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方法文章

在C2C12成肌细胞中建立强直性肌营养不良症1型模型

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DOI：

10.3791/54078

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2016年7月29日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston, 2Department of Economics, University of Houston, 3Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Nanchang University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在本实验方案中，我们介绍了建立强直性肌营养不良症1型成肌细胞模型的步骤，包括优化的C2C12细胞培养、基因转染/转导以及肌细胞分化。

摘要

强直性肌营养不良1型（DM1）是一种常见的肌营养不良症。尽管已建立了多种DM1动物模型，但成肌细胞模型仍然具有重要意义，因为它们为研究细胞和分子事件提供了高效的细胞替代方案。虽然C2C12成肌细胞已被广泛用于研究成肌过程，但其对基因转染或病毒转导的抗性限制了在C2C12细胞中的研究。本文介绍了一种优化的实验方案，包括日常培养、将基因导入C2C12成肌细胞的转染与转导操作，以及诱导肌细胞分化的步骤。总体而言，这些操作可实现最佳的转染/转导效率，并获得稳定的分化结果。本方案在建立DM1成肌细胞模型方面的应用，将有助于强直性肌营养不良及其他肌肉疾病的研究。

引言

强直性肌营养不良症（DM）是一种常染色体显性遗传病，可影响多个系统，尤其是心肌和骨骼肌1。该疾病分为两种亚型：DM1 和 DM2。DM1 比 DM2 更常见，且临床表现更为严重2。DM1 的致病遗传突变为位于强直性肌营养不良蛋白激酶基因（DMPK）3'非翻译区（UTR）的CUG三核苷酸重复序列扩增3。在健康个体中，CUG重复次数为5至37次；而在DM1患者中，该重复次数增加至50次以上，有时甚至可达数千次4。因此，RNA结合蛋白（如肌肉盲样蛋白1（MBNL1）、CUGBP以及Elav样家族1（Celf1））的表达发生异常调控。由于被扩增的CUG重复序列异常捕获，MBNL1丧失了调控选择性剪接的功能5；而Celf1则出现上调表达6,7。Celf1的过表达与肌肉萎缩和肌无力相关，这种表型并非由MBNL1功能缺失引起。目前已建立多种模拟DM1相关改变的动物模型，包括DMPK 3'-UTR中CUG重复扩增、MBNL1缺失以及Celf1过表达等模型。然而，在成肌细胞中建立DM1模型提供了一种高效的替代方案，尤其适用于解析与DM1相关的细胞和分子事件。

C2C12 成肌细胞系最初从受伤的 C3H 小鼠肌肉中分离获得，现已被广泛用于研究成肌分化8,9。C2C12 细胞在含胎牛血清（FBS）的培养基中可快速增殖，当去除 FBS 后则易于启动分化。然而，使用该成肌细胞分化模型存在两个挑战：C2C12 细胞通常对基因转染或病毒转导具有抗性；此外，细胞操作和分化流程中的细微差异都可能导致肌管形成出现显著变化。

我们的实验室常规使用C2C12成肌细胞作为细胞模型，并已开发出通过质粒转染、逆转录病毒转导和慢病毒转导将基因有效导入C2C12细胞系的实验方案10。在视频中，我们展示了转染/转导C2C12细胞的优化步骤，以及在建立强直性肌营养不良1型（DM1）成肌细胞模型过程中维持分化一致性的方法。

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方案

1. C2C12 细胞培养

  1. 在100 mm培养皿中，使用含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的增殖培养基（Dulbecco改良Eagle培养基，DMEM）培养C2C12小鼠成肌细胞。使传代后的C2C12细胞生长至约50–60%融合度。
  2. 弃去增殖培养基，用3 ml室温磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤C2C12细胞。吸除PBS后，加入500 µl 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液以解离细胞。将培养皿置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育3–5分钟。
  3. 加入3 ml增殖培养基以中和胰蛋白酶活性。轻吹6–8次使细胞充分悬浮。取1 ml细胞悬液接种至新的100 mm培养皿中，于37 °C、5% CO2条件下培养。

