脉络丛（CP）的上皮细胞构成了血液-脑脊液屏障（BCSFB）。 体外 利用人脉络丛乳头状瘤（HIBCPP）细胞构建血脑脊液屏障（BCSFB）模型。本文介绍了使用细胞培养滤膜插入系统对HIBCPP细胞进行培养及基底侧感染的方法。
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摘要
摘要
位于脑室系统中的脉络丛（choroid plexus, CP）上皮细胞构成了血液-脑脊液屏障（blood-cerebrospinal fluid barrier, BCSFB）。BCSFB 的功能是将脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）与血液分隔开来，并将分子交换限制在最低程度。 体外 基于人脉络丛乳头状瘤（HIBCPP）细胞构建的BCSFB模型。HIBCPP细胞表现出典型的屏障功能，包括紧密连接（TJs）的形成、跨上皮电阻（TEER）的建立，以及对大分子物质具有较低的通透性。已有多种病原体被证实可通过BCSFB进入中枢神经系统（CNS），进而引发脑膜炎等严重疾病。其中一种病原体是 脑膜炎奈瑟菌 (N. meningitidis），一种人类特异性细菌。采用HIBCPP细胞并结合倒置细胞培养滤膜插入系统，可研究病原体从脉络丛上皮细胞基底外侧与血-脑脊液屏障（BCSFB）细胞的相互作用，该方法具有相关性 体内在本文中，我们描述了在细胞培养小室上接种和培养HIBCPP细胞的方法。此外，还介绍了细胞感染的步骤 N. meningitidis 通过双重免疫荧光分析侵袭和黏附细菌的方法也已展示。由于脉络丛细胞还参与其他多种疾病，包括阿尔茨海默病和多发性硬化等神经退行性疾病，以及肿瘤细胞的脑转移过程，该模型系统也可应用于其他研究领域。该系统具有解析分子机制和鉴定新型治疗靶点的潜力。
引言
血液-脑脊液屏障（BCSFB）是血液与大脑之间的三个屏障位点之一1。其形态学基础是脉络丛（CP）的上皮细胞2,3，这是一种高度血管化的内皮-上皮结构，位于脑室中。脉络丛的功能是生成脑脊液（CSF），并将其与血液分隔开来。为了实现屏障功能，脉络丛上皮细胞表现出较低的胞饮活性，表达特定的转运蛋白，并通过连续的紧密连接（TJs）网络紧密相连2,3。
人源脉络丛乳头状瘤（HIBCPP）细胞，源自一名日本女性的恶性脉络丛乳头状瘤4，用于构建一个功能性 体外 BCSFB 的模型。HIBCPP 细胞表现出多种功能性 BCSFB 的特征，如紧密连接（TJ）丝的形成、可表现为跨上皮电阻（TEER）的高跨上皮膜电位的建立，以及对大分子具有较低的通透性。此外，HIBCPP 细胞表达特征性转运蛋白，可能参与调控离子微环境，并呈现顶端/基底侧极性。5,6,7.
血脑脊液屏障（BCSFB）已被证实可作为病原体（细菌、病毒和真菌）进入中枢神经系统（CNS）的门户8病原体的侵入，包括 脑膜炎奈瑟菌 (N. meningitidis），一种革兰氏阴性菌，可引起脑膜炎等严重疾病。 有证据表明，该病原体可突破脉络丛（CP）的保护性上皮屏障，此观点得到了脑膜炎....
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方案
1. 准备细胞培养滤插件，用于在倒置模型系统中接种 HIBCPP 细胞
- 预先将添加了 5 µg/ml 胰岛素、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素和 10% 胎牛血清（FCS）的 DMEM/F12（Ham）培养基预热。
- 使用无菌镊子将孔径为 3 µm、生长面积为 0.33 cm² 的细胞培养滤插件倒置放入 12 孔板中（图 1E）。
- 向细胞培养滤插件的下室加入约 3 ml 培养基，并在滤插件上方加入 100 µl 培养基。用培养基浸润整个孔板及下室，然后吸除多余培养基，确保滤插件的下室始终保持充满状态（图 1E）。
注意：建议使用移液管进行此操作。 - 盖上 12 孔板盖子，将准备好的细胞培养滤插件转移至培养箱中，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育，直至接种细胞。
2. HIBCPP 细胞的培养与传代
- 准备添加了5 µg/ml胰岛素、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和10%胎牛血清的DMEM/F12（Ham）培养基。
- 将培养基和PBS在37 °C水浴中预热。吸除培养瓶中的培养基，加入10 ml PBS并轻轻摇晃。重复此步骤一次。
- 向培养瓶中加入3 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA....
