方法文章

人体血液，脑脊液屏障的脉络丛上皮基于Cell的产品型号从基底外侧面研究细菌感染

DOI：

10.3791/54061

⸱

2016年5月6日

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1Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2Department of NDU Life Sciences, Nippon Dental University

本文内容

摘要

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脉络丛 （CP） 的上皮细胞形成血脑脊液屏障 （BCSFB）。BCSFB 的体外模型采用人脉络丛瘤 （HIBCPP） 细胞。本文介绍了使用细胞培养滤器插件系统对 HIBCPP 细胞进行培养和基底外侧感染。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

位于脑室系统中的脉络丛 （CP） 的上皮细胞形成血脑脊液屏障 （BCSFB）。BCSFB 的作用是将脑脊液 （CSF） 与血液分离，并将分子交换限制在最小程度上。BCSFB 的体外模型基于源自人脉络丛瘤 （HIBCPP） 的细胞。HIBCPP 细胞显示出典型的屏障功能，包括形成紧密连接 （TJ）、产生跨上皮电阻 （TEER） 以及大分子的轻微渗透性。有几种病原体可以通过 BCSFB 进入中枢神经系统 （CNS），随后引起脑膜炎等严重疾病。其中一种病原体是脑膜炎奈瑟菌（N. meningitidis），一种人类特异性细菌。在倒置细胞培养滤器插入系统中使用 HIBCPP 细胞能够从基底外侧细胞侧研究病原体与 BCSFB 细胞的相互作用，这在体内是相关的。在本文中，我们描述了 HIBCPP 细胞在细胞培养插入物上的接种和培养。此外，证明了细胞感染脑膜炎奈瑟菌以及通过双重免疫荧光分析侵袭和粘附的细菌。由于 CP 的细胞还参与其他疾病，包括阿尔茨海默病和多发性硬化症等神经退行性疾病，以及肿瘤细胞的脑转移，因此该模型系统也可以应用于其他研究领域。它为破译分子机制和确定新的治疗靶点提供了潜力。

引言

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血-脑脊髓液屏障（BCSFB）是血液和脑1之间三个屏障站点之一。其形态相关成分是脉络丛（CP）2,3-上皮细胞，内皮上皮回旋，这强烈血管和位于脑的脑室。将CP用来产生脑脊液（CSF），以及后者从血液中分离出来。为了实现屏障功能，在CP的上皮细胞显示出低的吞饮活性，表达特定转运，并且通过紧密连接（紧密连接）2,3-的连续网络密集连接。

人类脉络丛乳头状瘤（HIBCPP）细胞，从日本女子4的恶性脉络丛乳头状瘤衍生的，用于构建在 BCSFB的体外模型的功能。 HIBCPP细胞显示一对夫妇的功能BCSFB的特点，为TJ形成股线，可以判断为跨上皮电阻（TEER）高跨上皮膜电位的发展，以及对大分子次要渗透率。此外，HIBCPP细胞表达的特点转运，这可能会起到调节离子微环境，并显示心尖/基底极性5,6,7。

该BCSFB已显示作为一个条目的网站的病原体（细菌，病毒和真菌）进入中枢神经系统（CNS）8。病原体，包括脑膜炎奈瑟氏球菌 （ 脑膜炎奈瑟氏球菌 ），一种革兰氏阴性细菌，入侵能引起严重的疾病如脑膜炎。 证据表明，它克服了CP的保护上皮屏障是由组织病理学观察患者支持与脑膜炎球菌性疾病表现出增加的血管和CP上皮细胞....

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方案

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1.准备播种HIBCPP细胞细胞培养滤芯在倒立模型系统

  1. 补充有5微克/毫升胰岛素预暖的DMEM / F12（HAM），100U / ml青霉素，100微克/毫升链霉素和10％胎牛血清（FCS）。
  2. 使用无菌镊子放置0.33平方厘米的生长区域的细胞培养滤芯为3微米的孔尺寸倒置放入一个12孔板（ 图1E）。
  3. 填充介质进入细胞培养滤芯的下部隔室（约3毫升）和100微升在过滤器插入件的顶端。淹没板以及与介质的下隔室。吸在这样一种方式，滤波器插入件的下隔室保持填充（ 图1E）的过度介质。
    注:建议使用血清吸管用于此步骤。
  4. 盖上盖12孔板和制备的细胞培养滤芯转移到孵化器，37℃，5％的CO 2，直到加入细胞。

2.栽培HIBCPP细胞传代

  1. 制备补充有5微克/毫升，100U / ml青霉素，100微克/毫升链霉素和10％FCS的DMEM / F12（HAM）。
  2. 预暖介质和PBS在37℃水浴中。从瓶中吸出网上平台。加入10毫升的PBS至烧瓶并乱舞。重复此步骤一次。
  3. 添加3毫升0.25％胰蛋白酶-EDTA至烧瓶并乱舞。放入培养箱，在37℃，5％的CO 2。
  4. 大约20分钟后，除去从孵化器的烧瓶中。确保细胞从烧瓶底部脱离....

