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方法文章

利用 pGR-Blue 质粒和 Golden Gate 连接快速验证终止子

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DOI：

10.3791/54064

⸱

2016年4月25日

 ,  , 
1Department of Biology, Ouachita Baptist University

本文内容

摘要

本方案利用 Golden Gate 组装技术和质粒 pGR-blue，快速定量 in silico 预测的终止子强度。

摘要

本实验方案的目的是实现对生物信息学方法鉴定出的终止子进行快速验证。此外，本方案专门设计了质粒pGR-Blue，可用于定量测定终止子效率。作为概念验证，研究人员在分枝杆菌噬菌体Bernal13中通过生物信息学方法鉴定了六个终止子。鉴定完成后，将这些终止子序列合成为带有适当黏性末端的寡核苷酸，并进行退火连接。利用Golden Gate组装（GGA）技术，将终止子克隆至pGR-Blue质粒中。在可见光下，假阳性菌落呈蓝色，而成功转化的阳性菌落则为白色或黄色。通过阿拉伯糖诱导阿拉伯糖诱导型启动子（pBad）后，可通过检测绿色荧光蛋白（GFP）与红色荧光蛋白（RFP）的产生量之比来确定菌落的荧光强度。使用pGR-Blue质粒，该实验方案最短可在三天内完成，非常适合用于教学环境。此外，实验结果表明，该方案有助于理解与转录调控相关的终止子效率的in silico预测。

引言

大型合成生物学项目需要使用高效的转录终止子来帮助调控基因表达。鉴定新型终止子需要对新基因组进行生物信息学分析。然而，随着越来越多的生物信息学软件被开发出来，每种软件都采用独特的预测算法，导致假定结果之间的差异日益增加。由于这一过程具有一定的主观性，并且是在计算机上（in silico）完成的，因此这些预测需要通过生物学实验加以验证1。此外，通过计算机分析（in silico）鉴定出的大量假定终止子，要求采用能够在相对较短时间内完成的克隆策略。

PGR-Blue 质粒是 PGR 质粒的一种改良版本，经过重新设计以采用黄金门组装（Golden Gate Assembly, GGA）技术，使所有反应步骤可在同一微量离心管中同时进行，从而简化了克隆流程2,3。该质粒引入了颜色筛选机制，以更方便地识别阳性克隆。当在含有阿拉伯糖的培养板上生长时，成功连接的克隆在可见光下呈白色或黄色，在蓝光（450 nm）或紫外光（UV）照射下会发出绿色荧光。由于未切割的 pGR-blue 含有一种蓝色色素蛋白（amilCP），因此含有未修饰质粒的菌落在可见光下呈蓝色。这一简化设计结合优化的实验流程，使研究人员能够在 3 至 4 天内完成从生物信息学鉴定到生物学验证的全过程。该系统的模块化设计在科研实验室和教学环境中均具有重要应用价值。

pGR-Blue 质粒可用于定量终止子的强度。4 该质粒使用单一的阿拉伯糖诱导型启动子来表达绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）。终止子被克隆至质粒中GFP序列之后、RFP序列之前，从而终止RFP蛋白的转录。终止子的强度通过所产生的GFP与RFP的比值来确定。

《愿景与变革》5报告建议，科学、技术、工程和数学（STEM）教育应将基于研究的实践经历纳入课堂教学中6。然而，这需要开发出适合技能水平有限的学生在规定时间内完成的实验方案。本方案最短可在三天内完成，同时也被设计为每个主要步骤可在独立的每周（2–3 小时）实验课中分步实施，从而构建一门课程研究实践（CRE）。以这种方式实施时，整个流程将持续三至六周，适用于遗传学、细胞生物学或生物信息学的入门及高级课程。

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方案

1. 设计并订购具有合适黏性末端的寡核苷酸

  1. 通过使用网上免费提供的程序进行基因组分析，鉴定潜在的ρ-非依赖性终止子。7
  2. 处理双链DNA时，确定待测终止子的方向。7 pGR-Blue质粒仅能验证在顶部链（正向链）上以5'至3'方向连接的终止子。
    1. 对于底部链（反向链）的终止子，可使用免费的在线软件（例如，ApE）将其转换为其反向互补序列，以重新定向该序列，使其适用于pGR-Blue中的检测。
  3. 确定方向正确后，在顶部链的5'端添加黏性末端“5'-CGAC-3'”，在底部链的5'端添加黏性末端“5'-CCGC-3'”。8 这将确保通过GGA方法连接的插入片段能以正确的方向插入。
  4. 确定序列后，可作为单链寡核苷酸向商业公司订购。

