在C2C12成肌细胞中建立强直性肌营养不良症1型模型

摘要

在本实验方案中，我们介绍了建立强直性肌营养不良症1型成肌细胞模型的步骤，包括优化的C2C12细胞培养、基因转染/转导以及肌细胞分化。

摘要

强直性肌营养不良1型（DM1）是一种常见的肌营养不良症。尽管已建立了多种DM1动物模型，但成肌细胞模型仍然具有重要意义，因为它们为研究细胞和分子事件提供了高效的细胞替代方案。虽然C2C12成肌细胞已被广泛用于研究成肌过程，但其对基因转染或病毒转导的抗性限制了在C2C12细胞中的研究。本文介绍了一种优化的实验方案，包括日常培养、将基因导入C2C12成肌细胞的转染与转导操作，以及诱导肌细胞分化的步骤。总体而言，这些操作可实现最佳的转染/转导效率，并获得稳定的分化结果。本方案在建立DM1成肌细胞模型方面的应用，将有助于强直性肌营养不良及其他肌肉疾病的研究。

引言

强直性肌营养不良症（DM）是一种常染色体显性遗传病，可影响多个系统，尤其是心肌和骨骼肌¹。该疾病分为两种亚型：DM1 和 DM2。DM1 比 DM2 更常见，且临床表现更为严重²。DM1 的致病遗传突变为位于强直性肌营养不良蛋白激酶基因（DMPK）3'非翻译区（UTR）的CUG三核苷酸重复序列扩增³。在健康个体中，CUG重复次数为5至37次；而在DM1患者中，该重复次数增加至50次以上，有时甚至可达数千次⁴。因此，RNA结合蛋白（如肌肉盲样蛋白1（MBNL1）、CUGBP以及Elav样家族1（Celf1））的表达发生异常调控。由于被扩增的CUG重复序列异常捕获，MBNL1丧失了调控选择性剪接的功能⁵；而Celf1则出现上调表达^6,7。Celf1的过表达与肌肉萎缩和肌无力相关，这种表型并非由MBNL1功能缺失引起。目前已建立多种模拟DM1相关改变的动物模型，包括DMPK 3'-UTR中CUG重复扩增、MBNL1缺失以及Celf1过表达等模型。然而，在成肌细胞中建立DM1模型提供了一种高效的替代方案，尤其适用于解析与DM1相关的细胞和分子事件。

C2C12 成肌细胞系最初从受伤的 C3H 小鼠肌肉中分离获得，现已被广泛用于研究成肌分化^8,9。C2C12 细胞在含胎牛血清（FBS）的培养基中可快速增殖，当去除 FBS 后则易于启动....

方案

1. C2C12 细胞培养

1. 在100 mm培养皿中，使用含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的增殖培养基（Dulbecco改良Eagle培养基，DMEM）培养C2C12小鼠成肌细胞。使传代后的C2C12细胞生长至约50–60%融合度。
2. 弃去增殖培养基，用3 ml室温磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤C2C12细胞。吸除PBS后，加入500 µl 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液以解离细胞。将培养皿置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育3–5分钟。
3. 加入3 ml增殖培养基以中和胰蛋白酶活性。轻吹6–8次使细胞充分悬浮。取1 ml细胞悬液接种至新的100 mm培养皿中，于37 °C、5% CO₂条件下培养。

2. C2C12 细胞转染/转导及筛选

1. C2C12 质粒转染
   1. 转染前 24 小时，将 7.0 × 10⁵ 个 C2C12 细胞接种至六孔板的每个孔中，每孔对应一次转染。
      注意：此时细胞在转染时将达到 50 - 60% 的融合度。
   2. 使用前将转染试剂恢复至室温。
   3. 将 2 µg 质粒 DNA（GFP-CUG5 或 GFP-CUG200）加入 200 µl 预热的无血清培养基中，短暂涡旋混....

