从小型猪关节液和骨髓间充质干细胞的分离和细胞表型

Summary

提出了一种建立间充质干细胞 （MSCs） 的方案，该细胞从小型猪的滑液和骨髓中分离出来，并使用注射器抽吸无创收集。在细胞分离和体外培养来自 MSC 的骨髓和滑液后，使用流式细胞术进行细胞表型分析。

Abstract

间充质干细胞 （MSC） 是从各种组织来源（包括骨髓和滑液）中分离后建立的。最近，据报道，滑液衍生的 MSC 具有多谱系分化潜能和免疫调节特性，这表明这些细胞可用于组织工程和全身治疗。本研究提出了一种简单和无创分离源自小型猪骨髓和滑液的 MSC 的方案，以分析细胞表型和体外培养的细胞表面标志物。使用性成熟的 6 月龄小型猪，使用骨髓提取器从髂嵴骨中提取骨髓，并从股胫关节抽吸滑液。从两个来源收集样本的程序是无创的。提供了从收获的细胞来源中有效分离 MSC 和创造体外培养条件以从小型猪中扩增稳定 MSC 以及全身自体治疗应用的方案。对于细胞表型分析，使用流式细胞术分析两种细胞的细胞表面标志物。在结果中，从小型猪的滑液中分离出 MSCs，并显示滑液来源的 MSCs 具有与骨髓来源的 MSC 相似的形态和细胞表型。因此，无创获得的滑液是 MSC 的宝贵来源。

Introduction

多能间充质干细胞 （MSCs） 可分为间充质细胞谱系，MSC 已从各种组织来源建立和分离，例如来自骨髓、脐带、胎盘、脂肪组织、真皮皮肤、骨骼肌、毛囊、滑膜和牙齿^1-5。目前，人们已经关注滑膜衍生的 MSC，因为这些细胞可能有助于治疗关节疾病，如骨部分、骨关节炎和类风湿性关节炎 （RA），并且由于 MSC 在受损软骨或骨骼中的再生潜力，它们也可能有助于治疗免疫调节或自身免疫性疾病^6-8。大多数来自滑膜来源的 MSC 的研究都使用来自滑膜而不是滑液的 MSC^2,9;因此，对滑液衍生的 MSC 的生物学理解是有限的。

滑液是 MSC 的一种容易获得的来源，可以在患者的诊断或治疗期间以及在诊断确认不需要侵入性手术的各种关节炎疾病（如骨关节炎或 RA）期间抽吸。与非关节炎患者相比，关节炎患者滑膜腔中滑液衍生的 MSC 数量显着增加^10-12。因此，滑液是 MSC 的极好来源候选，特别是对于关节发炎或受伤患者的自体干细胞治疗。此外，滑液衍生的 MSC 具有软骨生成能力、免疫调节能力和高增殖速率。本研究建立了使用非侵入性方法从小型猪中提取骨髓和滑液抽吸以及分离细胞的体外扩增和细胞表型分析的方案。

....

Protocol

动物实验由动物中心生物医学实验在庆尚大学授权。

1.准备动物操作

1. 制备成年女性小型猪用于从骨髓和滑液MSCs的非侵入性集合。执行小型猪前一天麻醉和样品采集的临床检查。
   1. 为身体检查，包括体温，呼吸率，和心脏速率，以及用于猪的行为和血液状态的观察，使用全血计数测试提供临床正常的动物。
      注意:对于临床健康小型猪参数间隔是11 - 29 /对呼吸速率分钟，68 - 98 /对心脏速率分钟，和37 - 38℃的体温。
2. 除去在6术前禁食期间从笼子里食用的床上用品 - 12小时PRIOR以麻醉的年轻和成年小型猪的管理，禁食3小时应为新生儿进行观察。提供饮用水直到麻醉的时间。

2.动物麻醉的制备

1. 麻醉与乙酰丙嗪（0.1毫克/千克），美托咪定（0.03毫克/千克），阿托品（0.04毫克/千克）给药前用药的小型猪。
   1. 注入使用21g的针与成人小型猪至少30毫米的长度的所有药物肌内（IM）。执行IM注射耳后1-3厘米的横向颈肌或进入大腿肌肉。
      注:没有引发恐惧或紧张在动物或要求粗糙处理安全注射术前用药执行所有程序。
2. 放置小型猪在背卧位。
3. 术前用药的的行政管理15分钟后，用启动1.5％异氟烷麻醉管理吸入istered。

Results

从骨髓和小型猪的关节液充质干细胞的建立

的MSC已成功地从骨髓和小型猪的关节滑液关节中分离，并在体外扩增（ 图2）。滑液的注射器抽吸简单，并且有可能在原代细胞的体外培养过程中，以获得足够的粘附细胞。滑膜液衍生的MSC的形态类似于骨髓衍生的MSC的，两者的MSC具有成纤维纺锤形且均匀粘附。他们观察到对碱性磷酸酶（AP）染色一阳性表达，所述第三传代培养完成后。

从骨髓及关节液充质干细胞的细胞表型的评价小型猪

进行的细胞表面标记物的测定，以创建小型猪的骨髓和滑膜液.......