2. 寡核苷酸退火（仅适用于冻干 DNA）

  1. 用无核酸酶水将单个寡核苷酸重悬，使其浓度达到 100 µM。
  2. 配制 10× 退火缓冲液：1 M NaCl 和 100 mM Tris-HCl（pH 7.4）。退火缓冲液可在 4 °C 下保存数周。退火缓冲液配制完成后，并完成寡核苷酸重悬后，即可开始退火8。
  3. 针对每个待测试的终止子，向一个 1.5 ml 微离心管中加入 16 µl 超纯水。
  4. 向每个微离心管中加入 2 µl 10× 退火缓冲液。
  5. 加入 1 µl 目标终止子的上游链寡核苷酸（100 µM）。
  6. 加入 1 µl 目标终止子的下游链寡核苷酸（100 µM）。
  7. 使用一个盛有约 400 ml 自来水的 1,000 ml 烧杯制备沸水浴，并将其置于加热板上。
  8. 将步骤 2.6 中的微离心管放入浮漂中，煮沸 4 分钟。4 分钟后关闭加热板，但将浮漂和管子保留在水浴中，缓慢冷却过夜（18 小时）8。将退火完成的终止子储存于 -20 °C。

3. 黄金门组装（标准混合体系——经济高效）

  1. 制备退火终止子的 40 nM 稀释液。向 1 µl 退火终止子混合物（100 µM）中加入 124 µl 无核酸酶水。
    1. 将样品在 10,000 × g 条件下离心 30 秒，并置于冰上保存。
  2. 取一个适用于所用热循环仪的新离心管，加入 6 µl 无核酸酶水。
  3. 加入 1 µl 商业 DNA 连接酶缓冲液 [300 mM Tris-HCl (pH 7.7–7.8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT 和 10 mM ATP]。后续所有步骤均在冰上操作。
  4. 向微量离心管中加入 1 µl pGR-Blue（35–50 ng/µl）目的质粒。
  5. 向微量离心管中加入 1 µl 40 nM 的退火终止子。
  6. 向微量离心管中加入 0.5 µl 商业高保真 BsaI 限制性内切酶。
  7. 向微量离心管中加入 0.5 µl 商业 DNA 连接酶。
  8. 将反应混合物在 10,000 × g 条件下离心 120 秒，然后直接将离心管放入热循环仪中。
  9. 运行热循环程序：37 °C 孵育 1 分钟，随后 16 °C 孵育 1 分钟，重复 20 个循环；接着在 37 °C 孵育 15 分钟，进行 1 个循环。样品应立即使用，或冻存于 -20 °C 保存。8

4. 金门组装（商用预混液 — 节省时间）

  1. 添加 124 µl 加入无核酸酶水至 1 µl 的 100 µM 在步骤2中制备的退火终止子。将终止子DNA浓度稀释至40 nM。此步骤需在新标记的1.5 ml微量离心管中进行。
  2. 将适量样品加入适合PCR仪使用的新离心管中 14 µl 加入无核酸酶水。确保新试管已正确标记。
  3. 添加 2 µl 将商用预混缓冲液加入微量离心管中。
  4. 添加 1 µl pGR-蓝色质粒（35-50 ng/µl) 加入微量离心管中。
  5. 添加 2 µl 将40 nM退火终止子加入微量离心管中。
  6. 添加 1 µl 将商业预混液加入微量离心管中。
  7. 以 10,000 × g 离心 40 nM 样品管 120 秒。随后将该管直接放入热循环仪中。
  8. 运行热循环程序：60 分钟，1 个循环，温度为 37 °C 随后进行1个循环，15分钟，72°C 55 °C立即使用样品，或冷冻保存于 -20 °C.

