人体血液，脑脊液屏障的脉络丛上皮基于Cell的产品型号从基底外侧面研究细菌感染

摘要

脉络丛 （CP） 的上皮细胞形成血脑脊液屏障 （BCSFB）。BCSFB 的体外模型采用人脉络丛瘤 （HIBCPP） 细胞。本文介绍了使用细胞培养滤器插件系统对 HIBCPP 细胞进行培养和基底外侧感染。

摘要

位于脑室系统中的脉络丛 （CP） 的上皮细胞形成血脑脊液屏障 （BCSFB）。BCSFB 的作用是将脑脊液 （CSF） 与血液分离，并将分子交换限制在最小程度上。BCSFB 的体外模型基于源自人脉络丛瘤 （HIBCPP） 的细胞。HIBCPP 细胞显示出典型的屏障功能，包括形成紧密连接 （TJ）、产生跨上皮电阻 （TEER） 以及大分子的轻微渗透性。有几种病原体可以通过 BCSFB 进入中枢神经系统 （CNS），随后引起脑膜炎等严重疾病。其中一种病原体是脑膜炎奈瑟菌（N. meningitidis），一种人类特异性细菌。在倒置细胞培养滤器插入系统中使用 HIBCPP 细胞能够从基底外侧细胞侧研究病原体与 BCSFB 细胞的相互作用，这在体内是相关的。在本文中，我们描述了 HIBCPP 细胞在细胞培养插入物上的接种和培养。此外，证明了细胞感染脑膜炎奈瑟菌以及通过双重免疫荧光分析侵袭和粘附的细菌。由于 CP 的细胞还参与其他疾病，包括阿尔茨海默病和多发性硬化症等神经退行性疾病，以及肿瘤细胞的脑转移，因此该模型系统也可以应用于其他研究领域。它为破译分子机制和确定新的治疗靶点提供了潜力。

引言

血-脑脊髓液屏障（BCSFB）是血液和脑¹之间三个屏障站点之一。其形态相关成分是脉络丛^（CP）2,3-上皮细胞，内皮上皮回旋，这强烈血管和位于脑的脑室。将CP用来产生脑脊液（CSF），以及后者从血液中分离出来。为了实现屏障功能，在CP的上皮细胞显示出低的吞饮活性，表达特定转运，并且通过紧密连接（紧密连接^）2,3-的连续网络密集连接。

人类脉络丛乳头状瘤（HIBCPP）细胞，从日本女子⁴的恶性脉络丛乳头状瘤衍生的，用于构建在 BCSFB的体外模型的功能。 HIBCPP细胞显示一对夫妇的功能BCSFB的特点，为TJ形成股线，可以判断为跨上皮电阻（TEER）高跨上皮膜电位的发展，以及对大分子次要渗透率。此外，HIBCPP细胞表达的特点转运，这可能会起到调节离子微环境，并显示心尖/基底极性^5,6,7。

该BCSFB已显示作为一个条目的网站的病原体（细菌，病毒和真菌）进入中枢神经系统^{（CNS）8。}病原体，包括脑膜炎奈瑟氏球菌 （ 脑膜炎奈瑟氏球菌 ），一种革兰氏阴性细菌，入侵能引起严重的疾病如脑膜炎。 证据表明，它克服了CP的保护上皮屏障是由组织病理学观察患者支持与脑膜炎球菌性疾病表现出增加的血管和CP上皮细胞^9,10-脑膜炎球菌的量。要进入宿主细胞巴cteria经常挟持内吞机制，其介导或由位于宿主细胞特异性表面受体触发。由于具有这些受体的病原体的相互作用可以是物种特异性^11，动物模型只能协商，以一个受限制的程度。该HIBCPP细胞系提供了机会，研究入侵过程中，以及在人体模型系统的分子机制。采用细胞培养插入使我们能够分析病原体相互作用与宿主细胞从两个不同的细胞两侧。许多细菌，包括N。脑膜炎 ，强烈受重力的期间感染测定法的影响。对于与检测期间HIBCPP细胞病原体最佳交互，该细菌最初添加到细胞培养滤芯系统的上隔室。到从心尖或基底细胞侧，分别在体外系统的两种变化已经埃斯塔使感染blished:在标准系统HIBCPP细胞接种到过滤器插入件的上部隔室，模仿情况时微生物位于CSF的侧，并获得与所述细胞（ 图1A，C）的顶面接触。与此相反，使用HIBCPP细胞在倒置的细胞培养滤芯系统反映当细菌进入血流的条件。微生物传播在从基底外侧侧（ 图1B，D）的血液和遭遇的CP上皮细胞。值得注意的是，在该模型系统，已经表明，细菌侵入HIBCPP细胞极性的方式专门从基底细胞侧^5,7。

