本视频演示了一种利用密度梯度法富集胸腺上皮细胞（TECs）并进行FACS分离的实验方案。同时展示了使用EAK16-II/EAKIIH6多肽促进TEC细胞聚集体形成的步骤。EAK16-II/EAKIIH6水凝胶的微环境可提供维持TEC存活与功能所必需的三维结构。
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摘要
摘要
胸腺退化与衰老或病理性损伤相关，会导致成熟T细胞的输出减少。恢复功能衰退的胸腺对于维持有效的T细胞介导的获得性免疫应答以对抗入侵病原体至关重要。然而，胸腺再生和功能重建一直具有挑战性，主要原因是难以重建胸腺基质独特的三维微环境，而这种微环境对胸腺上皮细胞（TECs）的存活和功能至关重要。我们开发了一种新型水凝胶系统，利用两亲性寡肽EAK16-II及其组氨酸化类似物EAKIIH6的自组装特性，促进TEC细胞聚集体的形成。TEC从分离的胸腺细胞中通过密度梯度法富集，经荧光激活细胞分选（FACS）纯化，并使用锚定在蛋白A/G衔接复合物上的抗上皮细胞黏附分子（EpCAM）抗体和抗His IgG进行标记。通过将TEC与EAKIIH6和EAK16-II寡肽共孵育，随后提高培养基离子浓度以启动凝胶化过程，从而促进细胞聚集体的形成。当将嵌入EAK水凝胶中的TEC聚集体移植至无胸腺裸鼠体内时，可有效促进功能性T细胞的发育in vivo。
引言
胸腺是主要的淋巴器官，负责生成多样化的、可识别病原体且对自身抗原耐受的T细胞群体，这对获得性免疫系统的功能至关重要。胸腺是一个动态器官，其中由骨髓迁移而来的淋巴祖细胞——即胸腺细胞——穿过类似海绵状的三维（3-D）胸腺基质结构，经历谱系特化与分化，最终以成熟T细胞的形式迁移出胸腺。这一高度程序化过程的成功在很大程度上依赖于迁移中的胸腺细胞与定居的胸腺上皮细胞（TECs）之间的相互作用，后者是胸腺基质中的主要细胞群体，对于建立并维持胸腺微环境的完整性至关重要。
根据解剖位置和独特功能，胸腺上皮细胞（TECs）可分为两个亚群：皮质中的胸腺上皮细胞（cTECs），负责选择受自身MHC（主要组织相容性复合体）限制的T细胞（阳性选择）；以及髓质中的胸腺上皮细胞（mTECs），对清除自身反应性T细胞（阴性选择）至关重要1,2。多种因素（例如，衰老、感染、辐射、药物治疗）可导致胸腺上皮发生不可逆损伤，进而损害适应性免疫功能。尽管已有大量尝试，但由于难以重建胸腺微环境，恢复胸腺功能仍具挑战性。值得注意的是，胸腺的三维（3-D）结构对TECs的存活和功能至关重要，而在二维（2-D）环境中培养的TECs会迅速降低对胸腺生成至关重要的基因表达3,4。
EAK16-II（AEAEKAKAEAEAKAK）及其C端组氨酸化类似物EAKIIH6（AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH）是低分子量两亲性寡肽，可溶于去离子水，但在离子强度高于20 mM NaCl的条件下（人体体液的正常盐浓度为154 mM）会发生凝胶化，形成β-纤维结构。这种环境响应特性使其成为构建三维结构的多功能分子模块。EAKIIH6上的组氨酸标签（His-tag）提供了一种锚定机制，可通过抗组氨酸IgG/Fc结合的重组蛋白A/G（αH6:pA/G）复合物作为连接适配器，实现蛋白药物及其他生物分子的固定与偶联。例如，抗体）在水凝胶复合材料上 5-8.
