方法文章

快速扫描电子顺磁共振为生理重要参数的成像开辟了新途径 体内

DOI：

10.3791/54068

⸱

2016年9月26日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Denver, 2Magnetic Imaging Group, Applied Physics Division, Physical Measurements Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 3Department of Radiology, Geisel School of Medicine, Dartmouth University, 4Department of Biochemistry, West Virginia University, 5Department of Electrical and Computer Engineering, University of Denver, 6Department of Engineering, University of Denver

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一种新的电子顺磁共振（EPR）方法——快速扫描EPR（RS-EPR）被用于二维光谱空间成像，该方法优于传统的连续波（CW）技术，并为相关研究开辟了新的途径 体内 成像。结果在250 MHz下展示，但该技术适用于任何频率。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们展示了一种在250 MHz下利用快速扫描电子顺磁共振（RS-EPR）对稳定自由基报告分子进行二维光谱-空间成像的优越方法，该方法可在 体内 氧气浓度、pH、氧化还原状态及信号分子浓度的条件即， OH•，一氧化氮•RS-EPR 技术相比标准的连续波（CW）技术具有更高的灵敏度、更优的空间分辨率（1 mm）以及更短的采集时间。已测试多种模体构型，其空间分辨率范围为 1 至 6 mm，报告分子的谱宽范围为 16 µT（160 mG）至 5 mT（50 G）。交叉环双模谐振器实现了激发与检测的解耦，降低了噪声；同时，快速扫描效应允许在饱和前向自旋系统输入更多功率，从而增强 EPR 信号。这使得信噪比显著高于传统的 CW EPR 实验。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

与其他医学成像方式相比，电子顺磁共振成像（EPRI）能够 uniquely 定量成像包括 pH 在内的生理特性1-3pO24-7温度8组织的灌注与活性9微粘度及小分子扩散的难易程度10 和氧化应激11谷胱甘肽（GSH）在组织和细胞中裂解二硫键难易程度的评估12,13 可报告氧化还原状态。对于 体内 成像，选择250 MHz至1 GHz频率范围内的电子顺磁共振（EPR），因为这些频率能够提供足够的组织穿透深度（可达数厘米），从而在小动物中生成图像，且信号强度不会因介电损耗效应而显著减弱。更高的频率，例如9.5 GHz14 （X波段）和17 GHz（Ku-带15,16 可用于皮肤和毛发或单个细胞的成像。电子顺磁共振成像在所有频率下的成功应用均依赖于针对组织特异性的顺磁性自旋探针，以便对其位置和去向进行成像。

如果电子自旋探针所处的环境在空间上具有异质性，则电子顺磁共振（EPR）谱是来自所有位置贡献的总和。谱-空间成像将样品的体积划分为一系列微小的空间单元，并计算每个单元的EPR谱17。这使得可以通过测量EPR谱在空间上的变化来描绘局部环境的分布。利用磁场梯度将空间信息编码到EPR谱中，这些编码后的谱称为投影。谱-空间图像由这些投影重建而成18,19。

在快速扫描电子顺磁共振（RS-EPR）中，磁场在相对于电子自旋弛豫时间较短的时间内扫描通过共振点（图2）20,21。对快速扫描信号进行解卷积可得到吸收谱，该吸收谱等同于传统的一阶导数连续波（CW）谱的一阶积分。快速扫描信号采用正交检测，因此可同时测量自旋系统响应的吸收分量和色散分量，这实质上相当于单位时间内采集了两倍的数据量。在快速扫描实验中，信号饱和发生的功率高于连续波方法，因此可使用更高功率而无需担心饱和问题20,22。与连续波相比，单位时间内可进行更多次信号平均。更高的微波功率、直接正交检测以及单位时间内更多的信号平均次数共同使快速扫描具有更优的信噪比（SNR），尤其是在决定空间分辨的高梯度投影条件下，从而获得更高品质的图像。为获得一个模型样品图像相近的信噪比，连续波所需时间约为快速扫描的10倍23。

信噪比的提高还使得在250 MHz下对OH与5-叔丁氧羰基-5-甲基-1-吡咯啉反应生成的低浓度自旋捕获加合物进行实验成为可能N-氧化物（BMPO-OH），该物质在连续波方法中无法被检测到24二硝基氧化物通过二硫键连接，可被谷胱甘肽裂解，因此可用于报告细胞内的氧化还原状态。其双自由基与单自由基形式之间存在依赖于谷胱甘肽浓度的平衡。观察这些变化需要采集整个宽度为5 mT的谱图，而快速扫描电子顺磁共振（EPR）技术相比连续波（CW）实验中逐点扫描磁场的方式，可显著加快数据采集速度。