2. C2C12 细胞转染/转导及筛选

  1. C2C12 质粒转染
    1. 转染前 24 小时，将 7.0 × 105 个 C2C12 细胞接种至六孔板的每个孔中，每孔对应一次转染。
      注意：此时细胞在转染时将达到 50 - 60% 的融合度。
    2. 使用前将转染试剂恢复至室温。
    3. 将 2 µg 质粒 DNA（GFP-CUG5 或 GFP-CUG200）加入 200 µl 预热的无血清培养基中，短暂涡旋混匀。向其中加入 6 µl 转染试剂，并立即用涡旋振荡器混合 30 秒。室温孵育该混合物 30 分钟。
    4. 将 C2C12 细胞的培养基更换为 2.5 ml 无血清生长培养基。孵育结束后，将转染混合物加入细胞中。将培养板放回 5% CO2、37 °C 的培养箱中。
    5. 使细胞在转染混合物/无血清生长培养基中继续培养 4 小时或过夜。次日或当细胞毒性明显时，更换为常规生长培养基。
      注意：细胞毒性通过显微镜观察细胞进行评估。观察细胞形态变化和细胞脱落情况。只要无明显细胞毒性，在无血清生长培养基中过夜孵育可提高转染效率。
    6. 转染后 48 小时开始加药筛选：加入 1.2 - 1.6 mg/ml G418，持续约 10 天，直至对照组（未转染质粒的细胞）中无存活细胞。每隔两天更换一次含 G418 的生长培养基。
    7. 将获得 G418 抗性的细胞维持在生长培养基中，并于 37 °C、5% CO2 条件下培养，用于后续实验。
  2. 逆转录病毒制备及 C2C12 逆转录病毒感染
    1. 通过在 DMEM 高糖培养基中添加 10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺，配制 HEK 293 培养基。
      1. 转染前约 24 小时，将 4.0 × 106 个亲嗜性 HEK 293 包装细胞接种至 100 mm 培养皿中（转染时融合度约为 80%），加入细胞培养基。
    2. 使用前将转染试剂恢复至室温。
    3. 将 15 µg 质粒 DNA（pMSCV-Puro 或 pMSCV-Celf1Flag-Puro）溶于 1 ml 无血清生长培养基中，短暂涡旋混匀。向 DNA/无血清生长培养基管中加入步骤 2.2.2 中的 30 µl 转染试剂，充分涡旋混匀。室温孵育 30 分钟。
    4. 将转染混合物逐滴加入亲嗜性 HEK 293 包装细胞中。轻轻晃动培养皿后放回 5% CO2、37 °C 培养箱。24 小时后，更换为 10 ml 预热的新鲜生长培养基。
    5. 转染后 48 小时，用移液器收集上清液（含逆转录病毒），转移至 50 ml 离心管中。向培养皿中加入 10 ml 新鲜温热培养基，并放回培养箱。将上清液置于 4 °C 保存。
      注意：加液时应沿皿壁缓慢加入，避免破坏细胞单层。
    6. 转染后 60 小时收集第二批上清液，并与步骤 2.2.5 收集的上清液合并。在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 7 分钟，去除细胞碎片。
    7. 将上清液转移至新的 50 ml 离心管中。此时可直接用于感染 C2C12 细胞（进入步骤 2.2.9），或分装后于 -20 °C 保存以备后续使用。
    8. 若使用冻存病毒，需在室温下解冻步骤 2.2.7 所得的逆转录病毒。
      注意：避免反复冻融。
    9. 在感染当天接种 C2C12 细胞，目标融合度为 30 - 40%。
