需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

从迷你猪滑膜液和骨髓中分离间充质干细胞及其细胞表型分析

10.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/54077

⸱

2016年7月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Gyeongsang National University, 2PWG Genetics Pte Ltd.

本文内容

摘要

建立从迷你猪滑膜液和骨髓中分离间充质干细胞（MSCs）的方案，其中样本通过注射器抽吸无创采集。细胞分离后，采用流式细胞术进行细胞表型分析。 体外 骨髓和滑膜液来源的间充质干细胞的培养。

摘要

间充质干细胞（MSCs）已从多种组织来源分离建立，包括骨髓和滑膜液。近期研究表明，来源于滑膜液的MSCs具有多向分化潜能和免疫调节特性，提示这类细胞可用于组织工程及全身性治疗。本研究提供了一种简易且非侵入性的方法，用于分离小型猪骨髓和滑膜液来源的MSCs，并分析细胞表面标志物以进行细胞表型鉴定 体外 培养。采用性成熟的六个月大迷你猪，使用骨髓抽取器从髂嵴骨提取骨髓，并从股胫关节抽取滑膜液。两种来源样本的采集过程均为非侵入性操作。从获取的细胞来源中有效分离间充质干细胞（MSCs）以及建立 体外 提供了从小型猪中扩增稳定间充质干细胞（MSCs）的培养条件以及系统性自体治疗的应用方法。对于细胞表型分析，采用流式细胞术检测了两种细胞的细胞表面标志物。结果显示，从小型猪关节滑液中分离得到的MSCs在形态学特征和细胞表型方面与骨髓来源的MSCs相似。因此，通过非侵入方式获取的关节滑液是MSCs的一个有价值的来源。

引言

多能间充质干细胞（MSCs）可分化为间充质细胞谱系，目前已从多种组织来源中成功建立并分离出MSCs，例如骨髓、脐带、胎盘、脂肪组织、皮肤真皮、骨骼肌、毛囊、滑膜以及牙齿1-5。目前，滑膜来源的MSCs受到广泛关注，因为这些细胞可能有助于治疗关节疾病，如骨损伤、骨关节炎和类风湿性关节炎（RA），并且由于MSCs在受损软骨或骨组织中具有再生潜能，也可能用于免疫调节或自身免疫性疾病的治疗6-8。然而，目前大多数关于滑膜来源MSCs的研究主要采用来自滑膜组织而非滑液中的MSCs2,9；因此，对滑液来源MSCs的生物学特性了解仍较为有限。

滑膜液是一种易于获取的间充质干细胞（MSCs）来源，可在患者诊断或治疗过程中，以及在无需侵入性操作的各类关节炎（如骨关节炎或类风湿关节炎）确诊过程中通过穿刺获取。与非关节炎患者相比，关节炎患者的滑膜腔内滑膜液来源的间充质干细胞数量显著增加10-12因此，滑膜液是间充质干细胞（MSCs）的理想来源之一，尤其适用于关节炎症或损伤患者的自体干细胞治疗。此外，来源于滑膜液的间充质干细胞具有软骨形成能力、免疫调节功能以及较高的增殖速率。本研究建立了利用非侵入性方法从小型猪获取骨髓和滑膜液抽吸物的操作方案，并对 体外 分离细胞的扩增及细胞表型分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

动物实验已获得庆尚国立大学生物医学实验动物中心的批准。

1. 动物实验前的准备工作

  1. 为从骨髓和滑膜液中非侵入性采集间充质干细胞（MSCs），对成年雌性小型猪进行准备。在麻醉及采样前一日对小型猪进行临床检查。
    1. 提供临床正常的动物进行体格检查，包括体温、呼吸频率和心率，并观察动物行为及血液学状态，采用全血细胞计数检测。
      注：临床健康小型猪的参数范围为呼吸频率 11 - 29 次/分钟，心率 68 - 98 次/分钟，体温 37 - 38 °C。
  2. 在麻醉前 6 - 12 小时的禁食期间，将幼年和成年小型猪笼内的所有可食用垫料清除；新生仔猪应禁食 3 小时。饮水可供应至麻醉前。

