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方法文章

靶向RNA测序实验用于分析基因表达与基因组变异

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DOI：

10.3791/54090

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2016年8月4日

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Division of Medical Oncology, Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University, 2Department of Pharmacology, The Ohio State University

本文内容

摘要

我们介绍一种基于靶向RNA测序的方法，包括制备带索引的cDNA文库、使用定制探针进行杂交与捕获，以及数据分析，以检测特定转录本的基因表达、突变和基因融合。靶向RNA测序可在台式测序仪上对选定转录本进行经济高效且快速的评估。

摘要

RNA测序（RNAseq）是一种多功能方法，可用于检测和表征基因表达、突变、基因融合以及非编码RNA。标准RNAseq需要30至1亿条测序读长，可包含多种RNA产物，如mRNA和非编码RNA。我们展示了如何利用台式测序仪，通过靶向RNAseq（捕获法）对选定的RNA产物进行集中研究。RNAseq捕获技术能够表征传统RNAseq方法可能遗漏的未注释、低丰度或瞬时表达的转录本。本文描述了从细胞系中提取RNA、核糖体RNA去除、cDNA合成、条形码文库制备、靶向转录本的杂交与捕获，以及在台式测序仪上进行多重测序的实验流程。我们还概述了计算分析流程，包括质量控制评估、序列比对、融合基因检测、基因表达定量以及单核苷酸变异的识别。该检测方法可实现靶向转录本测序，用于表征基因表达、基因融合和突变。

引言

全转录组或RNA测序（RNAseq）是一种无偏倚的测序方法，用于检测所有RNA产物。靶向RNA测序（捕获法）的目标是对选定的转录本进行更集中、更敏感的评估，相较于标准RNA测序，其具有更宽的动态范围、更低的成本或更小的规模以及更高的通量。与标准RNA测序类似，靶向富集方法可用于评估基因表达、多种RNA种类（如mRNA、微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA1、其他非编码RNA2）、基因融合3以及突变4-6。

捕获过程涉及互补寡核苷酸的杂交，以富集用于测序的cDNA文库。RNA测序捕获（RNAseq Capture）的原理类似于微阵列技术，即通过将互补的寡核苷酸或探针与样本杂交，进而检测其相对丰度。在微阵列技术中，基因表达水平基于转录本与这些探针结合后所测得的相对信号强度来确定。因此，微阵列技术受限于检测范围、非特异性结合带来的背景噪声以及探针间的交叉杂交问题。此外，与RNA测序相比，微阵列对低表达和高表达转录本的动态检测范围有限1。然而，由于成本较低且通量较高，微阵列技术仍被广泛应用。

本文展示了一种RNAseq捕获方法，该方法在评估转录组时介于RNA测序与微阵列技术之间。RNAseq捕获具有中等通量、更宽的动态范围和更高的灵敏度，并且适用于台式测序仪实现快速周转。此外，RNAseq捕获在存储空间和数据处理方面所需的计算资源更少。

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方案

注意：本方案描述了同时处理和分析四个样本的流程。该方法适用于从细胞、新鲜冷冻组织以及甲醛固定石蜡包埋组织（FFPE）中分离的RNA。本方案建议每个样本起始RNA用量为50 - 1,000 ng，推荐使用250 ng。

1. rRNA 去除与RNA片段化操作步骤

  1. rRNA 耗竭
    1. 从 -20 °C 取出洗脱液、引物、片段化混合液、rRNA 去除混合液、rRNA 结合缓冲液和重悬缓冲液，在室温下解冻。从 4 °C 取出洗脱缓冲液、rRNA 去除磁珠和 RNA/cDNA 特异性顺磁性磁珠，恢复至室温。
    2. 向 PCR 管中加入 0.25 µg RNA。用无核酸酶的超纯水将总 RNA 稀释至终体积 10 µl。每管加入 5 µl rRNA 结合缓冲液，再加入 5 µl rRNA 去除混合液，轻轻吹打混匀。将 PCR 管放入预热至 100 °C 的热循环仪中，程序设置为 68 °C 反应 5 分钟，以变性 RNA。
    3. RNA 变性后，从热循环仪中取出 PCR 管，在室温下孵育 1 分钟。剧烈涡旋 rRNA 去除磁珠管以充分重悬磁珠。向新管中加入 35 µl rRNA 去除磁珠，然后将 RNA 变性反应液（20 µl）转移至含 rRNA 去除磁珠的管中。
    4. 调节移液器至 45 µl，快速吹打混匀 20 次。室温孵育 1 分钟后，将 PCR 管置于磁力架上，室温静置 1 分钟。将上清液转移至新标记的 PCR 管中，并再次将管子置于磁力架上，室温静置 1 分钟，以确保无磁珠残留。将上清液转移至新标记的 PCR 管中。
    5. 涡旋 RNA/cDNA 特异性顺磁性磁珠，每管加入 99 µl 磁珠。轻柔吹打整个体积 10 次以混匀。若起始 RNA 为降解 RNA，每管加入 193 µl 充分混匀的 RNA/cDNA 特异性顺磁性磁珠。室温孵育 15 分钟，然后将 PCR 管置于磁力架上，室温静置 5 分钟。弃去上清液。
    6. 加入 200 µl 新配制的 70% 乙醇（EtOH）。保持 PCR 管在磁力架上，注意不要扰动磁珠。室温孵育 30 秒后，弃去上清液。将 PCR 管在室温下静置 5–10 分钟，使其干燥。
    7. 将已解冻的室温洗脱缓冲液以 600 × g 离心 5 秒。每管加入 11 µl 洗脱缓冲液，轻柔吹打 10 次混匀。室温孵育 2 分钟后，将 PCR 管置于磁力架上，室温静置 5 分钟。将 8.5 µl 上清液转移至新标记的 PCR 管中。
  2. rRNA 耗竭后 RNA 的片段化
    1. 每管加入 8.5 µl 洗脱液、8.5 µl 引物液和 8.5 µl 片段化混合液。轻柔吹打 10 次混匀。将 PCR 管放入热循环仪中，程序设置如下：预热盖至 100 °C，94 °C 反应 8 分钟，然后 4 °C 保存。
      注意：此步骤旨在生成平均插入片段大小为 155 bp 的产物。若 RNA 样本的平均片段长度低于 200 bp，可跳过此步骤，直接进行第一链 cDNA 合成。