一个完整的快速扫描系统由四个部分组成：光谱仪、主磁场磁体、快速扫描线圈驱动器和快速扫描交叉环谐振器。光谱仪和主磁场磁体的功能与连续波（CW）实验中的相同，用于设定主塞曼磁场并从谐振器收集数据。快速扫描线圈驱动器产生正弦扫描电流，并输入到快速扫描交叉环谐振器上特制的快速扫描线圈中。快速扫描交叉环谐振器上的快速扫描线圈产生一个大而均匀的磁场，该磁场以3至15 kHz之间的频率进行扫描。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 250 MHz快速扫描线圈驱动器的设置

  1. 快速扫描实验条件的计算
    注意：RS-EPR 中最重要的参数是扫描速率， α，即扫描频率与扫描宽度的乘积（公式3）。对于较窄的扫描宽度，采用较快的扫描速率；而对于较宽的扫频范围，则采用较慢的扫描速率。以下步骤以后者为例，说明如何确定实验中线圈驱动参数为7 mT扫宽和6.8 kHz扫描频率。
    1. 确定谐振器带宽（BWRes).
      figure-protocol-1 (1)
      其中 vres 是谐振器的工作频率 Q 是品质因数。用于获取代表性结果数据的快速扫描谐振器，其 Q 值通常为 90。
    2. 确定快速扫描速率， α，由谐振器带宽决定 figure-protocol-2 (2)
      figure-protocol-3

      其中 N 是一个常数，通常保守地选择为5-6， ΔBpp 是峰-峰导数线宽，单位为 mT，且 a 若线型为洛伦兹线型，则扫描速率为 T/s。
      注：代表性部分中自由基的常见取值为 figure-protocol-4 = 0.1 mT。与早期快速扫描文献相比，公式2是通过设定信号带宽（BW）信号) 等于体重（BW）Res.
    3. 根据速率确定允许的最大快速扫描频率。
      figure-protocol-5 (3)
      figure-protocol-6
      其中 w 是扫描的宽度，且 f 是扫描频率。7 mT 的扫宽将覆盖当前探头所用谱图的 100% 体内使用该值和（公式2）中计算出的速率来确定扫描频率。
      figure-protocol-7
  2. 调谐电容器的选择与快速扫描线圈驱动器的调谐
    注意：快速扫描线圈驱动器通常以谐振模式运行，产生正弦波。当感抗与容抗大小相等、符号相反，使得总电抗接近零时，即发生谐振，此时的扫描频率称为谐振频率。
    1. 根据1.1.3中确定的频率，利用电感值计算合适的电容值。 L快速扫描线圈的，以及（公式 4）。
      figure-protocol-8
      figure-protocol-9
    2. 分割 C总有机碳 根据（公式 4）将数值减半，以确定线圈驱动电容箱每侧的电容值。
      figure-protocol-10
      figure-protocol-11
      注意：快速扫描线圈驱动器有两个放大器。选择电容器时，电容箱两侧需用相等的电容进行平衡。两侧为串联连接。
    3. 拧下电容器盒的顶盖，并在两侧插入与步骤 1.2.2 中确定的数值相等的电容器。
    4. 更换电容器盒的顶盖并拧紧螺丝，以确保其固定到位。
    5. 使用谐振线圈驱动器的前面板，调节输出频率，直至正弦波形达到最大振幅。