随后向CP的感染，所述入侵病原体可通过结扎先天免疫系统对模式识别受体（的PRRs）识别。蓝耳的良好描述成员属于Toll样受体（TLR）家族。 Toll样受体能斌d，来感染性微生物的特性的结构，其被称为病原体相关分子模式（PAMP）。受体的结扎导致触发的细胞因子和趋化因子^12，其反过来横跨BCSFB ^13,14刺激免疫细胞的轮回的表达宿主细胞的活化信号级联。它已经显示HIBCPP细胞表达在mRNA水平数的TLR和感染N.脑膜炎导致多种细胞因子和趋化因子，包括CXCL1-3，IL6，IL8和^TNFα15,16的分泌。

在这里，我们描述了一个模仿BCSFB倒置细胞培养插管系统种植和人细胞系HIBCPP的感染。此模型系统使得来研究与体内的相关基底细胞侧以及随后的细胞反应的病原体的相互作用。

方案

1.准备播种HIBCPP细胞细胞培养滤芯在倒立模型系统

1. 补充有5微克/毫升胰岛素预暖的DMEM / F12（HAM），100U / ml青霉素，100微克/毫升链霉素和10％胎牛血清（FCS）。
2. 使用无菌镊子放置0.33平方厘米的生长区域的细胞培养滤芯为3微米的孔尺寸倒置放入一个12孔板（ 图1E）。
3. 填充介质进入细胞培养滤芯的下部隔室（约3毫升）和100微升在过滤器插入件的顶端。淹没板以及与介质的下隔室。吸在这样一种方式，滤波器插入件的下隔室保持填充（ 图1E）的过度介质。
   注:建议使用血清吸管用于此步骤。
4. 盖上盖12孔板和制备的细胞培养滤芯转移到孵化器，37℃，5％的CO _2，直到加入细胞。

2.栽培HIBCPP细胞传代

1. 制备补充有5微克/毫升，100U / ml青霉素，100微克/毫升链霉素和10％FCS的DMEM / F12（HAM）。
2. 预暖介质和PBS在37℃水浴中。从瓶中吸出网上平台。加入10毫升的PBS至烧瓶并乱舞。重复此步骤一次。
3. 添加3毫升0.25％胰蛋白酶-EDTA至烧瓶并乱舞。放入培养箱，在37℃，5％的CO _2。
4. 大约20分钟后，除去从孵化器的烧瓶中。确保细胞从烧瓶底部脱离，当用显微镜调查显示圆​​形。
   注意:细胞不彼此完全分离，并且经常在附聚物中。它建议使用细胞达通道38。
5. 要停止胰蛋白酶加入17β-毫升培养基。通过上下吹打重悬细胞并转移该悬浮液到50毫升管中。离心，在50×g离心在室温下10分钟。
6. 悬浮细胞培养基中的适当体积，并通过使用血球计数细胞。
   注意:悬浮HIBCPP细胞的浓度应为1×10 ^6个细胞/ ml。维护HIBCPP细胞，建议在10毫升培养基转移1-6×10 ⁶细胞的量到一个T75烧瓶。更换培养基每隔一天。

3.播种倒细胞培养滤芯与HIBCPP细胞

1. 每个反相滤波器插入件（ 即过滤器的底侧）的顶部添加80微升细胞悬浮液（ 即 ，8×10 ^4个细胞）（ 图1E）的。
   注意:确保细胞均匀地播种前颠倒试管分布于停牌。
2. 覆盖种子细胞培养滤芯与12孔板，并转移到孵化器的盖，在37℃，5％CO _2。
3. 在第一天，填充1ml培养基到24孔板的孔中。通过使用镊子出12孔板的解除细胞培养滤波器的插入，丢弃培养基内，转动过滤器插入并放置在标准定向到准备24孔板（ 图1E）。
4. 放置细胞进入新鲜培养基每隔一天。准备24井用新鲜的介质和滤芯转移到它。填用0.5ml新鲜培养基插入。检查TEER每天都在第4节。
5. 当在细胞培养插入HIBCPP接种细胞的TEER值超过70Ω点¯x平方厘米（约种植后4天），然后继续在含1％FCS和5微克/毫升胰岛素介质细胞培养物。准备24孔板用每孔1ml培养基。转移滤芯到准备好的井和交换介质上格。
   注:汇合后，此血清撤离导致的形成更高的膜电位。
6. 从过滤器吸车厢中，转移到准备好，用500微升培养基填充。重复此步骤一次。把细胞过夜进入培养箱，在37℃，5％的CO _2。

