相关光学和电子显微镜，研究与β淀粉样蛋白斑块的小神经胶质互动

Summary

本文介绍了使用甲氧基X04，它穿过血 - 脑屏障，并选择性地结合β褶的致密核心斑块Aβ发现张在阿尔茨海默氏症小鼠模型可视化淀粉样蛋白斑块Aβ的协议。它允许的前免疫染色和处理电子显微镜含斑块组织切片预检。

Abstract

详细协议这里提供给前从阿尔茨海默氏病小鼠模型中确定在脑切片的淀粉样蛋白的Aβ斑块的预嵌入免疫染色（特别为离子化的钙结合衔接分子​​1（IBA1），由小胶质细胞中表达的钙结合蛋白）和组织处理电子显微镜（EM）。甲氧基X04是荧光染料跨越血 - 脑屏障和选择性结合在致密核心的Aβ斑块中发现β-打褶纸。用甲氧基X04动物注射前牺牲和脑定影允许预筛分和含斑块的脑切片进行进一步的处理与费时的操作的选择。研究可能含有非常少的斑块，本仅在部分的一小部分的特定的脑区域或层内早期AD病理时，这是特别有帮助。刚果红，硫磺素S和Thiofl组织切片的验尸处理AVIN T（或者甚至与甲氧基X04）可以标记β-折叠片，但需要用乙醇广泛清算去除多余的染料和这些程序与超微结构保存不兼容。它也将是低效率的，以对Aβ（和其它细胞标记诸如IBA1）对感兴趣的区域的所有的脑切片进行标记，只得到含有的Aβ斑块在合适位置的一小部分。重要的是，Aβ斑块仍然可见的EM组织处理后，允许对区域的精确识别（一般下降到几平方毫米），用电子显微镜检查。

Introduction

淀粉样蛋白的Aβ斑块的形成是阿尔茨海默氏病（AD）的主要神经病理学特征。然而越来越多的证据表明，在疾病进展^1,2-免疫系统的重要的作用。特别是，从临床前和临床研究的新的数据建立的免疫功能障碍为主要驱动和贡献者AD病理学。有了这些发现，中枢及外周免疫细胞已成为有前途的治疗靶点AD ^3。以下方案结合了光学和电子显微镜（EM），以产生新的见解的Aβ斑块沉积和在公元小胶质细胞表型改变之间的关系。该协议允许的Aβ斑块在AD小鼠模型中使用的荧光染料甲氧基X04的体内注射的标记。甲氧基X04是，可以很容易穿越血 - 脑屏障进入脑实质并结合以高的β型褶片材的刚果红衍生物ffinity。因为染料是荧光的，它可用于Aβ斑块沉积的体内检测用双光子显微镜^4。一旦绑定到Aβ，甲氧基X04不会离解或斑块重新分配了，而且随着时间的推移保留其荧光。它一般给药外周，以允许大脑动力学⁵的非侵入性成像。荧光也保持以下醛固定，允许相关验尸分析，包括在Aβ斑块⁶附近的神经元死亡的调查。

这个协议利用甲氧基X04的性质来选择由APP _SWE / PS1A _246E小鼠脑切片（APP-PS1;共表达在APP基因Lys670Asn / Met671Leu一个双突变，和人类早老PS1-A264E变体）表现出^Aβ....

Protocol

注:所有实验均批准并根据机构的动物伦理委员会的指导方针与加拿大议会关于动物饲养的准则进行的，符合由拉瓦尔大学的动物护理委员会的管理。使用了4至21个月的年龄之间的APP-PS1雄性小鼠。 25℃，免费获得食物和水 - 这些动物在22一12小时明暗周期下安置。

1.甲氧基X04溶液制备

1. 由甲氧基X04溶解于含有10％二甲基亚砜（DMSO），45％丙二醇和45％磷酸钠缓冲盐水（在100mM磷酸缓冲液的0.9％NaCl溶液制备甲氧基X04 ⁹的5毫克/毫升溶液，pH值7.4）。
   1. 使用微量天平，称量5毫克甲氧基X04化合物。根据通风橱，溶解甲氧基X04 DMSO中，并搅拌，直到获得澄清绿色溶液。依次添加丙二醇和ph值而与每个另外搅拌osphate缓冲盐水。
   2. 搅拌在4℃旋转器上O / N的解决方案。获得黄绿色乳液。可以将溶液储存在4℃下长达两个月没有降解。

2.甲氧基X04注射液

1. 灌注前24小时，称重小鼠，并给各小鼠甲氧基X04的腹膜内注射，剂量为使用27个半ģ针10毫克/公斤体重。

3.注射的小鼠的穿心灌注

1. 在灌注前一天，制备磷酸盐缓冲盐水（PBS），3.5％的丙烯醛，和4％低聚甲醛（PFA）的解决方案^13....