5. 转化与菌落筛选

  1. 制备含有1 mM氨苄青霉素（Amp）和10 mM阿拉伯糖（arb）的Luria肉汤（LB）琼脂培养皿。至少准备10 ml的1 M L-arabinose 储备液，因为后续步骤中将使用该储备液。
  2. 使用任何高效（108 - 109 转化子/µg 化学感受态 E. coli 用于转化的JM109细胞9 为获得最佳结果，添加 3-5 µl 连接反应的 50 µl 感受态细胞的使用。当使用化学感受态游戏副本时，应遵循针对所用细胞类型的具体转化方案。
  3. 铺开一半（25 µl) 用无菌的L形“涂布棒”将转化后的细胞涂布于预热的LB（Amp/arb）琼脂平板上，37°C过夜培养 37 °C由于氨苄青霉素降解速度较快，切勿在以下条件下孵育： 37 °C 超过24小时。
  4. 根据颜色通过肉眼观察进行菌落筛选。成功的连接产物在可见光下呈白色或黄色，并在蓝光（450 nm）或紫外光下发出绿色荧光；连接不成功则在可见光下于18–20小时后形成蓝色菌落。

6. 终止子的验证与定量

  1. 准备含有 1 mM 氨苄青霉素和 10 mM 阿拉伯糖的 5 ml 无菌 LB 液体培养基试管。所需试管数量取决于待测试终止子的数量，另需包括对照组（仅含氨苄青霉素抗性但不表达荧光的细胞，以及含有未切割 pGR-Blue 质粒的细胞）。
  2. 在可见光下，使用无菌接种环挑取 2–3 个白色/黄色菌落（见步骤 5.4）。将样品置于摇床中，在 37 °C、160 rpm 条件下培养 16–18 小时。培养时间不得超过 24 小时。
    1. 可选：使用分光光度计测定 600 nm 处的细胞光密度（OD600），以确认细胞生长充分。通常在培养 16–18 小时后，OD600 值约为 0.8–1.0。
  3. 剩余步骤使用无菌 96 孔板进行。所有操作均需在无菌环境中完成，并设三个重复。向每孔加入 199 µl 无菌 LB + Amp/阿拉伯糖培养基（含 1 mM 氨苄青霉素 / 10 mM 阿拉伯糖）。板上需预留三个独立对照孔的位置。
    1. 使用以下三种对照：一个孔（1）仅含 LB + Amp/阿拉伯糖培养基，另一个孔（2）加入未转化的感受态细胞（空白对照），作为背景空白；为定量分析终止子强度（3），应包括含有未切割原始 pGR 质粒或与非终止序列连接的 pGR-Blue 质粒的细胞（作为定量参考对照）。参见 图 1 中的酶标仪板布局。
  4. 用移液器将 1 µl 过夜培养物中的菌液分别加入 96 孔板的各个孔中。
  5. 用透气封板膜密封 96 孔板，并在 37 °C、160 rpm 条件下振荡培养 18–20 小时。
  6. 使用酶标仪测定 600 nm 处的吸光度以获得 OD600 值。GFP 荧光测定条件如下：激发波长 395，发射波长 509；RFP 荧光测定条件如下：激发波长 575，发射波长 605。培养 18–20 小时后，OD600 值应约为 0.5。
  7. 为校正细胞生长差异，使用以下公式对 GFP 和 RFP 荧光值进行归一化处理：荧光强度/光密度（OD600）公式；微生物数据分析；实验方程。
  8. 归一化后，使用以下公式计算相对终止子强度：基因表达比值公式；GFP 与 RFP 合成平衡；分子生物学研究中的方程。

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结果

本方案将通过Golden Gate Assembly（图2）在GFP与RFP之间连接一个终止子，从而获得含有pGR-Blue质粒的细胞。可通过菌落颜色筛选含有连接插入片段的阳性克隆。在可见光下，阳性克隆呈白色/黄色，而假阳性克隆在37 °C培养18–20小时后将形成蓝色菌落（图3）。

菌落筛选后，可使用酶标仪测定终止子强度。作为概念验证，通过生物信息学方法在分枝杆菌噬菌体 Bernal13 中鉴定了六个潜在的终止子（T1-6）。图4中的结果显示了以表达未切割/未修饰质粒 pGR 的细胞作为对照的相对终止子强度。若预测的终止子其 GFP/RFP 比值接近 pGR 的比值（约 0.0）或低于 0.1，则判定该序列不具备终止子功能（T5 和 T6）。然而，数值上每增加 0.1，代表相对于对照终止子强度增加一倍。例如，T3 的 GFP 表达相对于 RFP 具有...

