脉络丛（CP）的上皮细胞构成了血液-脑脊液屏障（BCSFB）。 体外 利用人脉络丛乳头状瘤（HIBCPP）细胞构建血脑脊液屏障（BCSFB）模型。本文介绍了使用细胞培养滤膜插入系统对HIBCPP细胞进行培养及基底侧感染的方法。
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摘要
摘要
位于脑室系统中的脉络丛（choroid plexus, CP）上皮细胞构成了血液-脑脊液屏障（blood-cerebrospinal fluid barrier, BCSFB）。BCSFB 的功能是将脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）与血液分隔开来，并将分子交换限制在最低程度。 体外 基于人脉络丛乳头状瘤（HIBCPP）细胞构建的BCSFB模型。HIBCPP细胞表现出典型的屏障功能，包括紧密连接（TJs）的形成、跨上皮电阻（TEER）的建立，以及对大分子物质具有较低的通透性。已有多种病原体被证实可通过BCSFB进入中枢神经系统（CNS），进而引发脑膜炎等严重疾病。其中一种病原体是 脑膜炎奈瑟菌 (N. meningitidis），一种人类特异性细菌。采用HIBCPP细胞并结合倒置细胞培养滤膜插入系统，可研究病原体从脉络丛上皮细胞基底外侧与血-脑脊液屏障（BCSFB）细胞的相互作用，该方法具有相关性 体内在本文中，我们描述了在细胞培养小室上接种和培养HIBCPP细胞的方法。此外，还介绍了细胞感染的步骤 N. meningitidis 通过双重免疫荧光分析侵袭和黏附细菌的方法也已展示。由于脉络丛细胞还参与其他多种疾病，包括阿尔茨海默病和多发性硬化等神经退行性疾病，以及肿瘤细胞的脑转移过程，该模型系统也可应用于其他研究领域。该系统具有解析分子机制和鉴定新型治疗靶点的潜力。
引言
血液-脑脊液屏障（BCSFB）是血液与大脑之间的三个屏障位点之一1。其形态学基础是脉络丛（CP）的上皮细胞2,3，这是一种高度血管化的内皮-上皮结构，位于脑室中。脉络丛的功能是生成脑脊液（CSF），并将其与血液分隔开来。为了实现屏障功能，脉络丛上皮细胞表现出较低的胞饮活性，表达特定的转运蛋白，并通过连续的紧密连接（TJs）网络紧密相连2,3。
人源脉络丛乳头状瘤（HIBCPP）细胞，源自一名日本女性的恶性脉络丛乳头状瘤4，用于构建一个功能性 体外 BCSFB 的模型。HIBCPP 细胞表现出多种功能性 BCSFB 的特征，如紧密连接（TJ）丝的形成、可表现为跨上皮电阻（TEER）的高跨上皮膜电位的建立，以及对大分子具有较低的通透性。此外，HIBCPP 细胞表达特征性转运蛋白，可能参与调控离子微环境，并呈现顶端/基底侧极性。5,6,7.
血脑脊液屏障（BCSFB）已被证实可作为病原体（细菌、病毒和真菌）进入中枢神经系统（CNS）的门户8病原体的侵入，包括 脑膜炎奈瑟菌 (N. meningitidis），一种革兰氏阴性菌，可引起脑膜炎等严重疾病。 有证据表明，该病原体可突破脉络丛（CP）的保护性上皮屏障，此观点得到了脑膜炎球菌病患者组织病理学观察的支持，这些患者脑膜炎球菌在血管及脉络丛上皮细胞中的数量明显增加。9,10细菌为了侵入宿主细胞，常会劫持由宿主细胞表面特定受体介导或触发的内吞作用机制。由于病原体与这些受体的相互作用可能具有物种特异性11，动物模型的参考作用仅限于一定程度。HIBCPP细胞系为人源模型系统中研究病原入侵过程及其潜在分子机制提供了机会。利用细胞培养小室可使我们从两个不同的细胞侧面分析病原体与宿主细胞之间的相互作用。许多细菌，包括 N. meningitidis，感染实验过程中极易受到重力影响。为在实验期间实现病原体与HIBCPP细胞的最佳相互作用，需将细菌首先加入细胞培养滤膜插件系统的上室。为分别实现从细胞顶侧或基底侧感染，本实验采用两种不同的体外模型变体 体外系统 已建立标准体系：在标准系统中，将HIBCPP细胞接种至滤插上室，模拟微生物位于脑脊液侧并与细胞顶面接触的情况（图1A，C）。相比之下，使用HIBCPP细胞的倒置细胞培养滤膜插入系统可模拟细菌进入血液后的环境。微生物在血液中扩散，并从基底侧接触脉络丛上皮细胞（图1B，D值得注意的是，在该模型系统中已证明，细菌以极性方式侵入HIBCPP细胞，且 specifically 从细胞的基底外侧侵入5,7.