我们先前已证明，锚定在水凝胶上的荧光标记IgG分子可在注射部位保留长达13天 9。此外，当将锚定有抗CD4 IgG的αH6:pA/G衔接子加入EAK16-II/EAKIIH6（EAK）水凝胶时，可特异性捕获CD4+ T细胞 10。采用类似技术，我们最近证明，在携带TEC特异性抗EpCAM抗体（αH6:pA/G:αEpCAM）的衔接复合物存在下，EAK水凝胶可促进TEC的三维聚集。将嵌有TEC细胞簇的EAK水凝胶移植至裸鼠肾包膜下后，可有效支持功能性T细胞在体内的发育in vivo11,12。
本文介绍了我们利用荧光激活细胞分选技术（FACS）快速高效地纯化胸腺上皮细胞（TEC），并结合EAK水凝胶系统生成三维TEC聚集体的方法。
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方案
实验中使用的所有动物均饲养于阿勒格尼-辛格研究所在阿勒格尼健康网络/阿勒格尼-辛格研究机构动物护理与使用委员会审查并批准的方案下运行的动物设施中。
1. 使用胶原酶消化胸腺
- 取出胸腺。
- 将3-5周龄的C57BL6/J小鼠置于二氧化碳（CO2）麻醉室中实施安乐死，以获取胸腺。具体操作：将小鼠放入CO2环境中诱导3-5分钟，并通过确认心脏或呼吸停止来判断死亡。
- 将尸体仰卧放置，用70%乙醇润湿体表。使用锋利的直解剖剪在腹部皮肤上做一横向小切口。将皮肤两端（头部和腿部方向）拉开，使其翻转外翻。
- 用解剖剪在最低肋骨下方横向剪开，并侧向剪开膈肌。用镊子夹住剑突，沿两侧向上剪开肋骨中线。抬起肋骨/胸骨，使胸腺清晰可见。
注意：胸腺位于心脏正上方，由两个叶组成，呈白色半透明状。 - 使用弯头镊子轻轻将胸腺叶从结缔组织中剥离并取出，转移至洗涤液中（见材料列表）。
- 在50 ml离心管中混合9 ml RPMI-1640（罗斯韦尔帕克纪念研究所1640培养基）、0.025 mg/ml纯化胶原酶、10 mM HEPES [4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸] 和0.2 mg/ml DNase I，配制消化液。将消化液置于37 °C水浴中保温备用。
注意：所配制的消化液体积足以处理最多五只成年小鼠的胸腺，可将这些胸腺共同孵育于一个5 ml聚苯乙烯圆底试管中。 - 将胸腺转移至含有5-6 ml RPMI-1640的60 mm组织培养皿中。
- 用28 G胰岛素注射器针头将胸腺剪切成小块（约1 mm3大小），以便淋巴细胞释放出来。
- 用玻璃巴斯德吸管在培养皿中以RPMI-1640冲洗胸腺碎片。倾斜培养皿，使胸腺碎片沉降至底部。用玻璃吸管缓慢吸除并弃去RPMI-1640上清液。使用玻璃吸管重复此冲洗步骤4-5次，每次加入5-6 ml RPMI-1640，直至溶液变得较为透明。
注意：建议在此步骤中使用玻璃吸管，因为胸腺碎片容易黏附于塑料表面，导致胸腺组织过度损失。后续步骤中可使用塑料吸管。 - 最后一次冲洗后，按步骤1.5所述弃去上清液。加入3 ml消化液，将胸腺碎片及液体转移至5 ml圆底聚苯乙烯试管中。
- 将试管置于旋转仪上，在37 °C下以12 rpm转速孵育6分钟。
- 孵育结束后，静置试管使胸腺碎片自然沉降至管底。用巴斯德吸管收集上清液，转移至含10 ml洗涤液的50 ml离心管中。在300 x g下离心5分钟，弃去上清液，将细胞重悬于10 ml洗涤液中，并置于冰上保存。
- 对5 ml圆底聚苯乙烯试管中的胸腺碎片重复步骤1.6-1.8两次。将各次上清液合并至同一50 ml离心管中。
注意：第二次和第三次洗涤无需离心。 - 最终消化完成后，用2 ml塑料移液管反复吹打，以破碎管中残留的组织碎片，并将全部液体转移至50 ml离心管中。
- 将50 ml离心管在300 x g下离心5分钟，吸除上清液，用10 ml洗涤缓冲液重悬细胞，经100 µm细胞滤网过滤后置于冰上保存。
2. 通过不连续密度梯度富集胸腺上皮细胞（TECs）
- 通过将2.4 ml密度梯度介质（60% w/v碘克沙醇水溶液）与9.6 ml洗涤液混合，制备21%密度梯度溶液。
- 将步骤1.11中50 ml收集管内的解离胸腺细胞在300 × g条件下离心5分钟，并重悬于2.5 ml洗涤缓冲液中。
- 向细胞悬液中加入20 ml RPMI-1640培养基。
- 使用电子移液器将12 ml 21%密度梯度溶液加入10 ml血清移液管中。将移液管管尖置于含有细胞的50 ml离心管底部，依靠重力使密度梯度溶液缓慢流至管底。
- 轻柔地将密度梯度溶液从移液管中排出，以完成两种不同密度层的构建。
- 在室温下，使用摆动桶转子以600 × g离心20分钟。将减速速率设为最慢档。
