一种增强背根神经节神经元轴突排列与髓鞘形成的方法

摘要

本方案描述了从大鼠分离背根神经节（DRG）神经元，并在静态预拉伸细胞培养系统上培养DRG神经元以增强轴突排列，随后与施万细胞（SCs）共培养以促进髓鞘形成的实验方法。

摘要

轴突再生是一个混乱的过程，主要由于轴突排列无序所致。因此，为了使足够数量的再生轴突能够跨越损伤部位，必须实现轴突的有序排列。由于神经损伤后的脱髓鞘会严重损害存活轴突的传导能力，因此髓鞘再生对于再生神经的功能恢复至关重要。此前，我们已证明间充质干细胞（MSCs）在预拉伸诱导的各向异性表面上会沿特定方向排列，因为细胞在拉伸方向上感知到的有效刚度大于垂直方向。我们还发现，由机械预拉伸表面形成的各向异性结构同样会影响轴突的排列、生长以及髓鞘形成。本文中，我们提供了一套详细的实验方案，用于制备预拉伸各向异性表面，分离并培养背根神经节（DRG）神经元于该预拉伸表面上，并展示DRG神经元与施万细胞（SCs）在预拉伸表面上共培养时的髓鞘形成行为。

引言

在神经损伤中，由于损伤部位的存在，近端和远端神经残端通常难以实现神经束的直接准确对合^1-2。正常情况下，轴突通路由高度有序且排列整齐的轴突束组成，形成复杂的连接网络。然而，由于轴突排列紊乱，神经再生过程往往具有无序性^3-4。因此，为了产生足够数量并能跨越损伤部位的再生轴突，必须诱导轴突形成良好有序的排列。此外，由于损伤部位髓鞘形成细胞的死亡，神经损伤常伴随脱髓鞘现象。由于脱髓鞘会显著损害存活轴突的传导能力，针对脱髓鞘的治疗或促进再髓鞘化的策略对于神经损伤后的功能恢复具有重要意义⁵。因此，本实验方案的目标是阐述一种可解决神经再生中上述两个关键问题的工程学方法。

表面各向异性，即材料在不同轴向上测得的物理或力学性质存在差异，已被用于调控细胞的排列、生长和迁移。 ^6-7除了形貌学方法外，还有其他诱导各向异性的方法。此前，我们研究了通过机械静态预拉伸聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜所诱导的表面各向异性。该理论的 "大变形上的小变形" 预测细胞在拉伸方向上感知的有效刚度与垂直方向上的有效刚度存在差异，这种有效刚度的差异源于表面各向异性 ⁸在预拉伸的PDMS膜上培养的间充质干细胞（MSCs）能够通过主动牵拉表面感知各向异性，并因此沿预拉伸方向排列。 ⁹类似地，由机械预拉伸表面产生的各向异性表面会影响背根神经节（DRG）轴突的排列、生长及髓鞘化。 ....

方案

所有细胞分离操作程序均经密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 预拉伸各向异性表面的制备 

1. 按10:1的比例混合基础剂与固化剂，将混合物倒入组织培养皿（直径12 cm）中。整个交联混合物使用4,900 mg基础剂和490 mg固化剂。
2. 将凝胶混合物置于真空环境中20分钟，以去除气泡。
3. 将凝胶混合物放入烘箱中，在60 °C下过夜固化。
4. PDMS膜固化后，使用等离子清洗/刻蚀系统对其进行氧气等离子体处理，处理条件为165 mTorr、O₂流量65 sccm，处理时间3分钟。
5. 从培养皿中切下一矩形膜片（5 × 3.5 cm），注意识别经氧气处理的一侧，确保该侧朝上，并将其固定在拉伸框架上。将框架置于拉伸台上，通过旋转旋钮均匀拉伸，直至长轴方向达到10%的伸长率（或其他预设拉伸程度；伸长率可直接从拉伸台上读取）⁹。通过拧紧框架上的螺丝固定拉伸状态。
6. 将框架从拉伸台上取下。确保膜表面干燥且无灰尘，然后将硅胶腔室放置在膜上，使腔室的粘性面紧密贴附于膜表面。
   注意：硅胶腔室可在PDMS膜上形成一个用于容纳细胞培养基的孔室。装置设计如图1所示。
7. 用紫外光照射表面10分钟进行灭菌。
8. 在等离子体处理后的6小时内，向腔室内的PDMS表面加入1 ml聚-L-赖氨酸（P....