脉络丛（CP）感染后，入侵的病原体可通过与模式识别受体（PRRs）结合而被先天免疫系统识别。PRRs 中研究较为清楚的成员属于 Toll 样受体（TLR）家族。TLRs 能够结合感染性微生物的特征性结构，这些结构被称为病原体相关分子模式（PAMPs）。受体结合后可激活宿主细胞内的信号级联反应，进而触发细胞因子和趋化因子的表达12，后者进一步促进免疫细胞穿过脑脊液-血液屏障（BCSFB）13,14。已有研究表明，HIBCPP 细胞在 mRNA 水平表达多种 TLRs，且感染 N. meningitidis 后可分泌多种细胞因子和趋化因子，包括 CXCL1-3、IL6、IL8 和 TNFα15,16。
在此，我们描述了在模拟血-脑脊液屏障（BCSFB）的倒置细胞培养小室系统中培养人源HIBCPP细胞系并进行感染的方法。该模型系统可用于研究病原体与 体内 相关的基底外侧细胞面以及随后的细胞反应。
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方案
1. 准备细胞培养滤插件，用于在倒置模型系统中接种 HIBCPP 细胞
- 预先将添加了 5 µg/ml 胰岛素、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素和 10% 胎牛血清（FCS）的 DMEM/F12（Ham）培养基预热。
- 使用无菌镊子将孔径为 3 µm、生长面积为 0.33 cm² 的细胞培养滤插件倒置放入 12 孔板中（图 1E）。
- 向细胞培养滤插件的下室加入约 3 ml 培养基，并在滤插件上方加入 100 µl 培养基。用培养基浸润整个孔板及下室，然后吸除多余培养基，确保滤插件的下室始终保持充满状态（图 1E）。
注意：建议使用移液管进行此操作。 - 盖上 12 孔板盖子，将准备好的细胞培养滤插件转移至培养箱中，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育，直至接种细胞。
2. HIBCPP 细胞的培养与传代
- 准备添加了5 µg/ml胰岛素、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和10%胎牛血清的DMEM/F12（Ham）培养基。
- 将培养基和PBS在37 °C水浴中预热。吸除培养瓶中的培养基，加入10 ml PBS并轻轻摇晃。重复此步骤一次。
- 向培养瓶中加入3 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，并轻轻摇匀。将培养瓶放入37 °C、5% CO2的培养箱中孵育。
- 约20分钟后，从培养箱中取出培养瓶。在显微镜下观察，确保细胞已从瓶底脱落并呈圆形。
注意：细胞之间不会完全分离，常以团块形式存在。建议使用传代次数不超过38代的细胞。 - 加入17 ml培养基以终止消化作用。通过移液吹打使细胞重悬，并将细胞悬液转移至50 ml离心管中。在室温下以50 × g离心10分钟。
- 用适量培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
注意：重悬后的HIBCPP细胞浓度应为1 × 106 个细胞/ml。为维持HIBCPP细胞生长，建议将1–6 × 106 个细胞接种于10 ml培养基中，接种至T75培养瓶。每两天更换一次培养基。
3. 使用 HIBCPP 细胞接种倒置细胞培养滤膜插件
- 倒置滤器插件的顶部即 滤膜的底侧加入80 µl细胞悬液（即. 8 × 104 细胞）（图1E).
注意：接种前通过倒置试管确保细胞在悬液中均匀分布。 - 将接种细胞的培养滤插片盖上12孔板盖子，转移至37 °C、5% CO₂培养箱中培养2.
- 第一天，向24孔板的各孔中加入1 ml培养基。用镊子将细胞培养滤插从12孔板中取出，弃去滤插内的培养基，翻转滤插后将其以标准方向放入已准备好的24孔板中（图1E).
- 每隔两天将细胞更换至新鲜培养基中。用新鲜培养基准备24孔板，并将滤插膜转移至其中。向滤插膜内加入0.5 ml新鲜培养基。按照第4节所述方法每天检测TEER。
- 当接种于细胞培养小室的HIBCPP细胞的TEER值超过70 Ω×cm²（接种后约4天），继续在含有1% FCS和5 µg/ml胰岛素的培养基中培养细胞。准备24孔板，每孔加入1 ml培养基。将滤膜小室转移至预先准备好的孔板中，并更换上室培养基。
注意：汇合后血清剥夺可导致膜电位升高。 - 从滤室中吸出培养基，转移至已准备好的孔中，并加入500 µl培养基。重复此步骤一次。将细胞放入培养箱中过夜，37 °C，5% CO₂2.