4.跨膜电阻的测量（TEER）

1. 沉浸上皮组织voltohmmeter的电极尖端为在80％乙醇15分钟。引擎盖下转移voltohmmeter，让电极干一会儿。放置电极到用于所述细胞另外15分钟以达到平衡各自的培养基。
2. 通过这样它每次触及下部隔室的底部的电极的较长臂定位执行测量，较短的臂放置到过滤器插入件隔室。
   注:细胞培养滤芯的电阻值，而不在介质中的细胞应作为空白值（（测量值（Ω） - 空白值（Ω））×滤波器表面（ 即 0.33平方厘米））。
3. 测量代替电极回80％乙醇15分钟后。存放在干燥管中。

5.测定细胞旁渗透性

1. 在补充有5微克/毫升胰岛素1％FCS的200毫升培养基溶解1g的FITC-菊粉。细胞的感染前应用50μg/ ml的溶液进入上部过滤器室的。
2. 感染后收集培养基样品从下面的井，以确定多从菊糖将过滤器如何穿过细胞层。
3. 制备的FITC菊粉标准溶液，并执行1:2稀释液，10倍（100％，50％，25％，12.5％，6.25％，3.13％，1.56％，0.78％，0.39％，0.2％和0％） 。在酶标仪所有样品的测量确定荧光。

6.细胞培养滤芯细菌的HIBCPP感染细胞的制备

1. 有一天，在实验前，刮Ť他冷冻N.株脑膜炎掀起了甘油的股票和连胜了与Vitox巧克力琼脂。在孵化生长过夜，在37℃下，用5％ _的 CO _2。
2. 从过夜培养提取20-30殖民地和转移到装有8毫升蛋白胨培养基中添加0.042％ _碳酸氢钠 ，0.01M的_氯化镁和1％Polyvitex管。
3. 摇细菌1.25小时，以220rpm，37℃。沉淀通过离心细菌在2684克在室温下10分钟。丢弃上清，悬浮用8ml无血清培养基中的细菌沉淀。涡流以确保均匀悬浮液。
4. 以确定培养物密度，在600nm的光密度（OD）测量的1:10的稀释液。调节细菌悬浮液的OD 0.1 _600。
   注:此悬浮液含有约。 1×10 ⁸ CFU / ml的。
5. 确认细菌细胞浓度，稀释该悬浮液逐步（1:10）到一个10 ^-5稀释和平板接种到巧克力琼脂平板上。
   注意:类似的系列稀释需要执行计算细菌生长曲线。

在双重免疫细胞培养滤芯和测定细菌侵入HIBCPP细胞感染7

1. 继续在含有1％FCS和5微克/毫升胰岛素培养基的细胞培养后，使用上皮组织voltohmmeter测量细胞的每一天。如果电池已经达到了大约500Ω点¯x平方厘米TEER，进行感染。
2. 感染与制备细菌悬浮液中的细胞在感染10商店感染的细胞在培养箱的（MOI）的多重性，在37℃，5％CO ₂的时间的指示的时间。
   注意:MOI可以通过考虑在合流（1.21×10 ^6个细胞/ cm ^2）每细胞培养滤芯细胞的数目来计算。
3. 停止侵染离子洗涤用500μl无血清培养基含有1％牛血清白蛋白（BSA）的三倍（SFM）施加到过滤器室，将1ml到下​​部隔室。
4. 用含有500微升的SFM 1％BSA缓冲液中的过滤器室和1ml在下部隔室20分钟，在室温下，以防止抗体的非特异性结合位点的粘附阻止。
5. 用100μl初级抗体抗N.孵育meningtidisα-OMP（1:200），在过滤器室和500微升在在室温下20分钟的下隔室。
   注意:如果需要，抗体浓度需要被滴定。
6. 通过吸从过滤室中的介质洗涤细胞，滤芯转移到含有1％BSA一个制备好用1ml SFM和填充用含有1％BSA的500μl的SFM的排空过滤隔室。重复此步骤两次。
7. 固定用500μl的4％甲醛中的细胞过滤器COMPArtment，将1ml在室温10分钟的下隔室。
8. 通过吸从过滤室中的介质洗涤细胞，滤芯转移到准备好用1ml PBS中并填充用500μlPBS中清空过滤隔室。重复此步骤一次。
   注:样品可以在4℃保存过夜于PBS中。
9. 切割固定细胞培养筛选出插入物，用含有1％BSA的250μl的PBS洗涤。孵育15分钟，细胞在室温下与标记的250微升荧光（激发波长594纳米）的第二抗体鸡抗兔（1:500）染色细胞外细菌。
   注意:如果需要，抗体浓度需要被滴定。
10. 透用含有1％BSA和0.5％的Triton X-100在室温下1小时，250微升PBS中的细胞。洗涤细胞三次用含有1％BSA的250μl的PBS中。
11. 用250微升一抗抗孵育N.脑膜炎 α-OMP（1:200），30分钟进行染色细胞内外的细菌。洗涤细胞三次用含有1％BSA的250μl的PBS中。
12. 应用荧光标记的（激发波长488纳米）的第二抗体（1:500）的250微升，荧光标记的（激发波长660纳米）鬼笔环肽（1:250）和4'-，6-二脒基-2-苯基二盐酸盐（DAPI）（ 1:50,000）在室温下1小时，染色细胞内外的细菌，肌动蛋白细胞骨架和细胞核。
    注意:如果需要，抗体浓度需要被滴定。
13. 洗涤细胞三次用含有1％BSA的250μl的PBS中。嵌入安装在4℃介质和存储，直到通过显微镜观察细胞。
14. 确定每个预定义字段入侵细菌的数量。通过计算每滤膜20场做到这一点。计算入侵细菌的百分比。
    注意:使用面积coeffic乘以20微观领域的平均细菌数ient。结果表示存在于0.33平方厘米的细胞培养滤芯总细菌的量。感染的持续时间期间除以在培养基中生长的细菌的量该值。