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结果

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在这里，我们描述了一个倒置的细胞培养插管系统培养和HIBCPP细胞的感染。此模型使我们能够研究入侵机制和潜在的分子信号传导通路从基底细胞侧，再现细菌传播并且经由血液流进入上皮细胞（ 图1）的生理状况。

该HIBCPP细胞显示一定的屏障功能，这使他们能够限制分子交换到最低水平。这是通过粘附连接（AJ）和紧密连接（TJ）蛋白质的表达来实现。的TJ相关蛋白Occludin蛋白，紧密连接蛋白和ZO-1的免疫荧光分析在细胞-细胞接触的部位显示一个不间断信号，表明细胞通过紧密连接的连续股线（ 图2A，B，C）相互连接。 t作为详细的印象他TJ形态已被传输（ 图2D）中获得，并冷冻断裂电子显微术（ 图2E），这表明紧密连接位于小区之间并形成宽，啮合电缆状结构。

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讨论

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CP的上皮细胞形成分隔从血液2,3脑脊液的BCSFB。我们最近成立了HIBCPP细胞系作为BCSFB的功能人体模型。细胞显示在体外 BCSFB的重要屏障功能，包括一个高的膜电位的发展，一个低渗透性的大分子，以及紧密连接5的连续股线的存在。的TJ蛋白向细胞的顶/底外侧极性。极性是表面受体的定向定位特定的转运蛋白高的重要性，以及。我们已经证明了受体ECAD和Met以及ATP结合盒的部件（ABC）转运蛋白家族的极性本地化维持在CNS 6,7内的高度控制的微环境。

有几种微生物能够通过克服BCSFB获得进入中枢神经系统，导入区克至严重 ​​的疾病，包括脑膜炎8。之一是能够侵入的CP上皮细胞的病原体是人类特有的革兰氏阴性细菌N.球菌 9,10，这已被证明是在极性的方式专门从基底细胞侧5输入HIBCPP细胞。这是为横跨BCSFB脑感染的生理相关方向时细菌性脑膜炎的过程中散发和遭遇的CP上皮细胞从血液中。为了反映在体外<.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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作者感谢 Hartwig Wolburg 教授进行电子显微镜检查。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco25200-056
4&急性;，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI）Life TechnologiesD1306
12 孔板StarlabCC7682-7512
24 孔板StarlabCC7682-7524
抗脑膜炎奈瑟菌 &α;-OMP这种抗体是 H. Claus 和 U. Vogel 博士（Wü 大学;德国 rzburg）
Alexa Fluor 488（鸡抗兔）InvitrogenA21441
Alexa Fluor 594（鸡抗兔）InvitrogenA21442
Alexa Fluor 660 鬼笔环肽InvitrogenA22285
牛血清白蛋白 （BSA）Calbiochem12659
巧克力琼脂板Biomerieux43109
细胞松弛素 DSigmaC8273
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPESGibco31330-095
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES（不含酚红Gibco11039-047
二甲基亚砜SigmaD2650
胎牛血清 （FCS）Life Technologies10270106
FITC-菊粉SigmaF3272
胰岛素Sigma19278
MgCl2Sigma2393
NaHCO3Sigma55761
PBS + Mg + CaGibco14040-174
青霉素/链霉素MP 生物医学1670049
PolyvitexBiomerieux55651
蛋白胨BD211684
无血清培养基Gibco10902-096
用于 24 孔板的 Thincert 细胞培养小室，孔径 3 和微量;mGreiner662630
组织培养瓶 75 cm²红色瓶盖无菌Greiner658175
Triton X-100SigmaT8787
伏特欧姆表 Millicell-ERS2，带MERSSTX01电极MilliporeMERSSTX00
）

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).
  2. Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
  3. Engelhardt, B., So....

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FITC ZO 1 Occludin Claudin

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