2. cDNA 合成

  1. 合成第一链 cDNA
    1. 从 -20 °C 取出第一链合成混合液，在室温下解冻。
    2. 预先设置热循环仪参数：加热盖选项设为 100 °C，随后依次设置为 25 °C 保持 10 分钟、42 °C 保持 15 分钟、70 °C 保持 15 分钟，最后维持在 4 °C。将此程序保存为 "Synthesize 1st Strand"。
    3. 将已解冻的第一链合成混合液离心管在 600 × g 下离心 5 秒。将 1 µl 逆转录酶与 9 µl 第一链合成混合液混合。
    4. 向每个离心管中加入 8 µl 第一链合成混合液与逆转录酶的混合物，轻轻吹打 6 次混匀。使用固定转速的小型台式离心机在 6.0 × g 下离心 4 秒，使液体沉至管底。将离心管放入热循环仪中，选择“Synthesize 1st Strand”程序。当热循环仪温度降至 4 °C 时，立即取出离心管，进入下一步“合成第二链 cDNA”。
  2. 合成第二链 cDNA
    1. 将热循环仪预热至 16 °C，加热盖预热至 30 °C。将第二链主混合液和重悬缓冲液置于冰上解冻。提前从 4 °C 取出磁性微珠试剂瓶，静置至少 30 分钟，使其恢复至室温。
    2. 向每个 PCR 管中加入 5 µl 重悬缓冲液。将第二链主混合液在 600 × g 下离心 5 秒，然后向每个 PCR 管中加入 20 µl。将 PCR 管放入已预热至 16 °C 的热循环仪中，孵育 1 小时。孵育完成后，从热循环仪中取出，使 PCR 管恢复至室温。
    3. 涡旋振荡磁性微珠，直至充分分散。向每个管中加入 90 µl 充分混匀的磁性微珠，轻轻吹打整个液体体积 10 次以混匀。室温孵育 15 分钟。将 PCR 管置于磁力架上，室温静置 5 分钟。
    4. 移除并弃去 135 µl 上清液，保持 PCR 管置于磁力架上进行乙醇洗涤。向每个管中加入 200 µl 新鲜配制的 80% 乙醇（注意不要扰动磁珠），室温孵育 30 秒。完全移除并弃去每个管中的上清液。重复该步骤，共进行两次 80% 乙醇洗涤。
    5. 将 PCR 管在磁力架上室温静置 5 至 10 分钟，使其干燥。将已解冻至室温的重悬缓冲液在 600 × g 下离心 5 秒。从磁力架上取下 PCR 管，向每个管中加入 17.5 µl 重悬缓冲液，轻轻吹打 10 次，充分混匀。室温孵育 2 分钟。
    6. 将 PCR 管置于磁力架上，室温静置 5 分钟，然后转移 15 µl 上清液（双链 cDNA）至 0.2 ml PCR 条形管中。
      注：此为可安全暂停的步骤，cDNA 可在 -20 °C 下保存最多 7 天。

