF（Combo）产生的效应最强，完全使糖尿病角膜上皮愈合时间恢复正常（图1）。这种...
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讨论
角膜由于其位于表面，便于基因递送以及疗效和副作用的评估，似乎是基因治疗的理想组织。然而，由于角膜疾病遗传病因及基因治疗靶点的相关信息尚不充分，这一强大方法的临床转化进展仍然缓慢。24糖尿病并发症（包括角膜改变）在很大程度上可能具有表观遗传本质，这表现为代谢记忆9因此，糖尿病组织和细胞保持其异常特性 离体 并且可以在器官和组织培养中进行研究。此外，糖尿病会引起基因表达水平和模式的特异性改变，这些改变可通过基因治疗得以纠正。我们已鉴定出糖尿病角膜上皮中多个发生改变的标志物，包括干细胞区室中的标志物。5,6,8，并使用了人角膜器官培养物7,8 通过基因治疗使糖尿病角膜中异常的标志物表达和受损的上皮伤口愈合恢复正常。
我们选择腺病毒（AV）作为基因递送载体，是因为其具有强烈的外源基因表达能力、非整合特性以及对上皮细胞的选择性，这些特性优于腺相关病毒（AAV）25。在角膜器官培养中进行AV转导时，有几个关键步骤。角膜应在死亡后48小时内送达实验室，以尽量减少储存过程...
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披露
作者声明不存在经济利益冲突。
致谢
我们衷心感谢美国国立卫生研究院/国立眼科研究所 R01 EY13431（AVL）、临床与转化科学研究所资助项目 UL 1RR033176（AVL），以及再生医学研究所和西达斯-西奈医疗中心提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 最低必需培养基 | 赛默飞世尔科技 | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch && 罗姆 | 50006-OPT | |
| ABAM 抗生素-抗真菌素混合液 | 赛默飞世尔科技 | 15240062 | |
| 牛皮胶原蛋白 | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| 琼脂，组织培养级 | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| 正庚醇 | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. 包埋剂 | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | 罗氏应用科学 | 4942078001 | |
| 无血清角质形成细胞培养基（KSFM） | 赛默飞世尔科技 | 17005042 | |
| 含钙的EpiLife培养基 | 赛默飞世尔科技 | MEPI500CA | |
| N2培养基添加剂，100倍浓缩液 | 赛默飞世尔科技 | 17502-048 | |
| B27 培养基添加剂，50 倍浓缩液 | 赛默飞世尔科技 | 17504-044 | |
| 人角质形成细胞生长添加剂，100倍浓缩液 | 赛默飞世尔科技 | S-001-5 | |
| 0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTA（含酚红） | 赛默飞世尔科技 | 25200056 | |
| 含酚红的0.25%胰蛋白酶 | 赛默飞世尔科技 | 15050065 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| 胎牛血清 | 赛默飞世尔科技 | 26140079 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒酸盐补充剂（ITS） | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| 角蛋白14抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| 角蛋白15抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| 角蛋白17抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| 抗体至 ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| PAX6 抗体 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| 抗nidogen-1抗体 | R&D Systems | MAB2570 | |
| 抗整合素抗体 α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| 人纤维连接蛋白 | BD 生物科学 | 354008 | |
| 人层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| 人IV型胶原蛋白 | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| 表达 MMP-10 shRNA 的腺病毒 | Capital BioSciences | 定制 | |
| 表达组织蛋白酶F shRNA的腺病毒 | Capital BioSciences | 定制 | |
| 表达乱序shRNA和GFP的腺病毒 | Capital BioSciences | 定制 | |
| 表达c-met的腺病毒 | OriGene（质粒） | SC323278 | |
| 表达GFP的腺病毒 | KeraFAST | FVQ002 | |
| 枸橼酸西地那非，25 mg | 辉瑞 | 来自药房 | |
| 表皮生长因子 | 赛默飞世尔科技 | PHG0311 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi，德国 | 50301 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 赛默飞世尔科技 | 10010049 | |
| 康宁圆头刮铲 | 道康宁 | 3005 | |
| 60 mm 培养皿 | 赛默飞世尔科技 | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II 多孔板腔室载玻片 | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μ移液器吸头 | Bioexpress | P-1233-200 | 其他供应商可选 |
| 倒置显微镜 | 尼康 | 倒置显微镜 | 其他供应商/型号可选 |
| 加湿的 CO₂2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 370（Steri-Cycle） | 其他供应商/型号可选 |
| 荧光显微镜 | 日本 Olympus | BX-40 | 其他供应商/型号可选 |
| 解剖立体显微镜 | Leica，德国 | S4 集 | 其他供应商/型号可选 |
参考文献
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