本文展示了在人糖尿病供体角膜器官培养模型中，利用腺病毒基因治疗使角膜上皮干细胞标志物表达显著降低及伤口愈合延迟等异常情况趋于正常化的实例。同时，还描述了在富含干细胞的角膜缘上皮细胞培养体系中对该治疗过程的优化方法。
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摘要
摘要
本实验方案旨在描述人类糖尿病角膜中的分子改变，并演示如何通过腺病毒基因治疗在器官培养的角膜中缓解这些改变。糖尿病性角膜病变是糖尿病的一种并发症，常表现为角膜神经异常和上皮伤口愈合障碍。我们还发现，在人类糖尿病角膜中，多种假定的上皮干细胞标志物的表达水平发生显著改变。为缓解这些变化，我们成功应用了腺病毒基因治疗，通过上调c-met原癌基因的表达和/或下调基质金属蛋白酶-10（MMP-10）与组织蛋白酶F的表达来实现干预。即使仅转导角膜缘干细胞区，该疗法也能加速糖尿病角膜的伤口愈合。联合治疗取得了最佳效果。为将来可能将恢复正常功能的干细胞用于患者移植，本文还展示了利用阳离子增强剂优化富含干细胞的培养体系中基因转导效率的一个示例。该策略不仅适用于所选基因，也可能适用于其他参与角膜上皮伤口愈合及干细胞功能调控的介质。
引言
糖尿病性角膜病变主要导致上皮（角膜病变）和神经（神经病变）的退行性改变，常表现为上皮伤口愈合异常和角膜神经减少1-4。据估计，约60%-70%的糖尿病患者存在各种角膜问题1,3。我们的研究已鉴定出若干在人类糖尿病角膜中表达发生改变的标志蛋白，包括c-met原癌基因（肝细胞生长因子受体）表达下调，以及基质金属蛋白酶-10（MMP-10）和组织蛋白酶F（cathepsin F）表达上调5,6。我们还记录到人类糖尿病角膜中多种假定的上皮干细胞标志物的表达显著降低。
在先前的研究中，我们开发了一种基于腺病毒的基因疗法，利用人糖尿病角膜器官培养系统来使糖尿病相关标志物水平恢复正常。该系统表现出伤口愈合缓慢、糖尿病标志物改变以及干细胞标志物表达减少，这些特征与ex vivo角膜相似7,8。这些持续性改变似乎源于表观遗传代谢记忆的存在9。该培养系统进一步被用于基因治疗。治疗靶点选自在糖尿病角膜中表达下调的标志物（如c-met原癌基因）或表达上调的标志物（如MMP-10和组织蛋白酶F）。
腺病毒（AV）疗法应用于全器官培养的角膜，或仅用于角膜巩膜周边的角膜缘区。该区域含有上皮干细胞，可更新角膜上皮，并积极参与伤口愈合过程4,10-15。本文提供了正常人和糖尿病患者角膜器官....
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方案
国家疾病研究交流中心（NDRI，美国宾夕法尼亚州费城）提供了经知情同意的死后健康人和糖尿病患者的全眼及角膜组织。NDRI 的人体组织采集方案已获得管理委员会批准，并接受美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的监督。本研究依据 Cedars-Sinai 医疗中心机构审查委员会（IRB）批准的豁免协议 EX-1055 进行。合作的角膜外科医生 E. Maguen 博士和 Y. Rabinowitz 博士提供了废弃的角膜巩膜环，用于分离富含干细胞的角膜上皮细胞培养物。本研究亦依据经批准的 IRB 协议 Pro00019393 进行。
1. 人角膜器官培养
注意：正常和糖尿病患者的角膜或完整眼球以冷藏的角膜保存液接收例如，Optisol GS）在死亡后48小时内从国家供应商NDRI获取。
- 用镊子将角膜从储存容器中取出，并用抗生素-抗真菌素（ABAM）混合液清洗两次。若是完整眼球，需用弯头剪刀从眼球上剪下角膜，保留至少5 mm的结膜边缘，随后也将角膜在ABAM中清洗。
- 制备用于填充角膜凹面的混合液。该混合液由无血清最低必需培养基（MEM）组成，其中包含ABAM、1 mg/ml小牛皮胶原（由10 mg/ml溶于0.1 N乙酸的储备液配制）、1%琼脂以及胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸盐补充剂7。
- 将此混合液放入微波炉加热至沸腾，以实现灭菌和琼脂溶解。完全溶解可能需要长达1分钟。加....
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结果
我们先前已证实，在角膜器官培养中，糖尿病标志物的表达存在差异（例如，正常角膜与糖尿病角膜之间的基底膜蛋白、整合素α3β1以及伤口愈合能力得以保持。该培养系统接受了基因治疗，旨在使糖尿病相关异常标志物c-met、MMP-10和组织蛋白酶F的表达水平恢复正常。
当整个角膜上皮被AV-cmet或分别或联合使用针对MMP-10或组织蛋白酶F的AV-shRNA转导后，上皮伤口愈合完成的速度显著快于来自同一供体的AV载体转导对侧角膜（与AV载体相比，配对Student t检验P<0.03）16,17。AV-cmet使愈合时间缩短了一半，与正常角膜的愈合时间无显著差异（图1）。AV-shM10和AV-shCF的作用较小。然而，AV-cmet联合AV-shM10和AV-shCF（Combo）产生的效应最强，完全使糖尿病角膜上皮愈合时间恢复正常（图1）。这种.......