      1. 弃去生长培养基，用 3 ml 室温 PBS 洗涤 C2C12 细胞，吸除 PBS 后加入 500 µl 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 3 - 5 分钟。
      2. 加入 3 ml 生长培养基中和胰蛋白酶活性。吹打 6 - 8 次使细胞悬浮。使用血细胞计数板计数后，将 8.0 × 105 个 C2C12 细胞接种至 60 mm 培养皿中。
    10. 在 3 ml 生长培养基中加入 0.5 ml 逆转录病毒以感染一个 60 mm 培养皿的细胞。将培养皿放回培养箱。
    11. 感染后 48 小时，更换为含筛选抗生素（嘌呤霉素 1 - 3 µg/ml）的新鲜培养基 3 ml。每天更换一次含抗生素的培养基，持续约 5 天，直至未转导的 C2C12 对照组细胞完全死亡。
  3. 慢病毒制备及 C2C12 慢病毒感染
    注意：所有与慢病毒相关的操作均应在生物安全二级柜中进行，并遵守生物安全操作规范。含病毒的液体废弃物在丢弃前必须进行消毒处理。
    1. 转染前 24 小时，在 100 mm 培养皿中接种 4.0 × 106 个 293T 细胞（转染当天融合度约为 80%），使用 HEK 293 细胞培养基（DMEM 高糖培养基，添加 10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺）。
    2. 将转染试剂升温至室温。将慢病毒包装载体（4 µg pMD2.G 和 6 µg psPAX2）与 8 µg 慢病毒转移载体（Celf1 shRNA 或乱序对照 shRNA）共同溶于 1 ml 无血清细胞培养基中，短暂涡旋混匀。
    3. 向 DNA/DMEM 混合液中加入 36 µl 预热的转染试剂，充分涡旋混匀。室温孵育 30 分钟。
    4. 从培养箱中取出 293T 细胞，将转染混合物加入培养皿中。轻轻晃动后放回 5% CO2、37 °C 培养箱。24 小时后，弃去转染混合物，更换为 10 ml 新鲜培养基。
    5. 转染后 48 小时收集含慢病毒的上清液，转移至 50 ml 离心管中。向培养皿中加入 10 ml 新鲜温热培养基，并放回培养箱。将上清液保存于 4 °C。
    6. 转染后 60 小时收集第二批上清液，与步骤 2.3.5 的上清液合并。在 4 °C 条件下以 500 × g 短暂离心 7 分钟。
    7. 将上清液转移至新的 50 ml 离心管中。若使用新鲜病毒，直接进入步骤 2.3.9；若需保存，将含病毒的上清液分装为每管 10 ml，于 -20 °C 保存以备后续使用。
    8. 若使用冻存病毒，使用前在室温下解冻步骤 2.3.7 所得的病毒。
      注意：避免反复冻融。
    9. 在感染当天，按照步骤 2.2.9 的方法接种 C2C12-CUG200 细胞（来自第 2.1 节）。
      注意：目标融合度为 30 - 40%。
    10. 向一个 60 mm 培养皿的 C2C12-CUG200 细胞中加入 0.5 ml 病毒，感染后将培养皿放回培养箱。
    11. 转导后 72 小时，更换为含筛选抗生素（嘌呤霉素 1 - 3 µg/ml）的新鲜培养基。每天更换一次含抗生素的培养基，持续约 5 天，直至所有未转导的 C2C12-CUG200 对照组细胞完全死亡。
    12. 通过 Western blot 检测 GFP-CUG200 转染细胞中 Celf1 的敲低效果。

