本视频演示了一种利用密度梯度法富集胸腺上皮细胞（TECs）并进行FACS分离的实验方案。同时展示了使用EAK16-II/EAKIIH6多肽促进TEC细胞聚集体形成的步骤。EAK16-II/EAKIIH6水凝胶的微环境可提供维持TEC存活与功能所必需的三维结构。
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本文内容
摘要
摘要
胸腺退化与衰老或病理性损伤相关，会导致成熟T细胞的输出减少。恢复功能衰退的胸腺对于维持有效的T细胞介导的获得性免疫应答以对抗入侵病原体至关重要。然而，胸腺再生和功能重建一直具有挑战性，主要原因是难以重建胸腺基质独特的三维微环境，而这种微环境对胸腺上皮细胞（TECs）的存活和功能至关重要。我们开发了一种新型水凝胶系统，利用两亲性寡肽EAK16-II及其组氨酸化类似物EAKIIH6的自组装特性，促进TEC细胞聚集体的形成。TEC从分离的胸腺细胞中通过密度梯度法富集，经荧光激活细胞分选（FACS）纯化，并使用锚定在蛋白A/G衔接复合物上的抗上皮细胞黏附分子（EpCAM）抗体和抗His IgG进行标记。通过将TEC与EAKIIH6和EAK16-II寡肽共孵育，随后提高培养基离子浓度以启动凝胶化过程，从而促进细胞聚集体的形成。当将嵌入EAK水凝胶中的TEC聚集体移植至无胸腺裸鼠体内时，可有效促进功能性T细胞的发育in vivo。
引言
胸腺是主要的淋巴器官，负责生成多样化的、可识别病原体且对自身抗原耐受的T细胞群体，这对获得性免疫系统的功能至关重要。胸腺是一个动态器官，其中由骨髓迁移而来的淋巴祖细胞——即胸腺细胞——穿过类似海绵状的三维（3-D）胸腺基质结构，经历谱系特化与分化，最终以成熟T细胞的形式迁移出胸腺。这一高度程序化过程的成功在很大程度上依赖于迁移中的胸腺细胞与定居的胸腺上皮细胞（TECs）之间的相互作用，后者是胸腺基质中的主要细胞群体，对于建立并维持胸腺微环境的完整性至关重要。
根据解剖位置和独特功能，胸腺上皮细胞（TECs）可分为两个亚群：皮质中的胸腺上皮细胞（cTECs），负责选择受自身MHC（主要组织相容性复合体）限制的T细胞（阳性选择）；以及髓质中的胸腺上皮细胞（mTECs），对清除自身反应性T细胞（阴性选择）至关重要1,2。多种因素（例如，衰老、感染、辐射、药物治疗）可导致胸腺上皮发生不可逆损伤，进而损害适应性免疫功能。尽管已有大量尝试，但由于难以重建胸腺微环境，恢复胸腺功能仍具挑战性。值得注意的是，胸腺的三维（3-D）结构对TECs的存活和功能至关重要，而在二维（2-D）环境中培养的TECs会迅速降低对胸腺生成至关重要的基因表达3,4。
EAK16-II（AEAEKAKAEAEAKAK）及其C端组氨酸化类似物EAKIIH6（AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH）....
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方案
实验中使用的所有动物均饲养于阿勒格尼-辛格研究所在阿勒格尼健康网络/阿勒格尼-辛格研究机构动物护理与使用委员会审查并批准的方案下运行的动物设施中。
1. 使用胶原酶消化胸腺
- 取出胸腺。
- 将3-5周龄的C57BL6/J小鼠置于二氧化碳（CO2）麻醉室中实施安乐死，以获取胸腺。具体操作：将小鼠放入CO2环境中诱导3-5分钟，并通过确认心脏或呼吸停止来判断死亡。
- 将尸体仰卧放置，用70%乙醇润湿体表。使用锋利的直解剖剪在腹部皮肤上做一横向小切口。将皮肤两端（头部和腿部方向）拉开，使其翻转外翻。
- 用解剖剪在最低肋骨下方横向剪开，并侧向剪开膈肌。用镊子夹住剑突，沿两侧向上剪开肋骨中线。抬起肋骨/胸骨，使胸腺清晰可见。
注意：胸腺位于心脏正上方，由两个叶组成，呈白色半透明状。 - 使用弯头镊子轻轻将胸腺叶从结缔组织中剥离并取出，转移至洗涤液中（见材料列表）。
- 在50 ml离心管中混合9 ml RPMI-1640（罗斯韦尔帕克纪念研究所1640培养基）、0.025 mg/ml纯化胶原酶、10 mM HEPES [4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸] 和0.2 mg/ml DNase I，配制消化液。将消化液置于37 °C水浴中保温备用。
注意：所配制的消化液体积....
