从小型猪关节液和骨髓间充质干细胞的分离和细胞表型

摘要

提出了一种建立间充质干细胞 （MSCs） 的方案，该细胞从小型猪的滑液和骨髓中分离出来，并使用注射器抽吸无创收集。在细胞分离和体外培养来自 MSC 的骨髓和滑液后，使用流式细胞术进行细胞表型分析。

摘要

间充质干细胞 （MSC） 是从各种组织来源（包括骨髓和滑液）中分离后建立的。最近，据报道，滑液衍生的 MSC 具有多谱系分化潜能和免疫调节特性，这表明这些细胞可用于组织工程和全身治疗。本研究提出了一种简单和无创分离源自小型猪骨髓和滑液的 MSC 的方案，以分析细胞表型和体外培养的细胞表面标志物。使用性成熟的 6 月龄小型猪，使用骨髓提取器从髂嵴骨中提取骨髓，并从股胫关节抽吸滑液。从两个来源收集样本的程序是无创的。提供了从收获的细胞来源中有效分离 MSC 和创造体外培养条件以从小型猪中扩增稳定 MSC 以及全身自体治疗应用的方案。对于细胞表型分析，使用流式细胞术分析两种细胞的细胞表面标志物。在结果中，从小型猪的滑液中分离出 MSCs，并显示滑液来源的 MSCs 具有与骨髓来源的 MSC 相似的形态和细胞表型。因此，无创获得的滑液是 MSC 的宝贵来源。

引言

多能间充质干细胞 （MSCs） 可分为间充质细胞谱系，MSC 已从各种组织来源建立和分离，例如来自骨髓、脐带、胎盘、脂肪组织、真皮皮肤、骨骼肌、毛囊、滑膜和牙齿^1-5。目前，人们已经关注滑膜衍生的 MSC，因为这些细胞可能有助于治疗关节疾病，如骨部分、骨关节炎和类风湿性关节炎 （RA），并且由于 MSC 在受损软骨或骨骼中的再生潜力，它们也可能有助于治疗免疫调节或自身免疫性疾病^6-8。大多数来自滑膜来源的 MSC 的研究都使用来自滑膜而不是滑液的 MSC^2,9;因此，对滑液衍生的 MSC 的生物学理解是有限的。

滑液是 MSC 的一种容易获得的来源，可以在患者的诊断或治疗期间以及在诊断确认不需要侵入性手术的各种关节炎疾病（如骨关节炎或 RA）期间抽吸。与非关节炎患者相比，关节炎患者滑膜腔中滑液衍生的 MSC 数量显着增加^10-12。因此，滑液是 MSC 的极好来源候选，特别是对于关节发炎或受伤患者的自体干细胞治疗。此外，滑液衍生的 MSC 具有软骨生成能力、免疫调节能力和高增殖速率。本研究建立了使用非侵入性方法从小型猪中提取骨髓和滑液抽吸以及分离细胞的体外扩增和细胞表型分析的方案。

方案

动物实验由动物中心生物医学实验在庆尚大学授权。

1.准备动物操作

1. 制备成年女性小型猪用于从骨髓和滑液MSCs的非侵入性集合。执行小型猪前一天麻醉和样品采集的临床检查。
   1. 为身体检查，包括体温，呼吸率，和心脏速率，以及用于猪的行为和血液状态的观察，使用全血计数测试提供临床正常的动物。
      注意:对于临床健康小型猪参数间隔是11 - 29 /对呼吸速率分钟，68 - 98 /对心脏速率分钟，和37 - 38℃的体温。
2. 除去在6术前禁食期间从笼子里食用的床上用品 - 12小时PRIOR以麻醉的年轻和成年小型猪的管理，禁食3小时应为新生儿进行观察。提供饮用水直到麻醉的时间。

2.动物麻醉的制备

1. 麻醉与乙酰丙嗪（0.1毫克/千克），美托咪定（0.03毫克/千克），阿托品（0.04毫克/千克）给药前用药的小型猪。
   1. 注入使用21g的针与成人小型猪至少30毫米的长度的所有药物肌内（IM）。执行IM注射耳后1-3厘米的横向颈肌或进入大腿肌肉。
      注:没有引发恐惧或紧张在动物或要求粗糙处理安全注射术前用药执行所有程序。
2. 放置小型猪在背卧位。
3. 术前用药的的行政管理15分钟后，用启动1.5％异氟烷麻醉管理吸入istered。
   1. 继续异氟烷（1.5％），通过气管内管的吸入，随后至2.5％的增加的浓度，与氧气（1.5升/分钟）作为载气。
4. 连续监测麻醉期间小型猪的心脏速率，体温，和经皮血氧饱和度（SPO _2）。在38的温度使用循环水毯 - 39℃，保持体温。应用眼科软膏，以保护眼睛免受麻醉过程中干燥。
5. 遵循Guedel的评估麻醉¹³的深度分类。