Results

此部分示出了可以在协议的不同的关键步骤得到的结果。特别是，结果显示含有在特定区域甲氧基X04染色斑块和感兴趣的层的脑切片的例子:海马CA1区，地层radiatum和腔隙-moleculare。的斑块和海马区域/层状组织使用UV和亮场滤波器（ 图1）的组合依次显示。所选的脑切片随后免疫染色并处理的EM同时跟踪其的Aβ斑块的，考虑到它们仍然荧光以下免疫染色，并在与四氧化锇和嵌入（ 图1）治疗变得比周围神经纤维更暗。这允许人们识别区域（通常几平方毫米）的基础上LOCA用电子显微镜检查斑块化。此外，对于与IBA1小胶质细胞的嵌入预免疫染色的改进的协议被说明。该协议产生的小胶质细胞体，大大小小的过程（ 图2）的脑切片中的一个特殊的可视化以及抗体的渗透。因此，它有利于小胶质细胞体和过程中的超微结构水平的鉴定，以及它们与Aβ斑块（ 图3和4）相互作用的研究。

Discussion

该协议解释了使用EM针对致密核心Aβ斑块相关办法。甲氧基X04 体内注入允许包含特定区域内的Aβ斑块和感兴趣的层，例如海马CA1区，地层radiatum和腔隙-moleculare脑切片的快速选择。在本例中，甲氧基X04预检用嵌入预免疫染色IBA1研究小神经胶质表型如何不同与在致密核心的Aβ斑块的存在超微结构水平突触相互作用结合。

小胶质细胞是令人难以置信的响应他们的环境和他们的炎症活动已经长期研究中破坏正常的大脑功能，增强AD的进步的情况下。特别是，这些细胞中的神经变性过程中有牵连，由于其广泛的活化和促炎细胞因子的释放，导致CHRONIC神经炎症，和正常脑组织的破坏动态平衡^15。近年来，然而，也显示这些驻留的免疫细胞积极改造神经元回路中的健康脑，导致新的致病机制^16,17鉴定。他们在突触生理作用可能在公元神经炎症期间成为失调，造成加剧突触的损失，目前的在各种神经退行性疾病^18,19认知能力下降的最佳病理相关。

到前预嵌入IBA1染色法

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
甲氧基-X04	Tocris Bioscience	4920	10 mg 底物/片
丙二醇	Sigma Aldrich	W294004
二甲基亚砜 （DMSO）	Fisher BioReagents	BP231-1	注意：有毒
氯化钠 NaCl	Sigma	S9625
磷酸二氢钠 一水合	Sigma	S9638
磷酸氢二钠	Sigma	S0876
Tris 盐酸盐	Fisher BioReagents	BP153500
丙烯醛	Sigma	110221	注意：有毒
多聚甲醛颗粒	电子显微镜科学	19210	警告：有毒
滤纸	Fisher	09-790-14F
带管道的蠕动泵	ColeParmer	cp.78023-00
Excel 翼状血液采集套装针头 25 G	Becton Dickinson	367341
超细镊子	FST	11152-10	尖端形状：弯曲
	FST	14090-09	尖端形状：直线
哈特曼止血钳	FST	13003-10	尖端形状：弯曲
手术剪刀	FST	14004-16	尖端形状：直线
微型解剖剪刀	ROBOZ 外科商店	5818
玻璃闪烁瓶	Fisher Scientific	74515-20
振动片切片机 Leica VT1000 S	Leica Biosystems
振动切片机刀片	电子显微镜 Sciences	71990
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
24 孔组织培养板	Fisher Scientific	353047
乙二醇	Fisher 生物试剂	BP230-4
甘油	Fisher 生物试剂	BP229-4
过氧化氢，30%	J.T.BAKER	货号：2186-01
硼氢化钠	Sigma	480886
Tris HCl	Fisher	BP153-500ML
胎牛血清 （FBS）	Sigma Aldrich	F1051
牛血清白蛋白 （BSA），组分 V	Thomas Scientific	C001H24
Triton X-100	Sigma	T8787
抗 IBA1，兔	WAKO	019-19741
山羊抗兔 IgG	Jackson 免疫研究	111066046
VECTASTAIN Elite ABC 试剂盒（标准）	Vector Labs	PK-6100
3.3'-二氨基联苯胺四盐酸盐 （DAB）	Sigma	D5905-50TAB	注意：有毒
四氧化锇，4% 溶液	电子显微镜科学	19150	注意：有毒
的 Durcupan™ACM 单组分 A	Sigma	44611	树脂 注意：有毒
Durcupan™ACM 单组分 B	Sigma	44612	固化剂 注意：有毒
的 Durcupan™ACM 单组分 C	Sigma	44613	增塑剂 注意：有毒
Durcupan™ACM 单组分 D	Sigma	44614	促进剂 注意：有毒
乙醇	LesAlcoolsdeComerce	151-01-15N
环氧丙烷	Sigma	110205	注意：腐蚀性
铝称重皿	电子显微镜科学	70048-01
ACLAR®–含氟聚合物薄膜	电子显微镜 Sciences	50425
烘箱/培养箱	VWR