2. 麻醉前动物的准备

  1. 在给予麻醉前，使用乙酰丙嗪（0.1 mg/kg）、美托咪啶（0.03 mg/kg）和阿托品（0.04 mg/kg）对小型猪进行术前给药。
    1. 使用21 G、长度至少30 mm的针头，通过肌肉注射（IM）方式给予所有药物。对成年小型猪，将肌肉注射部位选择在耳后1-3 cm处的侧颈肌或大腿肌。
      注意：所有操作均应避免引起动物恐惧或应激反应，不得粗暴操作，以确保术前给药的安全实施。
  2. 将小型猪置于仰卧位 。
  3. 术前给药15分钟后，通过吸入1.5%异氟烷开始麻醉。
    1. 通过气管插管持续吸入异氟烷（1.5%），随后将浓度增加至2.5%，以氧气（1.5 L/min）作为载气。
  4. 在麻醉期间持续监测小型猪的心率、体温及经皮血氧饱和度（SpO2）。使用循环水毯（温度维持在38 - 39 °C）以保持体温稳定。涂抹眼用软膏以防止麻醉期间眼睛干燥。
  5. 依据Guedel分期法评估麻醉深度13。

3. 细胞分离与培养的准备工作

  1. 为了培养来源于骨髓和滑膜液的间充质干细胞（MSCs），配制500 ml添加了10%胎牛血清（FBS）、1% Glutamax、10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）以及1.0%青霉素-链霉素（Pen-Strep，浓度分别为10,000 IU和10,000 µg/ml）的高级改良杜尔贝科培养基（ADMEM）。
    1. 将ADMEM置于CO2培养箱中，在38.5 °C、5% CO2的湿润环境中孵育。
  2. 根据制造商说明书配制500 ml杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS），用于细胞分离和洗涤。

4. 采集小型猪的骨髓

  1. 选择髂嵴上约 15 × 15 cm 的区域（图 1），使用无菌安全剃刀或电动剪毛器去除该区域的毛发。将小型猪固定体位后，依次使用聚维酮碘和 70% 乙醇交替擦洗手术部位各三次。待皮肤完全干燥后，铺无菌洞巾。
  2. 在抽取骨髓前，先用 3–4 ml 浓度为 100 U/ml 的肝素冲洗 10 ml 注射器，使其内壁预涂肝素，然后排出抗凝剂。
    注意：此步骤可防止骨髓穿刺过程中注射器内发生血液凝固。
  3. 在全身麻醉下，使用骨髓穿刺针（3.0 × 100 mm）连接已预涂肝素的 10 ml 注射器，从小型猪的髂嵴骨中抽取不少于 5 ml 的骨髓。

5. 骨髓提取细胞的分离 体外 培养

  1. 从提取的骨髓中分离细胞。
    1. 在室温下，用等体积的 DPBS 稀释提取的骨髓，置于 15 ml 圆锥形管中。
    2. 向 15 ml 圆锥形管中加入 3 ml 密度梯度离心介质（Ficoll-Paque）。
    3. 将 4 ml 骨髓用 DPBS 稀释后，小心地叠加在密度梯度离心介质上层而不混匀，然后在室温下以 400 × g 离心 40 分钟 。
    4. 收集位于血浆层（上层）与密度梯度离心介质层（下层）之间的白膜层中的单个核细胞（MNCs），并将 MNCs 转移至 15 ml 圆锥形管中。
    5. 用 7 - 8 ml DPBS 稀释转移后的 MNCs，并在室温下以 500 × g 离心 10 分钟 ，弃去上清液，并用 DPBS 洗涤细胞两次。
    6. 将细胞沉淀重悬于 2 ml ADMEM 中，转移至 35 mm 组织培养皿中。将培养皿置于含 5% CO2 的湿润环境中，38.5 °C 培养。
  2. 体外培养从骨髓中分离的细胞。
    1. 培养 48 小时后，吸除未贴壁的细胞及旧培养基，更换为 2 ml 新鲜 ADMEM，置于含 5% CO2 的湿润环境中 38.5 °C 培养。每三天更换一次培养基。
    2. 当细胞融合度达到 70 - 80% 时，用 DPBS 洗涤细胞，加入 1 ml 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 消化，在 37 °C 孵育 3 - 5 分钟，直至细胞脱落。
    3. 用 10 ml ADMEM 收集细胞，转移至 15 ml 圆锥形管中，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。
    4. 将收集的细胞重悬于 1 ml 新鲜 ADMEM 中，用血细胞计数板进行细胞计数。
    5. 将细胞接种至含 4 ml ADMEM 的 5 - 7.5 × 105/25T 培养瓶中，置于含 5% CO2 的湿润环境中 38.5 °C 培养。每三天更换一次培养基。