3. C2C12 细胞分化

  1. 在诱导分化前24小时，将2 × 106 个细胞接种于6孔板的一个孔中，加入2.5 ml生长培养基。
    注意：可根据情况调整接种密度，以确保细胞在24小时内达到完全汇合。
    1. 用PBS洗涤汇合的细胞，加入2.5 ml低血清分化培养基（DMEM培养基添加2%马血清、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和1 µM胰岛素）。每两天更换一次培养基。
      注意：胰岛素原液应保存于冷冻状态，并在每次换液时加入培养基中。
  2. 在C2C12细胞分化过程中，于以下时间点收集样品进行定量RT-PCR分析（见第4节）：第0、1、2、4和6天。在第6至8天对培养物进行免疫染色处理（见第5节）。

4. RNA 提取与定量 RT-PCR

  1. 按照制造商的说明书进行RNA提取。提取后，将RNA沉淀重悬于30 µl无RNase的水中，并用移液器上下吹打数次。
    注意：样品可直接进行定量RT-PCR，或于-80 °C保存。
  2. 使用RT qPCR试剂盒进行定量RT-PCR10，并遵循制造商的操作说明。根据表1配制反应体系。
组分体积 (µl)终浓度
2x 反应缓冲液101x
正向引物0.5200 nM
反向引物0.5200 nM
探针0.5200 nM
逆转录酶 & RNase 抑制剂0.10.25 U/ml
模板1100 ng 总 RNA
无 RNase 水7.4不适用
总反应体系20

表1. 定量RT-PCR预混液的配制

  1. 使用热循环程序 表2 进行 20 µl 的 RT-qPCR 反应。
逆转录步骤30 分钟，48 °C
DNA 聚合酶激活/逆转录酶失活10 分钟，95 °C
40 个循环15 秒，95 °C
1 分钟，60 °C

表2. 定量RT-PCR热循环程序

5. 免疫染色

  1. 在室温下用 2.5 ml 新鲜配制的 4% 多聚甲醛/PBS 固定单层细胞 10 分钟。
  2. 在室温下用 2.5 ml 0.1% Triton X-100/PBS 处理样品 30 分钟以进行透化。
  3. 将样品转移至加湿孵育盒中。在37 °C下，用2.5 ml封闭缓冲液（0.1%非离子型表面活性剂/PBS，10%正常山羊血清）封闭样品30分钟。
  4. 弃去封闭缓冲液，加入800 µl用封闭缓冲液按1:100稀释的一抗（抗肌球蛋白重链抗体），于湿盒中室温孵育过夜。
  5. 第2天用2.5 ml洗涤缓冲液（0.1%吐温20/PBS）洗涤平板3次，每次10分钟。
  6. 吸去洗涤缓冲液，加入800 µl二抗（山羊抗小鼠IgG，用PBS按1:500稀释）。在湿盒中室温孵育1小时。
  7. 用2.5 ml洗涤缓冲液洗涤两次，每次10分钟。
  8. 加入800 µl DAPI（1 µg/ml，溶于去离子蒸馏水）孵育25 分钟
  9. 用2.5 ml洗涤缓冲液再次洗涤10分钟。
  10. 更换洗涤缓冲液为2.5 ml PBS，使用荧光显微镜采集图像。

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结果

将C2C12细胞转染GFP-CUG5或GFP-CUG200。经药物抗性筛选后，建立稳定细胞池，可通过GFP表达进行观察（图1A）。通过肌球蛋白重链免疫染色检测分化肌母细胞中的肌管形成10（图1B）。肌管形成定量结果显示，GFP-CUG200中异常CUG扩增使融合指数从35.4 ± 4.1%下降至2.6 ± 1.1%，肌管面积从35.6 ± 2.2%下降至2.7 ± 0.8%（图1C）。融合指数通过肌管内（≥2个细胞核）的细胞核总数除以总细胞核数计算，肌管面积则通过肌管覆盖的图像总面积百分比进行计算。采用实时RT-PCR10分析多个肌肉分化相关基因（包括MyoD、MyoG、Mef2c和Celf1）的表达水平。与CUG5培养组相比，CUG200在分化起始阶段的增殖性肌母细胞中显著上调Celf1 mRNA的表达。与既往报道一致，Celf1的上调与强直性肌营养不良1型中的CUG扩增相关（图1D）。此外，...

