利用 pGR-Blue 质粒和 Golden Gate 连接快速验证终止子

摘要

本方案利用 Golden Gate 组装技术和质粒 pGR-blue，快速定量 in silico 预测的终止子强度。

摘要

本实验方案的目的是实现对生物信息学方法鉴定出的终止子进行快速验证。此外，本方案专门设计了质粒pGR-Blue，可用于定量测定终止子效率。作为概念验证，研究人员在分枝杆菌噬菌体Bernal13中通过生物信息学方法鉴定了六个终止子。鉴定完成后，将这些终止子序列合成为带有适当黏性末端的寡核苷酸，并进行退火连接。利用Golden Gate组装（GGA）技术，将终止子克隆至pGR-Blue质粒中。在可见光下，假阳性菌落呈蓝色，而成功转化的阳性菌落则为白色或黄色。通过阿拉伯糖诱导阿拉伯糖诱导型启动子（pBad）后，可通过检测绿色荧光蛋白（GFP）与红色荧光蛋白（RFP）的产生量之比来确定菌落的荧光强度。使用pGR-Blue质粒，该实验方案最短可在三天内完成，非常适合用于教学环境。此外，实验结果表明，该方案有助于理解与转录调控相关的终止子效率的in silico预测。

引言

大型合成生物学项目需要使用高效的转录终止子来帮助调控基因表达。鉴定新型终止子需要对新基因组进行生物信息学分析。然而，随着越来越多的生物信息学软件被开发出来，每种软件都采用独特的预测算法，导致假定结果之间的差异日益增加。由于这一过程具有一定的主观性，并且是在计算机上（in silico）完成的，因此这些预测需要通过生物学实验加以验证¹。此外，通过计算机分析（in silico）鉴定出的大量假定终止子，要求采用能够在相对较短时间内完成的克隆策略。

PGR-Blue 质粒是 PGR 质粒的一种改良版本，经过重新设计以采用黄金门组装（Golden Gate Assembly, GGA）技术，使所有反应步骤可在同一微量离心管中同时进行，从而简化了克隆流程^2,3。该质粒引入了颜色筛选机制，以更方便地识别阳性克隆。当在含有阿拉伯糖的培养板上生长时，成功连接的克隆在可见光下呈白色或黄色，在蓝光（450 nm）或紫外光（UV）照射下会发出绿色荧光。由于未切割的 pGR-blue 含有一种蓝色色素蛋白（amilCP），因此含有未修饰质粒的菌落在可见光下呈蓝色。这一简化设计结合优化的实验流程，使研究人员能够在 3 至 4 天内完成从生物信息学鉴定到生物学验证的全过程。该系统的模块化设计在科研实验室和教学环境中均具有重要应用价值。

pGR-Blue 质粒可用于定量终....

方案

1. 设计并订购具有合适黏性末端的寡核苷酸

1. 通过使用网上免费提供的程序进行基因组分析，鉴定潜在的ρ-非依赖性终止子。⁷
2. 在处理双链DNA时，确定待测终止子的方向。⁷ pGR-Blue质粒仅能验证在顶部链（正向链）上以5'至3'方向连接的终止子。
   1. 对于底部链（反向链）的终止子，可使用免费的在线软件（例如，ApE）将其转换为其反向互补序列，以便在pGR-Blue中进行正确取向的测试。
3. 确定方向正确后，在顶部链的5'端添加黏性末端“5'-CGAC-3'”，在底部链的5'端添加黏性末端“5'-CCGC-3'”。⁸ 这将确保通过GGA方法连接的插入片段能以正确的方向插入。
4. 确定序列后，可作为单链寡核苷酸向商业公司订购。

2. 寡核苷酸退火（仅适用于冻干DNA）

1. 将单个寡核苷酸用无核酸酶水重悬，配制成浓度为 100 µM 的溶液。
2. 配制 10× 退火缓冲液：1 M NaCl 和 100 mM Tris-HCl（pH 7.4）。退火缓冲液可在 4 °C 保存数周。退火缓冲液配制完成后，并完成寡核苷酸重悬后，即可开始退火⁸。
3. 针对每一个待检测的终止子，向一个 1.5 ml 微离....

