建立从迷你猪滑膜液和骨髓中分离间充质干细胞（MSCs）的方案，其中样本通过注射器抽吸无创采集。细胞分离后，采用流式细胞术进行细胞表型分析。 体外 骨髓和滑膜液来源的间充质干细胞的培养。
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摘要
摘要
间充质干细胞（MSCs）已从多种组织来源分离建立，包括骨髓和滑膜液。近期研究表明，来源于滑膜液的MSCs具有多向分化潜能和免疫调节特性，提示这类细胞可用于组织工程及全身性治疗。本研究提供了一种简易且非侵入性的方法，用于分离小型猪骨髓和滑膜液来源的MSCs，并分析细胞表面标志物以进行细胞表型鉴定 体外 培养。采用性成熟的六个月大迷你猪，使用骨髓抽取器从髂嵴骨提取骨髓，并从股胫关节抽取滑膜液。两种来源样本的采集过程均为非侵入性操作。从获取的细胞来源中有效分离间充质干细胞（MSCs）以及建立 体外 提供了从小型猪中扩增稳定间充质干细胞（MSCs）的培养条件以及系统性自体治疗的应用方法。对于细胞表型分析，采用流式细胞术检测了两种细胞的细胞表面标志物。结果显示，从小型猪关节滑液中分离得到的MSCs在形态学特征和细胞表型方面与骨髓来源的MSCs相似。因此，通过非侵入方式获取的关节滑液是MSCs的一个有价值的来源。
引言
多能间充质干细胞（MSCs）可分化为间充质细胞谱系，目前已从多种组织来源中成功建立并分离出MSCs，例如骨髓、脐带、胎盘、脂肪组织、皮肤真皮、骨骼肌、毛囊、滑膜以及牙齿1-5。目前，滑膜来源的MSCs受到广泛关注，因为这些细胞可能有助于治疗关节疾病，如骨损伤、骨关节炎和类风湿性关节炎（RA），并且由于MSCs在受损软骨或骨组织中具有再生潜能，也可能用于免疫调节或自身免疫性疾病的治疗6-8。然而，目前大多数关于滑膜来源MSCs的研究主要采用来自滑膜组织而非滑液中的MSCs2,9；因此，对滑液来源MSCs的生物学特性了解仍较为有限。
滑膜液是一种易于获取的间充质干细胞（MSCs）来源，可在患者诊断或治疗过程中，以及在无需侵入性操作的各类关节炎（如骨关节炎或类风湿关节炎）确诊过程中通过穿刺获取。与非关节炎患者相比，关节炎患者的滑膜腔内滑膜液来源的间充质干细胞数量显著增加10-12因此，滑膜液是间充质干细胞（MSCs）的理想来源之一，尤其适用于关节炎症或损伤患者的自体干细胞治疗。此外，来源于滑膜液的间充质干细胞具有软骨形成能力、免疫调节功能以及较高的增殖速率。本研究建立了利用非侵入性方法从小型猪获取骨髓和滑膜液抽吸物的操作方案，并对 体外 分离细胞的扩增及细胞表型分析。
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方案
动物实验已获得庆尚国立大学生物医学实验动物中心的批准。
1. 动物实验前的准备工作
- 为从骨髓和滑膜液中非侵入性采集间充质干细胞（MSCs），对成年雌性小型猪进行准备。在麻醉及采样前一日对小型猪进行临床检查。
- 提供临床正常的动物进行体格检查，包括体温、呼吸频率和心率，并观察动物行为及血液学状态，采用全血细胞计数检测。
注：临床健康小型猪的参数范围为呼吸频率 11 - 29 次/分钟，心率 68 - 98 次/分钟，体温 37 - 38 °C。
- 提供临床正常的动物进行体格检查，包括体温、呼吸频率和心率，并观察动物行为及血液学状态，采用全血细胞计数检测。
- 在麻醉前 6 - 12 小时的禁食期间，将幼年和成年小型猪笼内的所有可食用垫料清除；新生仔猪应禁食 3 小时。饮水可供应至麻醉前。
2. 麻醉前动物的准备
- 在给予麻醉前，使用乙酰丙嗪（0.1 mg/kg）、美托咪啶（0.03 mg/kg）和阿托品（0.04 mg/kg）对小型猪进行术前给药。
- 使用21 G、长度至少30 mm的针头，通过肌肉注射（IM）方式给予所有药物。对成年小型猪，将肌肉注射部位选择在耳后1-3 cm处的侧颈肌或大腿肌。
注意：所有操作均应避免引起动物恐惧或应激反应，不得粗暴操作，以确保术前给药的安全实施。
- 使用21 G、长度至少30 mm的针头，通过肌肉注射（IM）方式给予所有药物。对成年小型猪，将肌肉注射部位选择在耳后1-3 cm处的侧颈肌或大腿肌。
- 将小型猪置于仰....
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结果
建立源自小型猪骨髓和滑膜液的间充质干细胞
成功地从小型猪的骨髓和关节滑膜关节中分离出MSCs，并进行了扩增 体外 (图2）。关节液的注射器抽吸操作简便，且有可能获得足量的贴壁细胞 体外 原代细胞的培养。滑液来源的间充质干细胞（MSCs）形态与骨髓来源的间充质干细胞相似，两类MSCs均呈成纤维细胞样梭形，且均匀贴壁生长。在完成第三次传代培养后，观察到其碱性磷酸酶（AP）染色呈阳性表达。
评估小型猪骨髓和滑膜液来源的间充质干细胞的细胞表型
对细胞表面标志物进行检测，以建立小型猪骨髓.......