结果

预拉伸细胞培养系统促进了背根神经节（DRG）轴突的定向排列¹⁰。将DRG神经元分别接种于预拉伸和未拉伸的表面，培养12天。通过β-III微管蛋白染色以显示轴突的排列情况。图2比较了培养12天后，DRG轴突在预拉伸与未拉伸PDMS基底上的取向。在预拉伸基底上，DRG轴突沿拉伸方向平行排列；而在未拉伸的PDMS基底上，轴突呈随机排列，并形成相互连接的网络结构。

除了诱导轴突定向排列外，预拉伸诱导的各向异性还增强了轴突的束化。在拉伸表面上，排列整齐的轴突形成了轴突束，这与在未拉伸表面上观察到的相互连接的轴突网络不同。预拉伸表面上的这些束状结构类似于神经组织中的神经束 体内. 图3 显示培养21天后在预拉伸和未拉伸表面上的DRG神经元轴突。 图3 如图所示，预拉伸基底上的轴突聚集形成束状结构，类似于神经束样结构。这表明预.......

讨论

为了在预拉伸表面上诱导轴突定向排列，有两个关键步骤：1）PDMS膜必须平整且厚度均匀；2）必须从背根神经节（DRG）中去除胶质细胞。在混合PDMS及其交联剂并经烘箱固化后，交联的PDMS凝胶应放置于平坦的台面上，并小心操作以避免任何倾斜。PDMS膜经氧等离子体处理后，须在6小时内完成聚赖氨酸（PLL）包被，因为等离子体处理后表面的亲水性（细胞贴附所必需）会随时间逐渐减弱。由于等离子体处理仅作用于膜的一侧，在将PDMS从培养皿上剥离后，必须注意确保正确的一侧被安装到拉伸框架上，即经等离子体处理的表面应朝上，以便细胞贴附。

背根神经节位于沿脊柱排列的骨性凹陷内。由于幼年幼崽的椎骨呈白色，因此很难将背根神经节与椎骨区分开来。此时，应将脊柱置于靠近光源的位置。在光照下，背根神经节会变得透明，而骨组织仍保持白色且不透明。分离用缓冲液必须保持在冰上并维持生理pH值，因为pH值会影响神经细胞的存活能力。分离得到的组织黏性较高，在转移至离心管时容易黏附在移液枪头尖端。因此，剪去移液枪头的最末端以形成较大的开口，有助于组织的转移。

在某些实验方.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Neurobasal 培养基 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 添加剂 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
神经生长因子-7S	Invitrogen	13290-010
青霉素-链霉素	GibcoBRL	15140-122
0.05% 胰蛋白酶-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poly-L-Lysine	Trevigen	3438-100-01
Poly-D-Lysine	Sigma	p-6407
氟代-2-脱氧尿苷	Sigma	F0503
尿苷	Sigma	U3003
Hank’s 平衡盐溶液 (HBSS)	Invitrogen	14170-112	分离缓冲液
I 型胶原酶	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
热灭活胎牛血清	Hyclone	SH30080.03
BPE	Clonetics	CC-4009
佛司可林	Calbiochem	344270
硅胶腔室	Greiner bio-one	FlexiPERM ConA
等离子清洗/刻蚀系统	March Instruments	PX-250
抗 Thy 1.1 抗体	Sigma- Aldrich	M7898
兔补体	Sigma- Aldrich	S-7764
标准生长培养基			取 500 ml Neurobasal 培养基 1x，加入 10 ml B-27 50x、5 ml Glutamax-I 100x、2.5 ml 青霉素/链霉素 (Penn/Strep)、1 ml Albumax-I 和 1 μl NGF-7S（50 μg/ml）。
FDU 尿苷储备液			将 100 mg FDU 溶于 10 ml ddH2O 中（终浓度 10 mg/ml），在超净台中过滤，分装为每份 500 μl，于 -20 ºC 保存。将 5 g 尿苷溶于 166.7 ml ddH2O 中（终浓度 33 mg/ml），在超净台中过滤，分装为每份 200 μl，于 -20 ºC 保存。取 61.5 μl FDU（10 mg/ml）和 20.5 μl 尿苷（33 mg/ml），加入 4,918 μl ddH2O，配制成终末储备浓度，分装为每份 1 ml，于 -20 ºC 保存。