Discussion

小型猪被用于从骨髓及关节液的MSCs建立隔离。为了消除各种生理条件，诸如年龄，性别和疾病，从同基因背景供体小型猪被选为正确地评价单元源依赖表征。猪是已知的解剖学，生理学和基因与人类相似，并且特别地，小型猪可以产生大小匹配器官;因此，它们可以作为一个替代供体物种为异种移植^14,15。关于干细胞，吲哚胺2,3双加氧酶（IDO）和一氧化氮合酶（NOS）的最近建议的免疫调节特性用的MSC用于介导的免疫抑制，这是物种特异性的，虽然从猪和人的MSCs具有相同的IDO ⁹ 。因此，猪模型作为干细胞供者可能提供干细胞为人类治疗的免疫反应的重要见解。此外，猪干的研究细胞起着体外过程和人类^16,17它们的各种临床前应用的生物学理解的重要作用。骨髓和滑液可以非侵入性地从小型猪收获。整个过程，从麻醉样品采集，降低的全身或局部器官的应力水平;因此，小型猪可以用作接收者自体移植。在这个实验中，干细胞是从骨髓和小型猪的滑液中分离的基础上，以从RA小鼠模型在先前的研究中得出的免疫抑制能力滑膜液衍生的MSC的确认⁸

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
高级 Dulbecco's 改良 Eagle 培养基 （ADMEM）	Gibco	12491-023	MSC 培养基
Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）	Gibco	14190-144	细胞洗涤培养基，不含 Ca2+/Mg2+
胎牛血清 （FBS）	Gibco	16000-044	MSCs 培养基
的成分 Glutamax	Gibco	35050-061	MSCs 培养基的成分
青霉素/链霉素	Gibco	10378-016	MSCs 培养基的成分
碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）	Simga	F0291	MSCs 培养基的成分
血清白蛋白 （BSA）	Sigma	A6003	MSCs 培养基的成分
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-072	细胞解离试剂
&β;-巯基乙醇	Sigma	M7522	MSCs培养基的成分
种型抗体	BD Pharmingen	BD 550616	同种型对照
CD29抗体	BD Pharmingen	BD 552369	整合素β-1 MSCs标志物
CD44	BD Pharmingen	BD 553133	细胞表面糖蛋白MSCs标志物
CD45	BD Pharmingen	BD 340664	造血干细胞标志物
CD34 抗体	BD Pharmingen	BD 555821	造血干细胞标志物
CD90 抗体	BD Pharmingen	BD 555595	Thy-1 膜糖蛋白 MSCs 标志物
MHC II 类抗体	Santa Cruz	SC-32247	抗原呈递细胞标志物
波形蛋白抗体	Sigma	Sigma-S6389	III 型中间丝 MSCs 标志物
碱性磷酸酶	Promega	S3841	5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐 （BCIP） 和硝基蓝四唑 （NBT） 的混合物
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	密度梯度离心
细胞过滤器	BD Falcon	352340	40 µm 尼龙细胞过滤器
15 ml 聚苯乙烯锥形管	BD Falcon	351095	样品采集和细胞分离
35 mm 培养皿	Nunc	153066	细胞培养皿
骨髓提取器	GmbH Medizintechnologie， Germany	1145-1W010	TrokaBone，3.0 x 100 mm
血细胞比容室	Marinfeld	640130	细胞计数室
韩国阿托品	Jeil Pharmaceutical Co		阿托品水合物
安赛丙嗪	Samu Median，韩国		麻醉前镇静和止吐药
美托咪定	辉瑞		麻醉和镇痛药
恩诺沙星	拜耳医疗保健，德国		抗生素
美洛昔康	Over 兽药，		抗炎镇痛药
异氟醚	Hana pharm，韩国		吸入麻醉
聚维酮碘	韩国制药 韩国		灭菌剂
乙醇	Sigma	E7023	灭菌剂
肝素	Sigma	H3393	抗凝剂
甲醛	Sigma	F8775	细胞固定剂
眼药膏	辉瑞		盐酸土霉素 含硫酸多粘菌素 B
循环水毯	Gaymar Industries		麻醉期间和麻醉后的加温系统
吻合器	美国科维恩		缝合皮肤闭合
CO2 培养箱	Thermo Forma	3111	细胞培养设备
流式细胞仪	BD Biosciences		细胞分析仪
Minipig	PWG Genetics Korea， Ltd.	T 型	微型清管器