2. 试剂与仿体的制备

  1. 自由基的制备
    1. 从冷冻箱中取出15N-PDT，并让容器恢复至室温（10–15 分钟）。
    2. 使用分析天平称取 1.4 mg 的15N-PDT。
    3. 将 1.4 mg 的15N-PDT 加入 15 ml 去离子（DI）H2O 中，终浓度为 0.5 mM。
      注意：15N-PDT（4-氧代-2,2,6,6-四(2H3)甲基-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)哌啶基氮氧自由基）、15N-mHCTPO（4-1H-3-羰氨甲基-2,2,5,5-四(2H3)甲基-3-吡咯啉氮氧自由基）和15N-Proxyl（3-羧基-2,2,5,5-四(2H3)甲基-1-(3,4,4-2H3,1-15N)吡咯烷基氮氧自由基）25（图 1E–G）在水溶液中和室温下具有长期稳定性（2 年）。其固态形式通常保存在冷冻箱或冰箱中，以维持多年的稳定性。氮氧自由基的稳定性通常使其无毒，当溶剂为水时，可在普通实验台面上进行配制。若使用有机溶剂，则应在通风橱内操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
  2. pH 敏感型三苯甲基自由基的制备
    1. 称取 0.7 mg 三芳基甲基自由基（aTAM4）26（分子量 1,400 g/mol），溶于 200 µl 无水乙醇中。
    2. 称取 0.00681 g KH2PO4（分子量 136.1 g/mol），溶于 50 ml 去离子水中，终浓度为 1 mM。
    3. 称取 2.8 g KOH（分子量 56 g/mol），溶于 50 ml 去离子水中，终浓度为 1 M。
    4. 逐滴加入 KOH 至磷酸盐缓冲液（步骤 2.2.2）中，调节 pH 至 7.0。
    5. 加入 800 µl 1 mM 磷酸盐缓冲液和 200 µl 溶于无水乙醇的 aTAM4，终浓度为 0.5 mM，溶剂比例为 80:20 缓冲液:乙醇。
    6. 重复步骤 2.2.1–2.2.5，制备 pH = 7.2 的 aTAM4 样品。
    7. 将 aTAM4（pH = 7.0）和 aTAM4（pH = 7.2）分别装入两个独立的 6 mm 石英样品管中。
    8. 将两个 6 mm 石英 EPR 管放入一根 16 mm 石英 EPR 管中，中间用 2 mm 厚的聚苯乙烯泡沫隔开。
      注意：石英样品管管壁厚度为 0.5 mm，加上 2 mm 隔片，使两个 aTAM 样品之间保持 3 mm 的间距。所用的 pH 敏感型三苯甲基自由基由俄亥俄州立大学合成26，用于成像的示例为 aTAM4。其 pH 敏感反应如 图 1A 所示。
  3. BMPO-OH 的生成
    1. 称取 680 mg KH2PO4，溶于 100 ml 去离子水中，终浓度为 50 mM。
    2. 逐滴加入 1 M KOH 至磷酸盐缓冲液中，调节 pH 至 7.3。
    3. 称取 50 mg BMPO（分子量 199.25 g/mol）。
    4. 将 50 mg BMPO 与 5 ml 磷酸盐缓冲液混合，置于 16 mm 石英辐照管中。
    5. 加入 100 µl 300 mM 过氧化氢。
    6. 使用中压 450 W 紫外灯对 16 mm 石英辐照管中的混合物辐照 5 分钟。
    7. 使用玻璃移液管，将 2.5 ml 辐照后的 BMPO-OH 溶液从石英辐照管中转移至带有 3 mm 分隔的 16 mm 石英样品管的一侧。
    8. 将剩余的 2.5 ml 辐照后 BMPO-OH 溶液转移至该 16 mm 石英样品管的另一侧。
  4. 二硝基自由基的制备
    1. 称取 24.7 mg 2H,15N-二硫化物二硝基自由基（图 1C），溶于 1 ml DMSO 中，配制成 47.5 mM 的储备液。
    2. 配制 10 mM Tris 缓冲液，并调节 pH 至 7.2。
    3. 取 40 µl 二硝基自由基储备液，用 Tris 缓冲液稀释至终浓度为 1 mM。
    4. 将 250 µl 缓冲液中的二硝基自由基溶液加入带有中心 10 mm 分隔的 16 mm 石英样品管中。
    5. 称取 154 mg 谷胱甘肽，加入 5 ml Tris 缓冲液中，终浓度为 100 mM。
    6. 将 5 µl 100 mM 谷胱甘肽溶液加入 10 mm 分隔一侧的 250 µl 1 mM 二硝基自由基溶液中，以将双自由基转化为单自由基。
  5. 亚硝基硝基自由基的制备
    1. 从冷冻箱中取出自由基，并让容器恢复至室温（10–15 分钟）。
    2. 称取 1.9 mg 亚硝基硝基自由基（分子量 390 g/mol）。
    3. 称取 0.56 mg KOH，溶于 10 ml 去离子水中，终浓度为 1 mM。
    4. 将 1.9 mg 亚硝基硝基自由基加入 10 ml 1 mM KOH 溶液中，终浓度为 0.5 mM。
      注意：如有需要，可使用涡旋振荡器或超声仪加速亚硝基硝基自由基的溶解。