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讨论

C2C12细胞系已被用作研究肌生成的模型11-14。这些细胞具有成纤维细胞样的形态，在含有20%胎牛血清的培养基中快速增殖，并可在含有2%马血清的培养基中 readily 发生分化15。快速生长和分化能力是肌生成细胞模型中的有利特性。本文展示了使用质粒、逆转录病毒和慢病毒载体将cDNA、3'-非翻译区（3'-UTR）和shRNA导入C2C12细胞的方法。以下重点说明转染/转导以及维持分化一致性的关键步骤。

日常细胞培养中的细胞密度至关重要。这些细胞的培养密度应低于50 - 70%融合度。由于C2C12细胞群体倍增时间较短，若融合度过高（> 70%），在过夜培养后会自发发生分化。尽管自发分化的细胞比例可能较小，但其存在将导致后续分化实验结果不一致。此外，建议使用冻存后新复苏且传代次数较低的C2C12细胞。进行分化实验时，应以预先确定的细胞数量接种，使其在24小时后达到完全融合。胰岛素应分装成小份冷冻保存，并在每次更换分化培养基时添加。这些措施可提高分化实验的成功率。

无血清培养...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢贝勒医学院的 Tom Cooper 博士、威斯康星大学麦迪逊分校的 Mani S. Mahadevan 博士以及日内瓦大学的 Didier Trono 博士提供的试剂。本研究得到休斯顿大学启动基金（YL）、美国心脏协会资助（YL，11SDG5260033）和国家自然科学基金（XP，81460047）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM，高糖Life Technologies11965-084用于培养基
胎牛血清 - 优质Atlanta BiologicalsS11150用于培养基
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100倍浓度）Life Technologies10378-016用于培养基
牛胰岛素Sigma AldrichI6634-100MG用于分化培养基
马血清Atlanta BiologicalsS12150用于分化培养基
FuGENE HD 转染试剂PromegaE2311 用于转染
G418 硫酸盐 Gold Biotechnology G-418-10用于药物抗性筛选
嘌呤霉素二盐酸盐Sigma Aldrichsc-108071用于药物抗性筛选
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris 蛋白凝胶，1.0 mm，15 孔Life TechnologiesNP0323BOX用于 Western 印迹
NuPAGE 转膜缓冲液（20倍浓度）Life TechnologiesNP00061用于 Western 印迹
NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液（20倍浓度）Life TechnologiesNP0002用于 Western 印迹
Amersham Protran 支持型 0.2 NC，300 mm × 4 mGE healthcare life science10600015用于 Western 印迹
MF 20发育杂交瘤库MF 20免疫染色一抗
山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗，Texas Red-X 标记Thermo Fisher ScientificT-862免疫染色二抗
一步法 qRT-PCR 主混合液AnaSpec05-QPRT-032X用于 qRT-PCR
TriPure 提取试剂Roche11667165001用于 RNA 提取
CUG-BP1 抗体（3B1）santa cruzsc-20003Western 印迹一抗
肌动蛋白抗体santa cruzsc-1615山羊多克隆 IgG，用于上样对照
293T EcopackClontech631507用于逆转录病毒制备的细胞
pMSCV-puroClontech634401空载逆转录病毒载体，用于逆转录病毒制备
pMSCV-Celf1Flag-puro实验室构建不可用编码 Celf1Flag 的逆转录病毒载体，用于逆转录病毒制备
psPAX2由 Didier Trono 惠赠不可用用于慢病毒制备
pMD2.G由 Didier Trono 惠赠不可用用于慢病毒制备
GFP-CUG5由 M.S. Mahadevan 惠赠不可用详见参考文献10 
GFP-CUG200由 M.S. Mahadevan 惠赠不可用详见参考文献10 
Triton X-100Sigma AldrichX100用于免疫染色
多聚甲醛Sigma AldrichP6148用于免疫染色
TWEEN 20Sigma AldrichP9416用于免疫染色
DAPISigma AldrichD9542用于免疫染色

参考文献

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