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讨论
角膜由于其位于表面，便于基因递送以及疗效和副作用的评估，似乎是基因治疗的理想组织。然而，由于角膜疾病遗传病因及基因治疗靶点的相关信息尚不充分，这一强大方法的临床转化进展仍然缓慢。24糖尿病并发症（包括角膜改变）在很大程度上可能具有表观遗传本质，这表现为代谢记忆9因此，糖尿病组织和细胞保持其异常特性 离体 并且可以在器官和组织培养中进行研究。此外，糖尿病会引起基因表达水平和模式的特异性改变，这些改变可通过基因治疗得以纠正。我们已鉴定出糖尿病角膜上皮中多个发生改变的标志物，包括干细胞区室中的标志物。5,6,8，并使用了人角膜器官培养物7,8 通过基因治疗使糖尿病角膜中异常的标志物表达和受损的上皮伤口愈合恢复正常。
我们选择腺病毒（AV）作为基因递送载体，是因为其具有强烈的外源基因表达能力、非整合特性以及对上皮细胞的选择性，这些特性优于腺相关病毒（AAV）25。在角膜器官培养中进行AV转导时，有几个关键步骤。角膜应在死亡后48小时内送达实验室，以尽量减少储存过程.......
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披露
作者声明不存在经济利益冲突。
致谢
我们衷心感谢美国国立卫生研究院/国立眼科研究所 R01 EY13431（AVL）、临床与转化科学研究所资助项目 UL 1RR033176（AVL），以及再生医学研究所和西达斯-西奈医疗中心提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 最低必需培养基 | 赛默飞世尔科技 | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch && 罗姆 | 50006-OPT | |
| ABAM 抗生素-抗真菌素混合液 | 赛默飞世尔科技 | 15240062 | |
| 牛皮胶原蛋白 | Sigma-Aldrich | C9791 | |
| 琼脂，组织培养级 | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| 正庚醇 | Sigma-Aldrich | 72954-5ML-F | |
| O.C.T. 包埋剂 | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | 罗氏应用科学 | 4942078001 | |
| 无血清角质形成细胞培养基（KSFM） | 赛默飞世尔科技 | 17005042 | |
| 含钙的EpiLife培养基 | 赛默飞世尔科技 | MEPI500CA | |
| N2培养基添加剂，100倍浓缩液 | 赛默飞世尔科技 | 17502-048 | |
| B27 培养基添加剂，50 倍浓缩液 | 赛默飞世尔科技 | 17504-044 | |
| 人角质形成细胞生长添加剂，100倍浓缩液 | 赛默飞世尔科技 | S-001-5 | |
| 0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTA（含酚红） | 赛默飞世尔科技 | 25200056 | |
| 含酚红的0.25%胰蛋白酶 | 赛默飞世尔科技 | 15050065 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| 胎牛血清 | 赛默飞世尔科技 | 26140079 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒酸盐补充剂（ITS） | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| 角蛋白14抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| 角蛋白15抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| 角蛋白17抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| 抗体至 ΔNp63α | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| PAX6 抗体 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| 抗nidogen-1抗体 | R&D Systems | MAB2570 | |
| 抗整合素抗体 α3β1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| 人纤维连接蛋白 | BD 生物科学 | 354008 | |
| 人层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| 人IV型胶原蛋白 | Sigma-Aldrich | C6745-1ML | |
| 表达 MMP-10 shRNA 的腺病毒 | Capital BioSciences | 定制 | |
| 表达组织蛋白酶F shRNA的腺病毒 | Capital BioSciences | 定制 | |
| 表达乱序shRNA和GFP的腺病毒 | Capital BioSciences | 定制 | |
| 表达c-met的腺病毒 | OriGene（质粒） | SC323278 | |
| 表达GFP的腺病毒 | KeraFAST | FVQ002 | |
| 枸橼酸西地那非，25 mg | 辉瑞 | 来自药房 | |
| 表皮生长因子 | 赛默飞世尔科技 | PHG0311 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi，德国 | 50301 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 赛默飞世尔科技 | 10010049 | |
| 康宁圆头刮铲 | 道康宁 | 3005 | |
| 60 mm 培养皿 | 赛默飞世尔科技 | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II 多孔板腔室载玻片 | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μ移液器吸头 | Bioexpress | P-1233-200 | 其他供应商可选 |
| 倒置显微镜 | 尼康 | 倒置显微镜 | 其他供应商/型号可选 |
| 加湿的 CO₂2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | 370（Steri-Cycle） | 其他供应商/型号可选 |
| 荧光显微镜 | 日本 Olympus | BX-40 | 其他供应商/型号可选 |
| 解剖立体显微镜 | Leica，德国 | S4 集 | 其他供应商/型号可选 |
参考文献
- Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
- Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2....
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