3. 250 MHz 快速扫描仪器的设置

注意：使用硝基氧化物自由基的水溶液对谐振器进行调谐（其对谐振器Q值和调谐的影响与缓冲液相似），是为待成像样品进行系统设置的有效方法

  1. 使用含氮氧自由基的水溶液样品调节谐振器。
    1. 将15 ml浓度为0.5 mM的15N-PDT水溶液样品装入16 mm石英EPR管中。
    2. 将石英管插入交叉环路RS-EPR谐振器的检测端。
    3. 调节仪器源的频率，使其与含有样品的检测端频率一致。通过软件输入所需数值，手动调节250 MHz源的载波频率。
    4. 调节激发端的频率，使其与实验源和谐振器检测端的频率相匹配。根据制造商的操作规程，调节谐振腔内的可变电容器来改变激发端的频率。
  2. 设置仪器控制台和主磁体
    1. 开启波谱仪，并选择一个以时间为横坐标的瞬态数据记录实验。
    2. 在软件中设置采样点数为65,536，时间基线为10 nsec。
    3. 对于强信号或窄信号，设置累加次数为10,000；对于宽信号或弱信号，设置累加次数为45,000。
    4. 在软件中按下“engage”按钮，将实验参数从软件发送至控制台，并启动主磁场磁体。
    5. 将主磁场强度设为9 mT。
    6. 将功率衰减旋钮设为50 dB，并开启7 W的高功率放大器。

4. 快速扫描实验的执行

注意：有关含BMPO-OH24、pH敏感型TAM自由基19,27和氧化还原敏感型二硝基氧化物28的模型样品分析的具体说明，已在相关文献中提供。

  1. 标准硝基氧化物样品的功率饱和
    注意：在相同的实验条件下，对标准的氮氧自由基样品进行功率饱和曲线测定，有助于后续对pH或氧化还原状态敏感的自由基进行检测。
    1. 打开快速扫描线圈驱动器，设置参数为第1节中的数值（扫描频率6.8 kHz，扫描宽度7 mT）。
    2. 从 50 dB 开始，采集具有 100k 次平均的快速扫描谱图。将衰减降低 3 dB 并重复测量。持续进行，直至衰减器设置为 0 dB，或直到电桥读数上的隔离测量值达到极限 < 0.
    3. 将原始快速扫描数据导入反卷积程序（例如使用 Matlab 编写的程序），并将原始数据处理为吸收光谱。
    4. 输入扫描频率、扫描宽度、数据点数和时基至程序中，并运行程序以将原始快速扫描信号处理为吸收信号。
    5. 将吸收信号的幅度作为入射到谐振器上的功率平方根（单位：瓦特）的函数进行绘图。在非饱和 regime 下，信号幅度与入射功率的平方根呈线性关系。
    6. 从 (0,0) 开始拟合一条趋势线，并包含所有落在线性响应区域内的数据点。在线性响应区域内，信号幅度随微波功率的平方根成正比增加。
    7. 将该趋势外推至更高功率，并比较电子顺磁共振（EPR）信号强度。选择信号幅度与外推趋势线偏差不超过3%的最高功率。为了确保快速扫描信号的解卷积能够正常进行，信号必须仍处于相对于入射功率的线性响应区域。
      注意：原始快速扫描数据的传输可通过网络连接或U盘进行。在此情况下，数据传输是必要的，因为用于处理原始数据的程序（Matlab）并未安装在运行数据采集软件的同一台计算机上。用于处理原始数据的解卷积算法在下文中有所描述。 29.

