我们介绍一种基于靶向RNA测序的方法，包括制备带索引的cDNA文库、使用定制探针进行杂交与捕获，以及数据分析，以检测特定转录本的基因表达、突变和基因融合。靶向RNA测序可在台式测序仪上对选定转录本进行经济高效且快速的评估。
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本文内容
摘要
摘要
RNA测序（RNAseq）是一种多功能方法，可用于检测和表征基因表达、突变、基因融合以及非编码RNA。标准RNAseq需要30至1亿条测序读长，可包含多种RNA产物，如mRNA和非编码RNA。我们展示了如何利用台式测序仪，通过靶向RNAseq（捕获法）对选定的RNA产物进行集中研究。RNAseq捕获技术能够表征传统RNAseq方法可能遗漏的未注释、低丰度或瞬时表达的转录本。本文描述了从细胞系中提取RNA、核糖体RNA去除、cDNA合成、条形码文库制备、靶向转录本的杂交与捕获，以及在台式测序仪上进行多重测序的实验流程。我们还概述了计算分析流程，包括质量控制评估、序列比对、融合基因检测、基因表达定量以及单核苷酸变异的识别。该检测方法可实现靶向转录本测序，用于表征基因表达、基因融合和突变。
引言
全转录组或RNA测序（RNAseq）是一种无偏倚的测序方法，用于检测所有RNA产物。靶向RNA测序（捕获法）的目标是对选定的转录本进行更集中、更敏感的评估，相较于标准RNA测序，其具有更宽的动态范围、更低的成本或更小的规模以及更高的通量。与标准RNA测序类似，靶向富集方法可用于评估基因表达、多种RNA种类（如mRNA、微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA1、其他非编码RNA2）、基因融合3以及突变4-6。
捕获过程涉及互补寡核苷酸的杂交，以富集用于测序的cDNA文库。RNA测序捕获（RNAseq Capture）的原理类似于微阵列技术，即通过将互补的寡核苷酸或探针与样本杂交，进而检测其相对丰度。在微阵列技术中，基因表达水平基于转录本与这些探针结合后所测得的相对信号强度来确定。因此，微阵列技术受限于检测范围、非特异性结合带来的背景噪声以及探针间的交叉杂交问题。此外，与RNA测序相比，微阵列对低表达和高表达转录本的动态检测范围有限1。然而，由于成本较低且通量较高，微阵列技术仍被广泛应用。
本文展示了一种RNAseq捕获方法，该方法在评估转录组时介于RNA测序与微阵列技术之间。RNAseq捕获具有中等通量、更宽的动态范围和更高的灵敏度，并且适用于台式测序仪实现快速周转。此外，RNAseq捕获在存储空间和数据处理方....
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方案
注意：本方案描述了同时处理和分析四个样本的流程。该方法适用于从细胞、新鲜冷冻组织以及甲醛固定石蜡包埋组织（FFPE）中分离的RNA。本方案建议每个样本起始RNA用量为50 - 1,000 ng，推荐使用250 ng。
1. rRNA 去除与RNA片段化操作步骤
- rRNA 耗竭
- 从 -20 °C 取出洗脱液、引物、片段化混合液、rRNA 去除混合液、rRNA 结合缓冲液和重悬缓冲液，在室温下解冻。从 4 °C 取出洗脱缓冲液、rRNA 去除磁珠和 RNA/cDNA 特异性顺磁性磁珠，恢复至室温。
- 向 PCR 管中加入 0.25 µg RNA。用无核酸酶的超纯水将总 RNA 稀释至终体积 10 µl。每管加入 5 µl rRNA 结合缓冲液，再加入 5 µl rRNA 去除混合液，轻轻吹打混匀。将 PCR 管放入预热至 100 °C 的热循环仪中，程序设置为 68 °C 反应 5 分钟，以变性 RNA。
- RNA 变性后，从热循环仪中取出 PCR 管，在室温下孵育 1 分钟。剧烈涡旋 rRNA 去除磁珠管以充分重悬磁珠。向新管中加入 35 µl rRNA 去除磁珠，然后将 RNA 变性反应液（20 µl）转移至含 rRNA 去除磁珠的管中。
- 调节移液器至 45 µl，快速吹打混匀 20 次。室温孵育 1 分钟后，将 PCR 管置于磁力架....
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结果
RNAseq捕获技术关键步骤的示意图如图1所示。为验证RNAseq捕获技术的有效性，选用了四种具有已知突变的癌细胞系（携带ABL1融合基因的K562细胞系、携带RET融合基因的LC2细胞系、携带PDGFRalpha融合基因的EOL1细胞系，以及携带FGFR3融合基因的RT-4细胞系）。将这四个样本混合后，在台式测序仪上以2×100 bp的双端读长进行测序，生成FASTQ文件。FASTQ文件通过一个包含五个主要组件的RNAseq分析流程进行处理：1）质量控制评估，2）比对至人类转录组，3）基因表达定量，4）融合基因检测，以及5）变异检测。比对生成的BAM文件用于检测单核苷酸变异并计算基因表达水平。融合基因通过融合检测软件（如TopHat Fusion，其可自行完成比对）进行识别，并利用融合检测软件对结果进行注释。
通过RNAseq与捕获法对基因表达进.......