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讨论
小型猪被用于建立从骨髓和滑膜液中分离间充质干细胞（MSCs）的方法。为消除年龄、性别和疾病等不同生理状况的影响，本研究选用遗传背景相同的供体小型猪，以准确评估细胞来源依赖性的特征。已知猪在解剖结构、生理特性和遗传背景方面与人类相似，特别是小型猪可产生与人类器官尺寸相匹配的组织，因此可作为异种移植的替代供体物种。14,15关于最近提出的间充质干细胞（MSCs）的免疫调节特性，吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）和一氧化氮合酶（NOS）被用于介导MSCs的免疫抑制作用，该作用具有物种特异性，尽管猪和人类的MSCs均表达相同的IDO9因此，以猪作为间充质干细胞（MSCs）供体的模型可能为MSCs在人类治疗中的免疫反应提供重要见解。此外，猪源干细胞的研究在生物学理解中也发挥着重要作用 体外 过程及其在人类中的各种临床前应用16,17骨髓和滑膜液可从迷你猪中无创采集。整个操作过程，从麻醉到样本采集，降低了全身或局部器官的应激水平；因此，迷你猪可作为自体移植的受体。在本实验中，根据先前研究中在类风湿关节炎小鼠模型中证实的滑膜液来源间充质干细胞具有免疫抑制能力，我们从迷你.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们衷心感谢韩国农村振兴厅下一代绿色生物21工程（项目编号：PJ007969）和韩国国家研究基金会（资助编号：NRF-2015R1D1A1A01056639）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高级杜尔贝科培养基’改良型伊格尔培养基（ADMEM） | Gibco | 12491-023 | MSC培养基 |
| 杜尔贝科’磷酸盐缓冲液（DPBS） | Gibco | 14190-144 | 无钙细胞洗涤液2+/毫克2+ |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 16000-044 | 间充质干细胞培养基组分 |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | MSCs 培养基组分 |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 10378-016 | 间充质干细胞培养基组分 |
| 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | Simga | F0291 | 间充质干细胞培养基组分 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A6003 | MSCs 培养基组分 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-072 | 细胞解离试剂 |
| β-巯基乙醇 | Sigma | M7522 | 间充质干细胞培养基组分 |
| 同型抗体 | BD Pharmingen | BD 550616 | 同型对照 |
| CD29 抗体 | BD Pharmingen | BD 552369 | 整合素β1 间充质干细胞标志物 |
| CD44抗体 | BD Pharmingen | BD 553133 | 细胞表面糖蛋白MSCs标志物 |
| CD45 抗体 | BD Pharmingen | BD 340664 | 造血干细胞标志物 |
| CD34 抗体 | BD Pharmingen | BD 555821 | 造血干细胞标志物 |
| CD90抗体 | BD Pharmingen | BD 555595 | Thy-1 膜糖蛋白 MSCs 标记物 |
| MHC II 类抗体 | 圣克鲁斯 | SC-32247 | 抗原呈递细胞标志物 |
| 波形蛋白抗体 | Sigma | Sigma-S6389 | III型中间丝间充质干细胞标志物 |
| 碱性磷酸酶 | Promega | S3841 | 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（BCIP）与硝基蓝四氮唑（NBT）的混合物 |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | 密度梯度离心 |
| 细胞筛 | BD Falcon | 352340 | 40 µm 尼龙细胞滤网 |
| 15 毫升聚苯乙烯锥形管 | BD Falcon | 351095 | 样本采集与细胞分离 |
| 35 mm 培养皿 | Nunc | 153066 | 细胞培养皿 |
| 骨髓抽取器 | 德国医疗技术有限公司 | 1145-1W010 | TrokaBone，3.0 x 100 mm |
| 血细胞比容室 | Marinfeld | 640130 | 细胞计数板 |
| 阿托品 | 韩国Jeil制药公司 | 硫酸阿托品水合物 | |
| 乙酰丙嗪 | Samu 中位数，韩国 | 麻醉前镇静及止吐药物 | |
| 美托咪定 | 辉瑞 | 麻醉与镇痛药物 | |
| 恩诺沙星 | 拜耳医疗保健公司，德国 | 抗生素 | |
| 美洛昔康 | 阿根廷兽医学领域 | 抗炎镇痛药 | |
| 异氟烷 | 韩国韩雅公司 | 吸入麻醉 | |
| 聚维酮碘 | 韩国制药，韩国 | 灭菌剂 | |
| 乙醇 | Sigma | E7023 | 消毒剂 |
| 肝素 | Sigma | H3393 | 抗凝剂 |
| 甲醛 | Sigma | F8775 | 细胞固定剂 |
| 眼用软膏 | 辉瑞 | 盐酸土霉素与硫酸多粘菌素B | |
| 循环水毯 | 盖玛工业公司 | 麻醉期间及麻醉后的加温系统 | |
| 皮肤缝合器 | 美国Covidien公司 | 缝合皮肤闭合 | |
| 一氧化碳2 培养箱 | Thermo Forma | 3111 | 细胞培养设备 |
| 流式细胞仪 | BD 生物科学 | 细胞分析仪 | |
| 小型猪 | PWG Genetics Korea, Ltd. | T型 | 小型猪 |
参考文献
- Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 61 (4), 364-370 (2000).
- Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T.
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重印与许可