- 将上层液体和界面层转移至新的50 ml离心管中。
注意：大多数胸腺上皮细胞（TEC）保留在界面层中。淋巴细胞在离心后会沉淀至管底。若需利用这些沉淀细胞，可用20 ml洗涤液清洗沉淀物三次，然后将细胞重悬于10 ml洗涤缓冲液中。 - 向步骤2.6中的离心管加洗涤液至总体积40 ml，在4 °C条件下以400 × g离心6分钟。用移液器吸除上清液。
- 按照步骤2.7所述方法，再重复洗涤和吸除操作两次。
- 将细胞重悬于2 ml洗涤液中，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
3. 使用流式细胞术分离胸腺上皮细胞
- 将步骤 2.9 中的细胞用洗涤液调整至浓度为 1×106 个细胞/100 µl，并将细胞转移至 5 ml 圆底管中（聚丙烯或聚苯乙烯材质，根据流式分选仪说明书推荐选择）。
- 每 1×106 个细胞加入 2 µl 抗 Fc 受体 IgG，于 4 °C 孵育 10 分钟。
- 加入抗 CD45 抗体（1:150 稀释，每样本 10 µl）和抗 EpCAM 抗体（1:100 稀释，每样本 10 µl），于 4 °C 孵育超过 20 分钟。
- 用 2 ml 洗涤液洗涤细胞，于 4 °C 以 400 × g 离心 6 分钟，用移液器吸除上清液。
- 将细胞重悬于 1 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 通过 100 µm 滤网过滤。
- 将细胞上样至分选仪器。在侧向散射光（SSC）/前向散射光（FSC）图中选择排除最小细胞（死亡细胞）的淋巴细胞和胸腺上皮细胞（TEC）群体，然后对 CD45- EpCAM+ 群体设门进行分选13。
4. TEC/EAK 聚集体的制备
注意：试剂配制及涉及细胞混合的步骤均须在超净工作台内进行。
- 在无菌的1.5 ml微量离心管中，混合4 µl抗His标签IgG、8 µl抗EpCAM IgG和2.6 µl pA/G，配制pA/G衔接复合物，并在室温下孵育5分钟。
- 将步骤3.7中分选得到的TEC用洗涤液调整至5×104 个细胞/ml，取100 µl加入低蒸发96孔圆底组织培养板的一个孔中。向细胞中加入14.6 µl pA/G衔接复合物，将培养板置于摇床上，4 °C孵育20分钟。
- 用200 µl洗涤液洗涤一次，以400 × g离心6分钟，用移液器弃去上清液。
- 用200 µl 10%蔗糖溶液洗涤一次，以400 × g离心6分钟，用移液器弃去上清液。
- 每孔用30 µl无菌10%蔗糖溶液重悬细胞。
- 加入10 µl EAKIIH6（7.5 mg/ml），室温孵育5分钟。
- 向TEC混合物中加入20 µl EAK16-II（10 mg/ml）。
- 向体系中加入100 µl完全培养基以启动凝胶化，将培养板置于摇床上，室温振荡15–20分钟。
- 将培养板放入37 °C、5% CO2的培养箱中。2–4小时后，再加入100 µl完全培养基。
- 每隔一天更换一次培养基，直至使用。
- 用移液器小心吸取培养基表面100 µl，避免扰动凝胶，然后将移液枪头轻靠孔壁，缓慢加入100 µl预热的培养基。
5. TEC/EAK 聚集体的表征
- 为了研究TEC/EAK聚集体的功能 体内，收集经O/N培养后的TEC/EAK水凝胶，按照先前描述的方法将其移植到裸鼠的肾包膜下 11,14.
- 通过在移植后4-6周从裸鼠采集50–100 µl血液样本至含EDTA的采血管中，监测外周T细胞的发育情况，并使用抗CD4、抗CD8、抗CD45和抗CD3抗体混合物进行染色12.
- 使用流式细胞术（FCM）结合单细胞分析软件分析外周血白细胞中T淋巴细胞的百分比12.
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结果
为了评估利用密度梯度分离法富集CD45-基质细胞的效果，我们对从界面层以及沉淀的淋巴细胞沉淀中收获的细胞进行了抗CD45和抗EpCAM抗体染色。染色混合物中还包含抗荆豆凝集素1（Ulex Europaeus Agglutinin 1, UEA1）和抗MHC II类分子抗体，以进一步鉴定皮质胸腺上皮细胞（cTEC）和髓质胸腺上皮细胞（mTEC）亚群。如图1所示，我们通常可实现胸腺上皮细胞（TEC）约15-20倍的富集。
为检测TECs在EAK水凝胶中的聚集情况，从4周龄B6.ROSA小鼠中分离TECsmT/mG 小鼠，其普遍表达膜结合的红色荧光tdTomato分子。胸腺上皮细胞（TEC）聚集体按上述方法制备后，培养两天 体外 并在共聚焦显微镜下观察（图2).