6. 采集小型猪的关节滑液

  1. 与骨髓穿刺操作类似，选择股关节处约15 × 10 cm（长/宽）的适当区域，使用无菌安全剃刀或电动剪毛器去除毛发，随后进行消毒处理（步骤4.1）。
  2. 在触诊确定解剖标志（髌骨和胫骨粗隆）后，将带有23 G针头的3 ml注射器插入关节腔。
    1. 轻柔抽吸注射器以采集关节内的滑膜液。从一个关节采集的滑膜液体积约为0.5–1 ml，但具体体积因小型猪个体或关节大小而异。若采集的滑膜液体积过小，可用DPBS冲洗滑膜腔。
    2. 立即拔出注射器，以避免血液污染。

7. 从采集的滑膜液中分离细胞 体外 培养

  1. 从抽吸的滑膜液中分离细胞。
    1. 在室温下，将抽吸出的滑膜液与等体积的DPBS加入15 ml锥形管中进行稀释。
    2. 为去除碎片，使用40 µm尼龙细胞滤网过滤稀释后的滑膜液。
    3. 向含有过滤后滑膜液的试管中加入10 ml DPBS，于室温下以400 × g离心10分钟。弃去上清液，并用DPBS将细胞洗涤两次。
    4. 将细胞沉淀重悬于2 ml ADMEM中，将细胞置于2-3 × 10⁵5 细胞/35 mm 组织培养皿中加入 2 ml ADMEM，在 38.5 °C、5% CO₂ 的湿润环境中培养2.
  2. 重复步骤 5.2 对于 体外 分离自滑膜液的间充质干细胞的培养

8. 小型猪术后护理

  1. 必要时，在骨髓采集完成后，使用皮肤缝合器以单针缝合封闭骨髓抽取器注射部位的皮肤。
  2. 手术完成后，每日一次，连续3天，向小型猪肌肉注射恩诺沙星（5 mg/kg）和美洛昔康（0.2 mg/kg）。
  3. 手术完成后，每日一次，连续3天，用0.1%聚维酮碘对骨髓及滑膜液采集部位进行消毒。每日仔细观察，监测是否出现并发症迹象（例如，肿胀、化脓或红肿）。

9. 使用流式细胞术进行细胞表型分析

  1. 当第3至5代的MSCs细胞融合度达到70 - 80%时，用DPBS洗涤细胞，并加入1 ml 0.25% (v/v) 胰蛋白酶/EDTA处理。随后在37 °C孵育3 - 5分钟，直至细胞脱落。
  2. 用10 ml DPBS收集细胞，转移至15 ml圆锥形离心管中，在室温下以300 × g离心5分钟。弃去上清液。
  3. 固定细胞：将细胞沉淀重悬于10 ml 3.7%甲醛溶液中，分析前在4 °C保存一天。
    1. 固定一天后，用DPBS洗涤细胞两次，每次以300 × g离心5分钟。弃去上清液。
    2. 将细胞沉淀重悬于4 ml含1% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）的DPBS中，4 °C孵育1小时，以阻断非特异性Fc介导的相互作用。
    3. 将500 µl细胞悬液分装至1.5 ml离心管中。
    4. 对于未标记的一抗（CD29和Vimentin），以300 × g离心3分钟洗涤细胞。弃去上清液。
    5. 将细胞沉淀重悬于500 µl按1:100稀释的一抗溶液中，4 °C孵育1小时。
    6. 用含1%牛血清白蛋白的DPBS洗涤细胞两次，每次以300 × g离心5分钟。弃去上清液。
    7. 将细胞沉淀重悬于500 µl按1:100稀释的异硫氰酸荧光素（FITC）标记的二抗溶液中，4 °C避光孵育1小时。
  4. 对于FITC标记的抗体（同型对照、CD34、CD44和CD45），以300 × g离心3分钟洗涤细胞。弃去上清液。
    1. 将细胞沉淀重悬于500 µl按1:100稀释的FITC标记抗体溶液中，4 °C避光孵育1小时。
    2. 对于上述两种染色条件，均用DPBS洗涤细胞两次，每次以300 × g离心5分钟。弃去上清液。
    3. 将细胞重悬于500 µl DPBS中，转移至5 ml圆底管，使用流式细胞仪8分析结果。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