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讨论

本方案中最重要的步骤是在订购前进行正确的寡核苷酸设计。为了确保能够实现GGA插入，上下两条链的5'端都必须添加适当的黏性末端。此外，由于GFP和RFP的表达方向为向右（上链）方向，因此必须将朝左的终止子（即在下链上终止转录的终止子）转换为朝右的终止子（即在上链上终止转录的终止子）。

在 pGR-Blue 中测试终止子时，可使用两种独立的 GGA 方案和缓冲液体系。标准经济型体系由实验室自行采购各组分并混合配制8。第二种方案则采用商业预混的 GGA 主混合液。两种方法均具有良好效果；但商业主混合液更节省时间，成本相对较高。在教学环境中，提前配制标准 GGA 混合液并分装冻存，供学生 individually 使用，可能更具经济性。

由于对pGR质粒进行了GGA修饰，并反向插入amilCP以实现颜色筛选，未切割的pGR-Blue质粒中GFP和RFP的表达受到限制，因此在测定相对终止子强度时，不应将其作为参考对照。然而，所有这些修饰在克隆过程中均会被去除，从而能够准确量化相对终止子强度。尽管最好使用原始的未修饰...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢基因组教学活动联盟（Genome Consortium for Active Teaching，GCAT）的Malcom Campbell和Todd Eckdahl，以及霍华德·休斯医学研究所科学教育联盟噬菌体猎手推进基因组学与进化科学项目（HHMI-Science Education Alliance - Phage Hunters Advancing Genomics and Evolutionary Science，SEA-PHAGES）的支持。

本项目获得了美国国立卫生研究院下属的国家研究资源中心（P20RR016460）和国家普通医学科学研究所（P20GM103429）的资助。本研究部分得到了美国国家科学基金会（资助号：IIA-1457888）的支持。此外，奥克城浸信会大学（Ouachita Baptist University）通过J.D. 帕特森暑期研究奖学金提供了机构资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
pGR-Blue 质粒Addgene68374
pGR-质粒Addgene46002
AeraSeal-（无菌片材）Excel ScientificBS-25仅限无菌片材
10x T4 DNA 连接酶缓冲液NEB
BsaI-HFNEBR3535S非 HF 酶也可使用，但热稳定性较差。 
NEB Golden Gate 组装混合液NEBE1600S方案中提到的商用预混液。
T4 DNA 连接酶NEBM0202S
圆形微量离心浮置架Nova Tech InternationalF18875-6401
氨苄青霉素钠盐Sigma AldrichA9518
L-(+)-阿拉伯糖Sigma AldrichA-3256D-阿拉伯糖不能诱导 pBAD 启动子
LB 培养基（Luria Base）- 肉汤，Miller 配方Sigma AldrichL1900
LB 培养基（Luria Base）- 琼脂，Miller 配方Sigma AldrichL2025
Tecan-Infinite M200 酶标仪Tecan
Mix & Go 感受态细胞 - JM109 菌株Zymo ResearchT3005使用公司推荐的转化方案
ApE：质粒编辑软件http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl，分子生物学级PromegaH5121
氯化钠（结晶/生物级，认证）Fisher ChemicalS671
商业寡核苷酸合成Integrated DNA Technologies (IDT)http://www.idtdna.com/site
Microtest 组织培养板 - 96 孔（无菌）Falcon35-3072
分枝杆菌噬菌体 "Bernal13"GenebankKJ510413
无核酸酶水Integrated DNA Technologies (IDT)IDT004
无菌 L 形刮菌棒Life Science Products6444-S1
Nano-Drop 2000c 紫外-可见分光光度计Thermo Scientific2000c
ARNold：一种用于预测Rho非依赖型转录终止子的网络工具。http://rna.igmors.u-psud.fr/

参考文献

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