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讨论
虽然胸腺上皮细胞（TEC）是胸腺基质中的主要细胞群体，在胸腺器官的结构和功能中发挥着关键作用，但其仅占胸腺总细胞数的约0.1-0.5%。此外，TEC属于脆弱细胞，因为在使用胶原酶消化（即用于将TEC从细胞外基质（ECM）中解离的处理方法）后，时常观察到较高比例的细胞死亡。i.e.，该处理用于将TEC从细胞外基质（ECM）中解离。TEC的稀有性（每只小鼠胸腺约20万个）及其脆弱性使得其分离工作极具挑战性。近年来，在TEC分离过程中使用高纯度胶原酶显著提高了酶消化后活细胞的数量15-19。
然而，胸腺上皮细胞（TECs）数量极少，这为其分析和分离带来了主要挑战，因为需要大量抗体进行细胞表面标记，并且需要通过流式细胞术（FACS）收集大量事件数据。虽然可使用抗体偶联的磁珠技术来耗竭CD45+胸腺细胞，但其所需磁珠数量庞大，长期来看经济成本过高。我们通过一种简单的一次性密度梯度离心法，成功将TECs富集了15–20倍。碘克沙醇密度梯度介质的等渗特性可依据细胞的形态、大小和密度实现细胞分离20–22。需要注意的是，TECs的纯度和...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院资助 R21 AI113000（W.S.M）和 R01 AI123392（Y.F.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胸腺上皮细胞（TEC）分离 | |||
| 70% 乙醇 | Decon Laboratories | 2701(1 加仑) | 200 证明乙醇，去离子水 |
| 直头解剖剪 | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| 直头Graefe镊子 | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| 弯头Graefe镊子 | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| 洗涤液 | 1× PBS，0.1% BSA，2 mM EDTA | ||
| 1× PBS（磷酸盐缓冲盐水） | Gibco | 10010-023 | |
| BSA（牛血清白蛋白） | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA（乙二胺四乙酸） | Invitrogen | 15575-038 | |
| 消化液 | 9 ml RPMI-1640，0.025 mg/ml Liberase TM 研究级，10 mM HEPES，0.2 mg/ml DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM 研究级 | Roche | 05 401 127 001 | 又称 "纯化的胶原酶" |
| 1 M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50 ml 离心管 | Corning | 430290 | |
| 60 mm 组织培养皿 | Falcon | 353002 | |
| 1/2 cc U-100 胰岛素注射器 28 1/2 G | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5 ml 聚苯乙烯圆底管 | Falcon | 352058 | |
| 5 ml 玻璃移液管 | Fisher Healthcare | 13-678-27E | 用于冲洗胸腺碎片。胸腺碎片容易粘附在塑料移液管管壁上。 |
| MACSmix 试管旋转混合器 | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100 µm 细胞筛 | Falcon | 352360 | |
| 密度梯度介质：OptiPrep | Axis-Shield | ||
| 细胞分选 | |||
| 5 ml 聚丙烯圆底管 | Falcon | 352063 | |
| 抗小鼠 CD16/CD32（Fc阻断剂） | BD Biosciences | 553142 | 未稀释使用，每样本 2 µl |
| 抗小鼠 CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | 使用比例 1:150，每样本 10 µl |
| 抗小鼠 CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | 使用比例 1:100，每样本 10 µl |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| 单细胞分析软件 | FlowJo | ||
| EAK 凝胶组装 | |||
| 抗 His-标签抗体 | AnaSpec | 29673 | "抗 His-标签 IgG" |
| 纯化的抗小鼠 CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "抗 EpCAM IgG" |
| 重组蛋白 A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5 ml 安全锁扣管，Biopur，无菌 | Fisher Healthcare | 05-402-24B | 又称 "1.5 ml 微量离心管" |
| 96 孔组织培养板，圆底，带低蒸发盖 | BD Falcon | 353917 | |
| 摇床平台：Nutator Mixer 型号 no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% 蔗糖 | Sigma | S0389 | 用无菌蒸馏水配制 |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | 定制合成，10 mg/ml | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | 定制合成，7.5 mg/ml | |
| 完全培养基 | RPMI-1640，10% FBS，1% 青霉素/链霉素，1% L-谷氨酰胺，1% NEAA，5 mM HEPES，50 µM 2-巯基乙醇 | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS（胎牛血清） | Atlanta Biologicals | S11150 | 使用前需热灭活 |
| 青霉素/链霉素（Pen/Strep） | Gibco | 15140-122 | |
| L-谷氨酰胺 200 mM (100×) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA（非必需氨基酸）100× | Gibco | 11140-050 | |
| 1 M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-巯基乙醇（100×） | Millipore | ES-007-E | |
| 平台振荡器：The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | 型号：USBDbo |
参考文献
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