结果

将C2C12细胞转染GFP-CUG5或GFP-CUG200。经药物抗性筛选后，建立稳定细胞池，可通过GFP表达进行观察（图1A）。通过肌球蛋白重链免疫染色检测分化肌母细胞中的肌管形成¹⁰（图1B）。肌管形成定量结果显示，GFP-CUG200中异常CUG扩增使融合指数从35.4 ± 4.1%下降至2.6 ± 1.1%，肌管面积从35.6 ± 2.2%下降至2.7 ± 0.8%（图1C）。融合指数通过肌管内（≥2个细胞核）的细胞核总数除以总细胞核数计算，肌管面积则通过肌管覆盖的图像总面积百分比进行计算。采用实时RT-PCR¹⁰分析多个肌肉分化相关基因（包括MyoD、MyoG、Mef2c和Celf1）的表达水平。与CUG5培养组相比，CUG200在分化起始阶段的增殖性肌母细胞中显著上调Celf1 mRNA的表达。与既往报道一致，Celf1的上调与强直性肌营养不良1型中的CUG扩增相关（图1D）。此外，.......

讨论

C2C12细胞系已被用作研究肌生成的模型^11-14。这些细胞具有成纤维细胞样的形态，在含有20%胎牛血清的培养基中快速增殖，并可在含有2%马血清的培养基中 readily 发生分化¹⁵。快速生长和分化能力是肌生成细胞模型中的有利特性。本文展示了使用质粒、逆转录病毒和慢病毒载体将cDNA、3'-非翻译区（3'-UTR）和shRNA导入C2C12细胞的方法。以下重点说明转染/转导以及维持分化一致性的关键步骤。

日常细胞培养中的细胞密度至关重要。这些细胞的培养密度应低于50 - 70%融合度。由于C2C12细胞群体倍增时间较短，若融合度过高（> 70%），在过夜培养后会自发发生分化。尽管自发分化的细胞比例可能较小，但其存在将导致后续分化实验结果不一致。此外，建议使用冻存后新复苏且传代次数较低的C2C12细胞。进行分化实验时，应以预先确定的细胞数量接种，使其在24小时后达到完全融合。胰岛素应分装成小份冷冻保存，并在每次更换分化培养基时添加。这些措施可提高分化实验的成功率。

无血清培养.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM，高糖	Life Technologies	11965-084	用于培养基
胎牛血清 - 优质	Atlanta Biologicals	S11150	用于培养基
青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100倍浓度）	Life Technologies	10378-016	用于培养基
牛胰岛素	Sigma Aldrich	I6634-100MG	用于分化培养基
马血清	Atlanta Biologicals	S12150	用于分化培养基
FuGENE HD 转染试剂	Promega	E2311	用于转染
G418 硫酸盐	Gold Biotechnology	G-418-10	用于药物抗性筛选
嘌呤霉素二盐酸盐	Sigma Aldrich	sc-108071	用于药物抗性筛选
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris 蛋白凝胶，1.0 mm，15 孔	Life Technologies	NP0323BOX	用于 Western 印迹
NuPAGE 转膜缓冲液（20倍浓度）	Life Technologies	NP00061	用于 Western 印迹
NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液（20倍浓度）	Life Technologies	NP0002	用于 Western 印迹
Amersham Protran 支持型 0.2 NC，300 mm × 4 m	GE healthcare life science	10600015	用于 Western 印迹
MF 20	发育杂交瘤库	MF 20	免疫染色一抗
山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗，Texas Red-X 标记	Thermo Fisher Scientific	T-862	免疫染色二抗
一步法 qRT-PCR 主混合液	AnaSpec	05-QPRT-032X	用于 qRT-PCR
TriPure 提取试剂	Roche	11667165001	用于 RNA 提取
CUG-BP1 抗体（3B1）	santa cruz	sc-20003	Western 印迹一抗
肌动蛋白抗体	santa cruz	sc-1615	山羊多克隆 IgG，用于上样对照
293T Ecopack	Clontech	631507	用于逆转录病毒制备的细胞
pMSCV-puro	Clontech	634401	空载逆转录病毒载体，用于逆转录病毒制备
pMSCV-Celf1Flag-puro	实验室构建	不可用	编码 Celf1Flag 的逆转录病毒载体，用于逆转录病毒制备
psPAX2	由 Didier Trono 惠赠	不可用	用于慢病毒制备
pMD2.G	由 Didier Trono 惠赠	不可用	用于慢病毒制备
GFP-CUG5	由 M.S. Mahadevan 惠赠	不可用	详见参考文献10
GFP-CUG200	由 M.S. Mahadevan 惠赠	不可用	详见参考文献10
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	用于免疫染色
多聚甲醛	Sigma Aldrich	P6148	用于免疫染色
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P9416	用于免疫染色
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	用于免疫染色