4. 跨上皮电阻（TEER）的测量
- 将上皮组织伏特计的电极尖端浸入80%乙醇中15分钟。将伏特计转移至生物安全柜中，使电极短暂晾干。随后将电极放入所用细胞的相应培养基中再平衡15分钟。
- 测量时，将电极的长臂始终接触下室底部，短臂放入滤膜插件室中。
注意：无细胞的细胞培养滤膜插件在培养基中的电阻值应作为空白值（（测量值 (Ω) – 空白值 (Ω)）× 滤膜表面积（即 0.33 cm²））。 - 测量完成后，将电极重新放入80%乙醇中浸泡15分钟，随后储存于干燥试管中。
5. 细胞旁通透性的测定
- 将1 g FITC-菊粉溶解于200 ml含5 µg/ml胰岛素和1% FCS的培养基中。在细胞感染前，向滤膜上室加入50 µg/ml该溶液。
- 感染后，从下室收集培养基样品，以测定有多少菊粉从滤膜室透过细胞层。
- 配制FITC-菊粉标准溶液，并进行10次1:2倍比稀释（100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.13%、1.56%、0.78%、0.39%、0.2%和0%）。使用微孔板读数仪测定所有样品的荧光强度。
6. 用于感染细胞培养滤膜插件上 HIBCPP 细胞的细菌制备
- 实验前一天，从甘油保存管中刮取冻存的N. meningitidis菌株，并划线接种于含Vitox的巧克力琼脂平板上。将平板置于37 °C、5% CO2的培养箱中过夜培养。
- 从过夜培养物中挑取20–30个菌落，转移至含有8 ml蛋白胨培养基（补充0.042% NaHCO3、0.01 M MgCl2和1% Polyvitex）的试管中。
- 将细菌在37 °C、220 rpm条件下振荡培养1.25小时。于室温下以2,684 g离心10分钟收集菌体。弃去上清液，用8 ml无血清培养基重悬菌体沉淀，并涡旋振荡以确保悬液均匀。
- 为测定培养物密度，将菌液稀释10倍后测定600 nm处的光密度（OD）。将细菌悬液调整至OD600为0.1。
注意：此悬液的细菌浓度约为1 × 108 CFU/ml。 - 为确认细菌细胞浓度，将菌悬液进行连续10倍梯度稀释（1:10），直至稀释至10-5，然后涂布于巧克力琼脂平板上。
注意：计算细菌生长曲线时也需进行类似的系列稀释。
7. 利用细胞培养滤膜插件感染HIBCPP细胞及通过双重免疫荧光法测定细菌侵袭
- 在含有1% FCS和5 µg/ml胰岛素的培养基中继续培养细胞后，每天使用上皮组织伏特-欧姆计测量细胞。当细胞达到约500 Ω × cm²的TEER值时，进行感染实验。
- 以感染复数（MOI）为10的浓度，用制备好的细菌悬液感染细胞。将感染后的细胞置于37 °C、含5% CO2的培养箱中孵育指定时间。
注意：MOI的计算需考虑细胞培养滤膜插件在汇合状态下的细胞数量（1.21 × 106 个细胞/cm2）。 - 用500 µl含有1%牛血清白蛋白（BSA）的无血清培养基（SFM）清洗滤膜腔室三次，每次同时向底层腔室加入1 ml上述溶液，以终止感染。
- 在滤膜腔室中加入500 µl含有1% BSA的SFM缓冲液，在底层腔室中加入1 ml，室温孵育20分钟，以阻断抗体与非特异性结合位点的结合。
- 在滤膜腔室中加入100 µl一抗（抗N. meningitidis α-OMP，稀释比例1:200），在底层腔室中加入500 µl，室温孵育20分钟。
注意：如有需要，应对抗体浓度进行滴定。 - 吸除滤膜腔室中的液体，将滤膜插件转移至预先加入1 ml含1% BSA的SFM的孔中，并向空的滤膜腔室加入500 µl含1% BSA的SFM，清洗细胞。重复该步骤两次。
- 在滤膜腔室中加入500 µl 4%甲醛，在底层腔室中加入1 ml，室温固定10分钟。
- 吸除滤膜腔室中的液体，将滤膜插件转移至预先加入1 ml PBS的孔中，并向空的滤膜腔室加入500 µl PBS，清洗细胞。重复该步骤一次。
注意：样品可在4 °C的PBS中保存过夜。 - 将固定后的细胞培养滤膜从插件中切下，用250 µl含1% BSA的PBS清洗。室温下用250 µl荧光标记的二抗（激发波长594 nm）鸡抗兔抗体（稀释比例1:500）孵育15分钟，以标记胞外细菌。
注意：如有需要，应对抗体浓度进行滴定。 - 用250 µl含1% BSA和0.5% Triton X-100的PBS处理细胞，室温透化1小时。随后用250 µl含1% BSA的PBS清洗细胞三次。
- 加入250 µl一抗（抗N. meningitidis α-OMP，稀释比例1:200），室温孵育30分钟，以标记胞外和胞内细菌。再用250 µl含1% BSA的PBS清洗细胞三次。
- 加入250 µl荧光标记的二抗（激发波长488 nm，稀释比例1:500）、荧光标记的鬼笔环肽Phalloidin（激发波长660 nm，稀释比例1:250）以及4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI，稀释比例1:50,000），室温孵育1小时，用于标记胞外和胞内细菌、肌动蛋白细胞骨架及细胞核。
注意：如有需要，应对抗体浓度进行滴定。 - 用250 µl含1% BSA的PBS清洗细胞三次。将滤膜置于封片剂中封片，并于4 °C保存，待显微镜观察。
- 统计每个预设视野内的侵入细菌数量。每张滤膜计数20个视野，计算侵入细菌的百分比。