结果

本实验方案将通过黄金门克隆组装（图2）在pGR-Blue质粒中构建一个终止子插入GFP与RFP之间的细胞。含有正确连接插入片段的阳性克隆可根据菌落颜色进行筛选。在可见光下，阳性克隆呈白色或黄色，而假阳性克隆在37 °C培养18–20小时后会形成蓝色菌落（图3）。

在菌落筛选后，可使用酶标仪测定终止子强度。作为概念验证，通过生物信息学方法在分枝杆菌噬菌体 Bernal13 中鉴定了六个假定的终止子（T1-6）。图4中的结果显示了以表达未切割/未修饰质粒 pGR 的细胞作为对照的相对终止子强度。如果预测的终止子其 GFP/RFP 比值接近 pGR（约 0.0）或低于 0.1，则判定该序列不具备终止子功能（T5 和 T6）。然而，数值上每增加 0.1，代表相对于对照终止子强度呈倍数增长。例如，T3 的 GFP 表达相对于 RFP 比值较高，其终止子强度较对照.......

讨论

本方案中最重要的步骤是在订购前进行正确的寡核苷酸设计。为了确保能够实现GGA插入，上下两条链的5'端都必须添加适当的黏性末端。此外，由于GFP和RFP的表达方向为向右（上链）方向，因此必须将朝左的终止子（即在下链上终止转录的终止子）转换为朝右的终止子（即在上链上终止转录的终止子）。

在 pGR-Blue 中测试终止子时，可使用两种独立的 GGA 方案和缓冲液体系。标准经济型体系由实验室自行采购各组分并混合配制⁸。第二种方案则采用商业预混的 GGA 主混合液。两种方法均具有良好效果；但商业主混合液更节省时间，成本相对较高。在教学环境中，提前配制标准 GGA 混合液并分装冻存，供学生 individually 使用，可能更具经济性。

由于对pGR质粒进行了GGA修饰，并反向插入amilCP以实现颜色筛选，未切割的pGR-Blue质粒中GFP和RFP的表达受到限制，因此在测定相对终止子强度时，不应将其作为参考对照。然而，所有这些修饰在克隆过程中均会被去除，从而能够准确量化相对终止子强度。尽管最好使用原始的未修饰.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pGR-Blue 质粒	Addgene	68374
pGR-质粒	Addgene	46002
AeraSeal-（无菌片材）	Excel Scientific	BS-25	仅限无菌片材
10x T4 DNA 连接酶缓冲液	NEB
BsaI-HF	NEB	R3535S	非 HF 酶也可使用，但热稳定性较差。
NEB Golden Gate 组装混合液	NEB	E1600S	方案中提到的商用预混液。
T4 DNA 连接酶	NEB	M0202S
圆形微量离心浮置架	Nova Tech International	F18875-6401
氨苄青霉素钠盐	Sigma Aldrich	A9518
L-(+)-阿拉伯糖	Sigma Aldrich	A-3256	D-阿拉伯糖不能诱导 pBAD 启动子
LB 培养基（Luria Base）- 肉汤，Miller 配方	Sigma Aldrich	L1900
LB 培养基（Luria Base）- 琼脂，Miller 配方	Sigma Aldrich	L2025
Tecan-Infinite M200 酶标仪	Tecan
Mix & Go 感受态细胞 - JM109 菌株	Zymo Research	T3005	使用公司推荐的转化方案
ApE：质粒编辑软件	http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl，分子生物学级	Promega	H5121
氯化钠（结晶/生物级，认证）	Fisher Chemical	S671
商业寡核苷酸合成	Integrated DNA Technologies (IDT)		http://www.idtdna.com/site
Microtest 组织培养板 - 96 孔（无菌）	Falcon	35-3072
分枝杆菌噬菌体 "Bernal13"	Genebank	KJ510413
无核酸酶水	Integrated DNA Technologies (IDT)	IDT004
无菌 L 形刮菌棒	Life Science Products	6444-S1
Nano-Drop 2000c 紫外-可见分光光度计	Thermo Scientific	2000c
ARNold：一种用于预测Rho非依赖型转录终止子的网络工具。	http://rna.igmors.u-psud.fr/