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结果
本文描述了在倒置细胞培养小室系统中培养和感染 HIBCPP 细胞的方法。该模型使我们能够从细胞基底侧研究细菌侵袭机制及其潜在的分子信号通路，从而模拟细菌通过血液传播并由此进入上皮细胞的生理状态（图 1）。
HIBCPP 细胞表现出一定的屏障功能，能够将分子交换限制在最低水平。这种功能通过表达黏附连接（AJ）和紧密连接（TJ）蛋白来实现。对与紧密连接相关的蛋白 Occludin、Claudin 和 ZO-1 进行免疫荧光分析，结果显示在细胞-细胞接触部位存在连续的信号，表明这些细胞通过连续的紧密连接丝状结构相互连接（图 2A、B、C）。通过透射电子显微镜（图 2D）和冰冻断裂电镜（图 2E）获得了紧密连接形态的详细图像，结果显示紧密连接位于细胞之间，并形成宽广、网状的缆状结构。
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讨论
脉络丛的上皮细胞形成血-脑脊液屏障（BCSFB），将脑脊液与血液分隔开来2,3我们近期建立了HIBCPP细胞系，作为一种功能性的人源BCSFB模型。该细胞系表现出BCSFB的重要屏障功能 体外包括形成较高的膜电位、对大分子具有低通透性，以及紧密连接（TJs）呈现连续条索状结构5紧密连接蛋白有助于细胞的顶端/基底侧极性。这种极性对于表面受体以及特定转运蛋白的定向定位具有重要意义。我们已证实Ecad和Met受体以及ATP结合盒（ABC）转运蛋白家族成员在细胞中呈极性分布，后者在中枢神经系统内维持高度受控的微环境。6,7.
有多种微生物能够突破血脑脊液屏障（BCSFB）进入中枢神经系统，导致包括脑膜炎在内的严重疾病8一种能够侵入脉络丛上皮细胞的病原体是人类特异的革兰氏阴性细菌 N. meningitidis9,10，已证明该物质以极性方式进入HIBCPP细胞，且特异性地从细胞的基底外侧进入5。这模拟了细菌在脑膜炎病程中经血.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Hartwig Wolburg 教授完成了透射电子显微镜实验。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 4´6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Life Technologies | D1306 | |
| 12孔板 | Starlab | CC7682-7512 | |
| 24孔板 | Starlab | CC7682-7524 | |
| 抗脑膜炎奈瑟菌 α-OMP | 该抗体由H. Claus博士和U. Vogel博士（威斯巴登大学）惠赠ü德国吕贝克 | ||
| Alexa Fluor 488（鸡抗兔） | Invitrogen | A21441 | |
| Alexa Fluor 594（鸡抗兔） | Invitrogen | A21442 | |
| Alexa Fluor 660 Phalloidin | Invitrogen | A22285 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Calbiochem | 12659 | |
| 巧克力琼脂平板 | 生物梅里埃 | 43109 | |
| 细胞松弛素D | Sigma | C8273 | |
| DMEM/F12 + L-谷氨酰胺 + 15 mM HEPES | Gibco | 31330-095 | |
| DMEM/F12 + L-谷氨酰胺 + 15 mM HEPES，不含酚红 | Gibco | 11039-047 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma | D2650 | |
| 胎牛血清（FCS） | Life Technologies | 10270106 | |
| FITC-菊粉 | Sigma | F3272 | |
| 胰岛素 | Sigma | 19278 | |
| MgCl₂2 | Sigma | 2393 | |
| NaHCO₃3 | Sigma | 55761 | |
| PBS + Mg + Ca | Gibco | 14040-174 | |
| 青霉素/链霉素 | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Polyvitex | 生物梅里埃 | 55651 | |
| 蛋白胨 | BD | 211684 | |
| 无血清培养基 | Gibco | 10902-096 | |
| 用于24孔板的Thincert细胞培养小室，孔径3 µm | 格雷纳 | 662630 | |
| 75 cm 组织培养瓶² 红色帽盖无菌装 | Greiner | 658175 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 伏欧表 Millicell-ERS2 配 MERSSTX01 电极 | Millipore | MERSSTX00 |
参考文献
- Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).
- Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).
- Engelhardt, B., So....
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