3.筹备细胞分离培养

1. 培养从骨髓和滑液衍生的MSC，制成500毫升之先进的Dulbecco补充有10％胎牛血清（FBS）的改良Eagle培养基（ADMEM），1％Glutamax的，10纳克/毫升碱性成纤维细胞生长事实上的R（bFGF）的，和1.0％青霉素 - 链霉素（10,000 IU和10,000微克/毫升，分别青霉素 - 链霉素）。
   1. 孵育在38.5℃下的ADMEM中的5％的CO ₂的CO ₂培养箱内的潮湿气氛中。
2. 根据制造商的细胞的分离和洗涤说明制成500毫升之Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中。

4.从小型猪采集骨髓

1. 选择一个区域约15×15厘米的上髂嵴（ 图1）的大小，并使用无菌安全剃刀或电动推剪此区域移除毛发。一旦小型猪被定位，交替地擦洗过程现场用下面灭菌剂三次:聚维酮碘和70％乙醇。该区域是完全干燥后，将无菌单。
2. 预涂层10毫升注射器用100 U / ml肝素通过与3漂洗 - 第4毫升肝素ejec前廷抗凝结剂。
   注:执行此步骤，以避免骨髓穿刺过程中注射器凝固。
3. 提取最少5毫升从麻醉下的小型猪的髂骨的骨髓，采用了骨髓提取器（3.0×100毫米）紧紧地贴在肝素预涂-10毫升注射器。

5.分离细胞从骨髓和体外培养提取

1. 隔离从提取骨髓细胞。
   1. 稀释所提取的骨髓与等体积的DPBS中的15毫升锥形管中，在室温。
   2. 添加3毫升密度离心介质（菲可 - 帕克）与15毫升锥形管中。
   3. 稀释骨髓用DPBS，它被放置在密度离心介质上不混合的4ml的层，和离心机它在400×g下在室温下40分钟。
   4. 收获的单核细胞的层由含有等离子体（顶层）和密度离心培养基（下层）的两层之间的血沉棕黄层（跨国公司）和跨国公司转移入15ml锥形管中。
   5. 稀释转印跨国公司7 - 8毫升DPBS中，并在500×g下离心它们在室温下10分钟。弃去上清液并用DPBS洗涤细胞两次。
   6. 暂停在2ml ADMEM的细胞沉淀，并将其转移到35毫米组织培养皿中。孵育在38.5℃下的培养皿中，5％CO ₂的潮湿气氛中。
2. 在从骨髓中分离细胞的体外培养。
   1. 48小时后，吸与未附着到培养皿的细胞的培养基，并更换2毫升ADMEM的和在5％CO ₂的潮湿气氛中，在38.5℃培养了。改变介质的每第三天。
   2. 在70 - 80％汇合，洗细胞用DPBS，用1ml的0.25％离解他们胰蛋白酶/ EDTA，并在37℃下进行3孵育他们 - 5分钟，直到细胞分离。
   3. 收获用10ml ADMEM的细胞，将它们转移到15毫升锥形管，并在300×g下离心它们在室温下5分钟。弃去上清液。
   4. 暂停收获的细胞在1ml新鲜ADMEM并使用血细胞计数器计数。
   5. 放置细胞在5 -含4毫升ADMEM的7.5×10 ⁵ / 25T烧瓶中并在5％CO ₂的潮湿气氛中，在38.5℃培养它们。改变介质每三天。

6.收集滑膜从小型猪流

1. 类似于骨髓穿刺的过程中，选择大约15×10厘米（长/宽）在股关节适当的区域，并用消毒安全剃刀或电动推子除去毛，用消毒过程（步骤4.1）跟随。
2. 将3毫升注射器用23​​政进针触诊地标（髌骨和胫骨嵴）后的联合。
   1. 适用于温和抽吸到注射器滑液在关节的愿望。从关节收集滑液的近似体积为0.5 - 1毫升，但根据该小型猪或接头的大小这一变化。通过DPBS中的滑膜腔冲洗如果滑液的收集体积太小。
   2. 立即撤销注射器以避免血液污染。