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

实验的产物是一组投影数据，这些数据被重建为二维（一个光谱维度，一个空间维度）图像，并采用伪彩色标度来表示信号强度。深蓝色表示基线，即无信号区域；绿色表示低强度信号，红色表示最高强度信号。沿x轴（光谱维度）的切片在磁场轴上显示电子顺磁共振信号（EPR跃迁）；沿y轴（空间维度），信号之间的分离对应于样品在谐振器中实际的空间距离。

图3展示了使用连续波（图3B）或快速扫描（图3A）技术对含有三种不同类型15N标记的氮氧自由基的模体所获得的两幅图像的比较（图3D）。其中谱线最宽的信号来自15N-Proxyl，这是一种在生理pH下带负电荷的五元吡咯烷环结构，该特性可能有助于将分子靶向特定的细胞区室。双峰信号属于15N-mHCTPO，其成因是在完全氘代背景下存在一个...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

快速扫描信号相较于连续波（CW）信号具有更高频率的组分，其所需的谐振器带宽更大，具体取决于谱线宽度、弛豫时间以及快速扫描的速度。特定实验所需的带宽由谱线宽度和磁场扫描速率共同决定（公式2）。该带宽需求还取决于所研究探针的弛豫时间（T2 和 T2*），且扫描速率较快时，信号的拖尾部分可能出现振荡。对于具有 T 的氮氧自由基2 ~500 纳秒，250 MHz（57th 落基山磁共振会议，Epel B 等，2015年），实验扫描速率通常不足以观察到任何振荡现象。

实验带宽通常受限于谐振腔带宽。快速扫描实验的每个半周期均在磁场/频率递减或递增的情况下记录，因此实验带宽为谐振腔带宽的½，如（公式1）所示。如果由于参数选择导致实验带宽超过谐振腔带宽，并且振荡被阻尼，则反卷积谱线将出现展宽。由于实验带宽由所研究自由基的扫描速率和线宽决定，因此理解这些特性是快速扫描实验的关键组成部分。

本方案展示了在250 MHz下对含有对氧气、黏度、p...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们没有需要披露的内容。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 NIBIB EB002807 和 CA177744（GRE 和 SSE）以及授予 GRE、Howard J. Halpern（项目负责人）的 P41 EB002034 项目，以及丹佛大学的资助，特此致谢。Mark Tseytlin 获得了 NIH R21 EB022775、NIH K25 EB016040 和 NIH/NIGMS U54GM104942 的支持。作者感谢现就职于西弗吉尼亚大学的 Valery Khramtsov 和俄亥俄州立大学的 Illirian Dhimitruka 在合成 pH 敏感 TAM 自由基方面提供的帮助，以及马里兰大学的 Gerald Rosen 和 Joseph Kao 在合成 mHCTPO、proxyl、BMPO 和硝酰基自由基方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-氧代-2,2,6,6-四(2H3)甲基-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)哌啶基氮氧自由基 (15N-PDT)CDN Isotopes M-232798% 原子 15N，98% 原子 D，魁北克，加拿大
4-1H-3-氨基甲酰基-2,2,5,5-四(2H3)甲基-3-吡咯烷基氮氧自由基 (15N-mHCTPO)N/AN/A在美国马里兰大学合成，详见参考文献29
3-羧基-2,2,5,5-四(2H3)甲基-1-(3,4,4-2H3,1-15N)吡咯烷基氮氧自由基 (15N-Proxyl)N/AN/A在美国马里兰大学合成，详见参考文献25
4 mm 石英 EPR 管Wilmad Glass707-SQ-100M
4-氧代-2,2,6,6-四(2H3)甲基-1-(3,3,5,5-2H4)哌啶基氮氧自由基 (14N-PDT)CDN IsotopesD-232898% 原子 D，魁北克，加拿大
pH 敏感三苯甲基自由基 (aTAM4)俄亥俄州立大学N/A在俄亥俄州立大学合成，详见参考文献26
磷酸二氢钾J.T. Baker Chemicals1-3246
6 mm 石英 EPR 管Wilmad GlassQ-5M-6M-0-250/RB
8 mm 石英 EPR 管Wilmad GlassQ-7M-8M-0-250/RB
5-叔丁氧羰基-5-甲基-1-吡咯啉-N-氧化物 (BMPO)N/AN/A在美国马里兰大学合成，详见参考文献30
过氧化氢西格玛奥德里奇H1009 SIGMA30%
16 mm 石英 EPR 管Wilmad Glass16-7PP-11QTZ
中压 450 W 紫外灯Hanovia679-A36新泽西州费尔菲尔德
L-谷胱甘肽（还原型）西格玛奥德里奇G470-5
亚硝基NAN/A在美国马里兰大学合成，详见参考文献31
氢氧化钠 J.T. Baker Chemicals1-3146

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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