注意：将20个显微视野的平均细菌数乘以面积校正系数，所得结果表示0.33 cm²细胞培养滤膜插件中细菌的总数。将该数值除以感染期间在培养基中生长的细菌总量，即可得到侵入率。
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结果
本文描述了在倒置细胞培养小室系统中培养和感染 HIBCPP 细胞的方法。该模型使我们能够从细胞基底侧研究细菌侵袭机制及其潜在的分子信号通路，从而模拟细菌通过血液传播并由此进入上皮细胞的生理状态（图 1）。
HIBCPP 细胞表现出一定的屏障功能，能够将分子交换限制在最低水平。这种功能通过表达黏附连接（AJ）和紧密连接（TJ）蛋白来实现。对与紧密连接相关的蛋白 Occludin、Claudin 和 ZO-1 进行免疫荧光分析，结果显示在细胞-细胞接触部位存在连续的信号，表明这些细胞通过连续的紧密连接丝状结构相互连接（图 2A、B、C）。通过透射电子显微镜（图 2D）和冰冻断裂电镜（图 2E）获得了紧密连接形态的详细图像，结果显示紧密连接位于细胞之间，并形成宽广、网状的缆状结构。
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讨论
脉络丛的上皮细胞形成血-脑脊液屏障（BCSFB），将脑脊液与血液分隔开来2,3我们近期建立了HIBCPP细胞系，作为一种功能性的人源BCSFB模型。该细胞系表现出BCSFB的重要屏障功能 体外包括形成较高的膜电位、对大分子具有低通透性，以及紧密连接（TJs）呈现连续条索状结构5紧密连接蛋白有助于细胞的顶端/基底侧极性。这种极性对于表面受体以及特定转运蛋白的定向定位具有重要意义。我们已证实Ecad和Met受体以及ATP结合盒（ABC）转运蛋白家族成员在细胞中呈极性分布，后者在中枢神经系统内维持高度受控的微环境。6,7.
有多种微生物能够突破血脑脊液屏障（BCSFB）进入中枢神经系统，导致包括脑膜炎在内的严重疾病8一种能够侵入脉络丛上皮细胞的病原体是人类特异的革兰氏阴性细菌 N. meningitidis9,10，已证明该物质以极性方式进入HIBCPP细胞，且特异性地从细胞的基底外侧进入5。这模拟了细菌在脑膜炎病程中经血...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Hartwig Wolburg 教授完成了透射电子显微镜实验。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Life Technologies | D1306 | |
| 12孔板 | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24孔板 | Starlab | CC7682-7524 | |
| 抗脑膜炎奈瑟菌 α-OMP | 该抗体由H. Claus博士和U. Vogel博士（威斯巴登大学）惠赠ü德国吕贝克 | ||
| Alexa Fluor 488（鸡抗兔） | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594（鸡抗兔） | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Calbiochem | 12659 | |
| 巧克力琼脂平板 | 生物梅里埃 | 43109 | |
| 细胞松弛素D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-谷氨酰胺 + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-谷氨酰胺 + 15 mM HEPES，不含酚红 | Gibco | 11039-047 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma | D2650 | |
| 胎牛血清（FCS） | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-菊粉 | Sigma | F3272 | |
| 胰岛素 | Sigma | 19278 | |
| MgCl₂2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO₃3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| 青霉素/链霉素 | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | 生物梅里埃 | 55651 | |
| 蛋白胨 | BD | 211684 | |
| 无血清培养基 | Gibco | 10902-096 | |
| 用于24孔板的Thincert细胞培养小室，孔径3 µm | 格雷纳 | 662630 | |
| 75 cm 组织培养瓶² 红色帽盖无菌装 | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 伏欧表 Millicell-ERS2 配 MERSSTX01 电极 | Millipore | MERSSTX00 |
参考文献
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