建立源自小型猪骨髓和滑膜液的间充质干细胞

成功地从小型猪的骨髓和关节滑膜关节中分离出MSCs，并进行了扩增 体外 (图2）。关节液的注射器抽吸操作简便，且有可能获得足量的贴壁细胞 体外 原代细胞的培养。滑液来源的间充质干细胞（MSCs）形态与骨髓来源的间充质干细胞相似，两类MSCs均呈成纤维细胞样梭形，且均匀贴壁生长。在完成第三次传代培养后，观察到其碱性磷酸酶（AP）染色呈阳性表达。

评估小型猪骨髓和滑膜液来源的间充质干细胞的细胞表型

对细胞表面标志物进行检测，以建立小型猪骨髓...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

小型猪被用于建立从骨髓和滑膜液中分离间充质干细胞（MSCs）的方法。为消除年龄、性别和疾病等不同生理状况的影响，本研究选用遗传背景相同的供体小型猪，以准确评估细胞来源依赖性的特征。已知猪在解剖结构、生理特性和遗传背景方面与人类相似，特别是小型猪可产生与人类器官尺寸相匹配的组织，因此可作为异种移植的替代供体物种。14,15关于最近提出的间充质干细胞（MSCs）的免疫调节特性，吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）和一氧化氮合酶（NOS）被用于介导MSCs的免疫抑制作用，该作用具有物种特异性，尽管猪和人类的MSCs均表达相同的IDO9因此，以猪作为间充质干细胞（MSCs）供体的模型可能为MSCs在人类治疗中的免疫反应提供重要见解。此外，猪源干细胞的研究在生物学理解中也发挥着重要作用 体外 过程及其在人类中的各种临床前应用16,17骨髓和滑膜液可从迷你猪中无创采集。整个操作过程，从麻醉到样本采集，降低了全身或局部器官的应激水平；因此，迷你猪可作为自体移植的受体。在本实验中，根据先前研究中在类风湿关节炎小鼠模型中证实的滑膜液来源间充质干细胞具有免疫抑制能力，我们从迷你...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们衷心感谢韩国农村振兴厅下一代绿色生物21工程（项目编号：PJ007969）和韩国国家研究基金会（资助编号：NRF-2015R1D1A1A01056639）提供的经费支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高级杜尔贝科培养基’改良型伊格尔培养基（ADMEM）Gibco12491-023MSC培养基
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液（DPBS）Gibco14190-144无钙细胞洗涤液2+/毫克2+
胎牛血清（FBS）Gibco16000-044间充质干细胞培养基组分
GlutamaxGibco35050-061MSCs 培养基组分
青霉素/链霉素Gibco10378-016间充质干细胞培养基组分
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）SimgaF0291间充质干细胞培养基组分
牛血清白蛋白（BSA）SigmaA6003MSCs 培养基组分
胰蛋白酶-EDTAGibco25200-072细胞解离试剂 
β-巯基乙醇SigmaM7522间充质干细胞培养基组分
同型抗体BD PharmingenBD 550616同型对照
CD29 抗体BD PharmingenBD 552369整合素β1 间充质干细胞标志物
CD44抗体BD PharmingenBD 553133细胞表面糖蛋白MSCs标志物
CD45 抗体BD PharmingenBD 340664造血干细胞标志物
CD34 抗体BD PharmingenBD 555821造血干细胞标志物
CD90抗体BD PharmingenBD 555595Thy-1 膜糖蛋白 MSCs 标记物
MHC II 类抗体圣克鲁斯SC-32247抗原呈递细胞标志物
波形蛋白抗体SigmaSigma-S6389III型中间丝间充质干细胞标志物
碱性磷酸酶PromegaS38415-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（BCIP）与硝基蓝四氮唑（NBT）的混合物
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-1440-02密度梯度离心
细胞筛BD Falcon35234040 µm 尼龙细胞滤网
15 毫升聚苯乙烯锥形管BD Falcon351095样本采集与细胞分离
35 mm 培养皿Nunc153066细胞培养皿
骨髓抽取器德国医疗技术有限公司1145-1W010TrokaBone，3.0 x 100 mm
血细胞比容室Marinfeld640130细胞计数板
阿托品韩国Jeil制药公司硫酸阿托品水合物
乙酰丙嗪Samu 中位数，韩国麻醉前镇静及止吐药物
美托咪定辉瑞麻醉与镇痛药物
恩诺沙星拜耳医疗保健公司，德国抗生素
美洛昔康阿根廷兽医学领域抗炎镇痛药
异氟烷韩国韩雅公司吸入麻醉
聚维酮碘 韩国制药，韩国灭菌剂
乙醇SigmaE7023消毒剂
肝素SigmaH3393抗凝剂
甲醛SigmaF8775细胞固定剂
眼用软膏 辉瑞盐酸土霉素与硫酸多粘菌素B
循环水毯盖玛工业公司麻醉期间及麻醉后的加温系统
皮肤缝合器美国Covidien公司缝合皮肤闭合
一氧化碳2 培养箱Thermo Forma3111细胞培养设备
流式细胞仪BD 生物科学细胞分析仪
小型猪PWG Genetics Korea, Ltd.T型小型猪