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讨论
RNAseq 捕获是一种介于 RNAseq 与微阵列技术之间的中间策略，用于评估转录组中特定的部分。捕获技术的优势包括成本降低、在台式测序仪上快速完成检测、高通量以及能够检测基因组变异。该方法可被调整用于表征非编码 RNA23、检测单核苷酸变异4-6、分析 RNA 剪接，并识别基因融合或结构重排24。此外，该方法还可应用于经过福尔马林固定并包埋在石蜡块中的临床样本或处理过的样本24,25。
与微阵列、实时定量PCR、Sanger测序和DNA测序相比，RNA测序捕获具有多项显著优势。微阵列技术受限于探针的交叉杂交和非特异性结合所导致的高背景信号。由于背景噪声的存在，低表达基因的定量受到限制，而高表达基因的检测则易受信号饱和的影响1。与RNA测序捕获相比，实时定量PCR难以实现重复性。此外，RNA测序能够检测新转录本，所需起始样本量更少，并可检测可变剪接事件26。与Sanger测序相比，RNA测序具有更高的通量，且可用于分析低表达的miRNA。尽管Sang.......
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披露
S.R. 获得诺华（Novartis）和Ariad Pharmaceuticals公司资助，用于开展临床试验。S.R. 的直系亲属持有强生公司（Johnson and Johnson）的股票。
致谢
我们特别感谢 Ezra Lyon、Eliot Zhu、Michele Wing、Esko Kautto 和 Eric Samorodnitsky 提供的技术支持。同时感谢 Jenny Badillo 为我们团队提供的行政支持。我们感谢俄亥俄超级计算中心（OSC）为我们分析工作提供的磁盘空间、计算资源及技术支持。我们感谢俄亥俄州立大学韦克斯纳医学中心综合癌症中心（CCC）对本研究工作的行政支持。S.R. 及其团队的研究得到了美国癌症协会（MRSG-12-194-01-TBG）、前列腺癌基金会青年研究者奖、美国国立人类基因组研究所（NHGRI，项目编号：UM1HG006508-01A1）、Fore 癌症研究基金会、美国肺脏协会以及 Pelotonia 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| 分子生物学级乙醇 | Sigma Aldrich | E7023-6X500ML | |
| 24 x 1.5 ml 热块 | Eppendorf | 21516-166 | |
| MiSeq 试剂盒 v2（300 个循环） | Illumina | MS-102-2002 | |
| MiSeq 桌面测序仪 | Illumina | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Kit 配套 RiboZero Gold SetA | Illumina | RS-122-2301 | |
| 25 rxn xGen® 通用阻断寡核苷酸 - TS-p5 | IDT | 127040822 | |
| 25 rxn xGen® 通用阻断寡核苷酸 - TS-p7(6nt) | IDT | 127040823 | |
| 25 rxn xGen® 通用阻断寡核苷酸 - TS-p7(8nt) | IDT | 127040824 | |
| Agencourt® AMPure® XP - PCR 纯化磁珠 | Beckman-Coulter | A63880 | |
| Dynabeads® M-270 链霉亲和素磁珠 | Life Technologies | 65305 | |
| COT 人源 DNA，荧光级，1 mg | Roche Applied Science | 05480647001 | |
| Qubit® 检测管 | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit® dsDNA HS 检测试剂盒 | Life Technologies | Q32851 | |
| SeqCap® EZ 杂交与洗涤试剂盒 （24 或 96 次反应） | Roche NimbleGen | 05634261001 或 05634253001 | |
| Qubit® 2.0 荧光计 | Life Technologies | Q32866 | |
| 10 x 2 ml IDTE pH 8.0（1x TE 溶液） | IDT | ||
| Tween20 BioXtra | Sigma | P7949-500ML | |
| 无核酸酶水 | Life Technologies | AM9937 | |
| C1000 Touch™ 梯度PCR仪，配备 96–孔快速反应模块 | Biorad | 185-1196 | |
| SeqCap EZ 杂交与洗涤试剂盒 | Roche Applied Science | 05634253001 | |
| SuperScript II 逆转录酶 200 U/μl | Life Technologies | 18064-014 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5582 | |
| Agencourt RNAClean XP - 40 ml | Beckman Coulter Inc | A63987 | |
| RNA ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5576 | |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent Technol. Inc. | 5067-5578 | |
| RNA ScreenTape 样品缓冲液 | Agilent Technol. Inc. | 5067-5577 | |
| 氢氧化钠 | Sigma | 72068-100ML | |
| DynaBeads MyOne 链霉亲和素 T1 | Life Technologies | 65602 | |
| DYNAMAG -96 侧磁架 | Life Technologies | 12331D | |
| 氯仿 | Sigma | C2432-1L | |
| KAPA HotStart ReadyMix | KAPA Biosystems | KK2602 | |
| NanoDrop 2000 分光光度计 | Thermo Scientific | ||
| My Block Mini 干式恒温器 | Benchmark | BSH200 | |
| D1000 试剂 | Agilent Technol. Inc. | 5067- 5583 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 022829861 |
参考文献
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014....
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