7.从收集的滑液和体外培养细胞分离

1. 隔离从送气滑液细胞。
   1. 稀释吸滑液与等体积的DPBS中的15毫升锥形管中，在室温。
   2. 要清除杂物，使用40微米尼龙细胞滤网过滤稀释的滑液。
   3. 10毫升DPBS添加到含有过滤滑膜管流体并在400×g下在室温下10分钟离心它。弃去上清液并用DPBS洗涤细胞两次。
   4. 暂停在2ml ADMEM的细胞沉淀，将细胞在2 - 3×10 ⁵细胞/ 35mm组织培养皿用2ml ADMEM中，并在5％CO ₂的潮湿气氛中，在38.5℃下孵育他们。
2. 重复步骤5.2隔离滑液间充质干细胞体外培养。

在小型猪的8后过程护理

1. 如果需要的话，关闭皮肤在骨髓提取注射部位用一皮肤缝合器的单个缝合，骨髓采集后。
2. 在这个步骤完成后，辖恩诺沙星（5毫克/千克）和美洛昔康（0.2毫克/千克）的肌内注射到小型猪每天一次连续3天。
3. 在这个步骤完成后，消毒骨髓和滑液采集部位用0.1％聚维酮碘一次，连续3天。仔细观察每天监测并发症的迹象（ 如红肿，脓，或发红）。

9.细胞表型采用流式细胞仪

1. 当干细胞是70 - 在通道3 80％汇合 - 5，用DPBS洗涤细胞并用1ml的0.25％（V / V）胰蛋白酶/ EDTA处理它们。然后，在37℃下进行3孵育他们 - 5分钟，直到细胞分离。
2. 收获用10ml DPBS的细胞，将它们转移到15毫升锥形管，并在300×g下离心它们在室温下5分钟。弃去上清液。
3. 以固定细胞，悬浮在10毫升3.7％的甲醛溶液的细胞沉淀并保持在4℃下用于分析的前一天。
   1. 定影后一天，洗涤细胞用DPBS两次使用离心分离，在300×g下，每次5分钟。弃去上清液。
   2. 暂停在4ml细胞沉淀的DPBS，其补充有1％（重量/体积）牛血清白蛋白（BSA），并孵育沉淀1小时，在4℃下以阻止非特异性的Fc介导的相互作用。
   3. 分发的细胞悬液500μl的等分入1.5毫升管中。
   4. 对于非共轭抗体（CD29和波形蛋白），在300×g下洗涤细胞离心3分钟。弃去上清液。
   5. 暂停在500微升1的细胞团:100稀释的第一抗体，并在4℃下孵育其1小时。
   6. 在300×g下离心，用1％牛血清白蛋白洗涤细胞两次，每次5分钟。弃去上清液。
   7. 暂停在500微升1的细胞团:100稀释的异硫氰酸荧光素（FITC）的缀合的二级抗体并在4℃下孵育其1小时在黑暗中。
4. 在FITC标记的抗体（同种型，CD34，CD44和CD45），由centrifu洗细胞gation在300×g下3分钟。弃去上清液。
   1. 暂停在500微升1的细胞团:100 FITC缀合的抗体，并在4℃下孵育其1小时在黑暗中。
   2. 对于这两种染色的条件下，在300×g下通过离心洗涤细胞两次用DPBS，每次5分钟。弃去上清液。
   3. 悬浮细胞于500μl的DPBS，将它们转移到一个5毫升的圆底管中，并使用流式细胞仪⁸分析结果。

结果

从骨髓和小型猪的关节液充质干细胞的建立

的MSC已成功地从骨髓和小型猪的关节滑液关节中分离，并在体外扩增（ 图2）。滑液的注射器抽吸简单，并且有可能在原代细胞的体外培养过程中，以获得足够的粘附细胞。滑膜液衍生的MSC的形态类似于骨髓衍生的MSC的，两者的MSC具有成纤维纺锤形且均匀粘附。他们观察到对碱性磷酸酶（AP）染色一阳性表达，所述第三传代培养完成后。

从骨髓及关节液充质干细胞的细胞表型的评价小型猪

进行的细胞表面标记物的测定，以创建小型猪的骨髓和滑膜液...