参考文献

  1. Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 61 (4), 364-370 (2000).
  2. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: Superiority of synovium as a cell source. Arthritis Rheum. 52 (8), 2521-2529 (2005).
  3. De Coppi, P., et al. Amniotic fluid and bone marrow derived mesenchymal stem cells can be converted to smooth muscle cells in the cryo-injured rat bladder and prevent compensatory hypertrophy of surviving smooth muscle cells. J Urol. 177 (1), 369-376 (2007).
  4. Arufe, M. C., De la Fuente, A., Fuentes, I., de Toro, F. J., Blanco, F. J. Chondrogenic potential of subpopulations of cells expressing mesenchymal stem cell markers derived from human synovial membranes. J Cell Biochem. 111 (4), 834-845 (2010).
  5. Patil, R., et al. Multilineage potential and proteomic profiling of human dental stem cells derived from a single donor. Exp Cell Res. 320 (1), 92-107 (2013).
  6. Hatsushika, D., et al. Intra articular injection of synovial stem cells promotes meniscal regeneration in a rabbit massive meniscal defect model. J Orthop Res. 31 (9), 1354-1359 (2013).
  7. Hagmann, S., et al. The influence of bone marrow- and synovium-derived mesenchymal stromal cells from osteoarthritis patients on regulatory T cells in co-culture. ClinExpImmunol. 73 (3), 454-462 (2013).
  8. Lee, W. J., et al. Cell source-dependent in vivo immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs. Exp Cell Res. 333 (2), 273-288 (2015).
  9. Su, J., et al. Phylogenetic distinction of iNOS and IDO function in mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression in mammalian species. Cell Death Differ. 21 (3), 388-396 (2014).
  10. Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: Detection and functional evaluation at the single-cell level. Arthritis Rheum. 58 (6), 1731-1740 (2008).
  11. Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology (Oxford). 47 (8), 1137-1143 (2008).
  12. Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2011).
  13. John, T., Lerche, P. Anesthesia and analgesia for veterinary technicians. , Mosby Elsevier press. St. Louis, Missouri. (2011).
  14. Cooper, D. K., Gollackner, B., Sachs, D. H. Will the pig solve the transplantation backlog. Annu Rev Med. 53, 133-147 (2002).
  15. Millard, A. L., Mueller, N. J. Critical issues related to porcine xenograft exposure to human viruses: Lessons from allotransplantation. CurrOpin Organ Transplant. 15 (2), 230-235 (2010).
  16. Ringe, J., et al. Porcine mesenchymal stem cells. Induction of distinct mesenchymal cell lineages. Cell Tissue Res. 307 (3), 321-327 (2002).
  17. Petersen, B., Carnwath, J. W., Niemann, H. The perspectives for porcine-to-human xenografts. Comp Immunol Micro biol Infect Dis. 32 (2), 91-105 (2009).
  18. Zeng, L., et al. Multipotent adult progenitor cells from swine bone marrow. Stem Cells. 24 (11), 2355-2366 (2006).
  19. Zeng, L., et al. Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling. Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).
  20. Sekiya, I., et al. Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis. J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2012).
  21. Mochizuki, T., et al. Higher chondrogenic potential of fibrous synovium- and adipose synovium-derived cells compared with subcutaneous fat-derived cells: Distinguishing properties of mesenchymal stem cells in humans. Arthritis Rheum. 54 (3), 843-853 (2006).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

滑膜液间充质干细胞骨髓间充质干细胞小型猪间充质干细胞分离细胞表面标志物流式细胞术密度梯度离心体外培养自体治疗关节疾病模型
从迷你猪滑膜液和骨髓中分离间充质干细胞及其细胞表型分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。