结果

在这里，我们描述了一个倒置的细胞培养插管系统培养和HIBCPP细胞的感染。此模型使我们能够研究入侵机制和潜在的分子信号传导通路从基底细胞侧，再现细菌传播并且经由血液流进入上皮细胞（ 图1）的生理状况。

该HIBCPP细胞显示一定的屏障功能，这使他们能够限制分子交换到最低水平。这是通过粘附连接（AJ）和紧密连接（TJ）蛋白质的表达来实现。的TJ相关蛋白Occludin蛋白，紧密连接蛋白和ZO-1的免疫荧光分析在细胞-细胞接触的部位显示一个不间断信号，表明细胞通过紧密连接的连续股线（ 图2A，B，C）相互连接。 t作为详细的印象他TJ形态已被传输（ 图2D）中获得，并冷冻断裂电子显微术（ 图2E），这表明紧密连接位于小区之间并形成宽，啮合电缆状结构。

讨论

CP的上皮细胞形成分隔从血液^2,3脑脊液的BCSFB。我们最近成立了HIBCPP细胞系作为BCSFB的功能人体模型。细胞显示在体外 BCSFB的重要屏障功能，包括一个高的膜电位的发展，一个低渗透性的大分子，以及紧密连接⁵的连续股线的存在。的TJ蛋白向细胞的顶/底外侧极性。极性是表面受体的定向定位特定的转运蛋白高的重要性，以及。我们已经证明了受体ECAD和Met以及ATP结合盒的部件（ABC）转运蛋白家族的极性本地化维持在CNS ^6,7内的高度控制的微环境。

有几种微生物能够通过克服BCSFB获得进入中枢神经系统，导入区克至严重 ​​的疾病，包括脑膜炎^8。之一是能够侵入的CP上皮细胞的病原体是人类特有的革兰氏阴性细菌N.球菌 ^9,10，这已被证明是在极性的方式专门从基底细胞侧⁵输入HIBCPP细胞。这是为横跨BCSFB脑感染的生理相关方向时细菌性脑膜炎的过程中散发和遭遇的CP上皮细胞从血液中。为了反映在体外<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-056
4&急性;，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI）	Life Technologies	D1306
12 孔板	Starlab	CC7682-7512
24 孔板	Starlab	CC7682-7524
抗脑膜炎奈瑟菌 &α;-OMP			这种抗体是 H. Claus 和 U. Vogel 博士（Wü 大学;德国 rzburg）
Alexa Fluor 488（鸡抗兔）	Invitrogen	A21441
Alexa Fluor 594（鸡抗兔）	Invitrogen	A21442
Alexa Fluor 660 鬼笔环肽	Invitrogen	A22285
牛血清白蛋白 （BSA）	Calbiochem	12659
巧克力琼脂板	Biomerieux	43109
细胞松弛素 D	Sigma	C8273
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES	Gibco	31330-095
DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES（不含酚红	Gibco	11039-047
二甲基亚砜	Sigma	D2650
胎牛血清 （FCS）	Life Technologies	10270106
FITC-菊粉	Sigma	F3272
胰岛素	Sigma	19278
MgCl2	Sigma	2393
NaHCO3	Sigma	55761
PBS + Mg + Ca	Gibco	14040-174
青霉素/链霉素	MP 生物医学	1670049
Polyvitex	Biomerieux	55651
蛋白胨	BD	211684
无血清培养基	Gibco	10902-096
用于 24 孔板的 Thincert 细胞培养小室，孔径 3 和微量;m	Greiner	662630
组织培养瓶 75 cm²红色瓶盖无菌	Greiner	658175
Triton X-100	Sigma	T8787
伏特欧姆表 Millicell-ERS2，带MERSSTX01电极	Millipore	MERSSTX00