讨论

小型猪被用于从骨髓及关节液的MSCs建立隔离。为了消除各种生理条件，诸如年龄，性别和疾病，从同基因背景供体小型猪被选为正确地评价单元源依赖表征。猪是已知的解剖学，生理学和基因与人类相似，并且特别地，小型猪可以产生大小匹配器官;因此，它们可以作为一个替代供体物种为异种移植^14,15。关于干细胞，吲哚胺2,3双加氧酶（IDO）和一氧化氮合酶（NOS）的最近建议的免疫调节特性用的MSC用于介导的免疫抑制，这是物种特异性的，虽然从猪和人的MSCs具有相同的IDO ⁹ 。因此，猪模型作为干细胞供者可能提供干细胞为人类治疗的免疫反应的重要见解。此外，猪干的研究细胞起着体外过程和人类^16,17它们的各种临床前应用的生物学理解的重要作用。骨髓和滑液可以非侵入性地从小型猪收获。整个过程，从麻醉样品采集，降低的全身或局部器官的应力水平;因此，小型猪可以用作接收者自体移植。在这个实验中，干细胞是从骨髓和小型猪的滑液中分离的基础上，以从RA小鼠模型在先前的研究中得出的免疫抑制能力滑膜液衍生的MSC的确认⁸

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高级 Dulbecco's 改良 Eagle 培养基 （ADMEM）	Gibco	12491-023	MSC 培养基
Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）	Gibco	14190-144	细胞洗涤培养基，不含 Ca2+/Mg2+
胎牛血清 （FBS）	Gibco	16000-044	MSCs 培养基
的成分 Glutamax	Gibco	35050-061	MSCs 培养基的成分
青霉素/链霉素	Gibco	10378-016	MSCs 培养基的成分
碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）	Simga	F0291	MSCs 培养基的成分
血清白蛋白 （BSA）	Sigma	A6003	MSCs 培养基的成分
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-072	细胞解离试剂
&β;-巯基乙醇	Sigma	M7522	MSCs培养基的成分
种型抗体	BD Pharmingen	BD 550616	同种型对照
CD29抗体	BD Pharmingen	BD 552369	整合素β-1 MSCs标志物
CD44	BD Pharmingen	BD 553133	细胞表面糖蛋白MSCs标志物
CD45	BD Pharmingen	BD 340664	造血干细胞标志物
CD34 抗体	BD Pharmingen	BD 555821	造血干细胞标志物
CD90 抗体	BD Pharmingen	BD 555595	Thy-1 膜糖蛋白 MSCs 标志物
MHC II 类抗体	Santa Cruz	SC-32247	抗原呈递细胞标志物
波形蛋白抗体	Sigma	Sigma-S6389	III 型中间丝 MSCs 标志物
碱性磷酸酶	Promega	S3841	5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐 （BCIP） 和硝基蓝四唑 （NBT） 的混合物
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	密度梯度离心
细胞过滤器	BD Falcon	352340	40 µm 尼龙细胞过滤器
15 ml 聚苯乙烯锥形管	BD Falcon	351095	样品采集和细胞分离
35 mm 培养皿	Nunc	153066	细胞培养皿
骨髓提取器	GmbH Medizintechnologie， Germany	1145-1W010	TrokaBone，3.0 x 100 mm
血细胞比容室	Marinfeld	640130	细胞计数室
韩国阿托品	Jeil Pharmaceutical Co		阿托品水合物
安赛丙嗪	Samu Median，韩国		麻醉前镇静和止吐药
美托咪定	辉瑞		麻醉和镇痛药
恩诺沙星	拜耳医疗保健，德国		抗生素
美洛昔康	Over 兽药，		抗炎镇痛药
异氟醚	Hana pharm，韩国		吸入麻醉
聚维酮碘	韩国制药 韩国		灭菌剂
乙醇	Sigma	E7023	灭菌剂
肝素	Sigma	H3393	抗凝剂
甲醛	Sigma	F8775	细胞固定剂
眼药膏	辉瑞		盐酸土霉素 含硫酸多粘菌素 B
循环水毯	Gaymar Industries		麻醉期间和麻醉后的加温系统
吻合器	美国科维恩		缝合皮肤闭合
CO2 培养箱	Thermo Forma	3111	细胞培养设备
流式细胞仪	BD Biosciences		细胞分析仪
Minipig	PWG Genetics Korea， Ltd.	T 型	微型清管器