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结果
为了评估利用密度梯度分离法富集CD45-基质细胞的效果，我们对从界面层以及沉淀的淋巴细胞沉淀中收获的细胞进行了抗CD45和抗EpCAM抗体染色。染色混合物中还包含抗荆豆凝集素1（Ulex Europaeus Agglutinin 1, UEA1）和抗MHC II类分子抗体，以进一步鉴定皮质胸腺上皮细胞（cTEC）和髓质胸腺上皮细胞（mTEC）亚群。如图1所示，我们通常可实现胸腺上皮细胞（TEC）约15-20倍的富集。
为检测TECs在EAK水凝胶中的聚集情况，从4周龄B6.ROSA小鼠中分离TECsmT/mG 小鼠，其普遍表达膜结合的红色荧光tdTomato分子。胸腺上皮细胞（TEC）聚集体按上述方法制备后，培养两天 体外 并在共聚焦显微镜下观察（图2).
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讨论
虽然胸腺上皮细胞（TEC）是胸腺基质中的主要细胞群体，在胸腺器官的结构和功能中发挥着关键作用，但其仅占胸腺总细胞数的约0.1-0.5%。此外，TEC属于脆弱细胞，因为在使用胶原酶消化（即用于将TEC从细胞外基质（ECM）中解离的处理方法）后，时常观察到较高比例的细胞死亡。i.e.，该处理用于将TEC从细胞外基质（ECM）中解离。TEC的稀有性（每只小鼠胸腺约20万个）及其脆弱性使得其分离工作极具挑战性。近年来，在TEC分离过程中使用高纯度胶原酶显著提高了酶消化后活细胞的数量15-19。
然而，胸腺上皮细胞（TECs）数量极少，这为其分析和分离带来了主要挑战，因为需要大量抗体进行细胞表面标记，并且需要通过流式细胞术（FACS）收集大量事件数据。虽然可使用抗体偶联的磁珠技术来耗竭CD45+胸腺细胞，但其所需磁珠数量庞大，长期来看经济成本过高。我们通过一种简单的一次性密度梯度离心法，成功将TECs富集了15–20倍。碘克沙醇密度梯度介质的等渗特性可依据细胞的形态、大小和密度实现细胞分离20–22。需要注意的是，TECs的纯度和.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院资助 R21 AI113000（W.S.M）和 R01 AI123392（Y.F.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胸腺上皮细胞（TEC）分离 | |||
| 70% 乙醇 | Decon Laboratories | 2701(1 加仑) | 200 证明乙醇，去离子水 |
| 直头解剖剪 | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| 直头Graefe镊子 | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| 弯头Graefe镊子 | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| 洗涤液 | 1× PBS，0.1% BSA，2 mM EDTA | ||
| 1× PBS（磷酸盐缓冲盐水） | Gibco | 10010-023 | |
| BSA（牛血清白蛋白） | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA（乙二胺四乙酸） | Invitrogen | 15575-038 | |
| 消化液 | 9 ml RPMI-1640，0.025 mg/ml Liberase TM 研究级，10 mM HEPES，0.2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM 研究级 | Roche | 05 401 127 001 | 又称 "纯化的胶原酶" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml 离心管 | Corning | 430290 | |
| 60 mm 组织培养皿 | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 胰岛素注射器 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml 聚苯乙烯圆底管 | Falcon | 352058 | |
| 5 ml 玻璃移液管 | Fisher Healthcare | 13-678-27E | 用于冲洗胸腺碎片。胸腺碎片容易粘附在塑料移液管管壁上。 |
| MACSmix 试管旋转混合器 | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 µm 细胞筛 | Falcon | 352360 | |
| 密度梯度介质：OptiPrep | Axis-Shield | ||
| 细胞分选 | |||
| 5 ml 聚丙烯圆底管 | Falcon | 352063 | |
| 抗小鼠 CD16/CD32（Fc阻断剂） | BD Biosciences | 553142 | 未稀释使用，每样本 2 µl |
| 抗小鼠 CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | 使用比例 1:150，每样本 10 µl |
| 抗小鼠 CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | 使用比例 1:100，每样本 10 µl |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| 单细胞分析软件 | FlowJo | ||
| EAK 凝胶组装 | |||
| 抗 His-标签抗体 | AnaSpec | 29673 | "抗 His-标签 IgG" |
| 纯化的抗小鼠 CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "抗 EpCAM IgG" |
| 重组蛋白 A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5 ml 安全锁扣管，Biopur，无菌 | Fisher Healthcare | 05-402-24B | 又称 "1.5 ml 微量离心管" |
| 96 孔组织培养板，圆底，带低蒸发盖 | BD Falcon | 353917 | |
| 摇床平台：Nutator Mixer 型号 no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% 蔗糖 | Sigma | S0389 | 用无菌蒸馏水配制 |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | 定制合成，10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | 定制合成，7.5 mg/ml | |
| 完全培养基 | RPMI-1640，10% FBS，1% 青霉素/链霉素，1% L-谷氨酰胺，1% NEAA，5 mM HEPES，50 µM 2-巯基乙醇 | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS（胎牛血清） | Atlanta Biologicals | S11150 | 使用前需热灭活 |
| 青霉素/链霉素（Pen/Strep） | Gibco | 15140-122 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM (100×) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA（非必需氨基酸）100× | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-巯基乙醇（100×） | Millipore | ES-007-E | |
| 平台振荡器：The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | 型号：USBDbo |
参考文献
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insuli....
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