3. 文库构建

  1. 腺苷酸3'末端修饰
    1. 从-20 °C取出A尾化反应混合液，在室温下解冻。预先设置热循环仪的程序：选择预热盖选项并设为100 °C，然后依次设置为37 °C孵育30分钟、70 °C孵育5分钟，最后保持在4 °C。将此程序保存为"ATAIL70"。
    2. 向每管中加入2.5 µl重悬缓冲液，再加入12.5 µl已解冻的A尾化反应混合液。轻柔吹打混匀10次，确保充分混合。将PCR管放入热循环仪中，选择程序ATAIL70。当热循环仪温度降至4 °C时，立即取出PCR管，进入下一步接头连接反应。
  2. 连接接头
    1. 从-20 °C取出相应的RNA接头管、终止连接缓冲液和重悬缓冲液，在室温下解冻。在实验步骤指示前，不要将连接反应混合液从-20 °C取出。从4 °C取出磁珠瓶，静置至少30分钟，使其升至室温。
    2. 将热循环仪预热至30 °C，并选择预热盖选项，设为100 °C。将已解冻的RNA接头管在600 × g下离心5秒。在使用前立即从-20 °C取出连接反应混合液，使用后立即放回-20 °C保存。
    3. 向每个样本管中加入2.5 µl重悬缓冲液，再加入2.5 µl连接反应混合液。使用后立即将连接反应混合液管放回-20 °C保存。向每个样本管中加入2.5 µl已解冻的RNA接头索引。轻柔吹打混匀10次，确保充分混合。
    4. 使用固定转速的小型台式离心机，在6.0 × g下离心4秒。将PCR管放入预热的热循环仪中，关闭盖子，在30 °C孵育10分钟。
    5. 从热循环仪中取出PCR管，向每管中加入5 µl终止连接缓冲液以终止连接反应。轻柔吹打混匀10次，确保充分混合。
    6. 按照步骤2.2.3–2.2.4所述重复洗涤操作，使用42 µl混合磁珠，弃去79.5 µl上清液。将PCR管置于磁力架上，室温下静置干燥5–10分钟。
    7. 将PCR条管从磁力架上取下，向每管中加入52.5 µl重悬缓冲液。轻柔吹打混匀10次，确保充分混合。室温孵育2分钟。将PCR管放回磁力架，室温静置5分钟或直至液体澄清。小心吸取每管中的50 µl上清液转移至新的0.2 ml PCR条管中，注意不要扰动磁珠。
    8. 按照步骤2.2.3–2.2.4所述重复洗涤操作，使用50 µl混合磁珠，弃去95 µl上清液。将PCR管置于磁力架上，室温下静置干燥5–10分钟 。
    9. 将PCR条管从磁力架上取下，向每管中加入22.5 µl重悬缓冲液。轻柔吹打混匀10次，确保充分混合。
    10. 室温孵育2分钟。将PCR管置于磁力架上，室温静置5分钟或直至液体澄清。小心吸取每管中的20 µl上清液转移至新的0.2 ml PCR条管中，注意不要扰动磁珠。此步骤为安全暂停点，cDNA可在-20 °C保存最多7天。

4. 文库扩增

  1. 富集DNA片段
    1. 将PCR预混液、PCR引物混合液和重悬缓冲液从-20 °C冰箱中取出，在室温下解冻。将磁珠瓶从4 °C冰箱中取出，静置至少30分钟，使其升至室温。
    2. 预先设置PCR仪的程序：选择加热盖预热功能并设为100 °C，然后设定初始变性条件为98 °C持续30秒，进行15个循环（每个循环包括98 °C变性10秒、60 °C退火30秒、72 °C延伸30秒），最后进行一次72 °C延伸5分钟，并在4 °C保存。将此程序保存为 "PCR."
    3. 将解冻后的PCR预混液和PCR引物管在600 × g离心5秒。向每个样本管中加入5 µl解冻的PCR引物，再加入25 µl解冻的PCR预混液。用移液器轻柔吹打整个液体体积10次，充分混匀。
    4. 将盖好盖的PCR条形管放入已预设程序的PCR仪中，关闭盖子并运行PCR程序。PCR完成后，将管子从PCR仪中取出，并置于冰上保存。
    5. 重复步骤2.2.3–2.2.4中的洗涤操作，使用50 µl混合磁珠，弃去95 µl上清液。将管子置于磁力架上，让样本在室温下空气中干燥5–10分钟。
    6. 将管子从磁力架上取下，向每个样本管中加入32.5 µl重悬缓冲液。用移液器轻柔吹打整个液体体积10次，充分混匀。室温孵育2分钟。将PCR管放回室温下的磁力架上静置5分钟或直至液体澄清。然后将30 µl上清液转移至新的0.2 ml PCR管中。
    7. 使用荧光计7对cDNA进行定量，并利用毛细管电泳系统8评估cDNA质量。
      注意：此步骤为安全暂停点，cDNA可在-20 °C保存最多7天。注意：该文库属于RNA测序文库。
      后续步骤将生成捕获文库。

5. 杂交、捕获与测序

  1. 多重杂交
    1. 从 -20 °C 中取出定制的水合探针、Cot-1 DNA、通用封闭寡核苷酸和适配器特异性封闭寡核苷酸，在冰上解冻。
    2. 在低吸附的1.5 ml离心管中，加入500 ng DNA（若同时 multiplex 4个样本，则每样本125 ng）、5 µl Cot-1 DNA（1 µg/µl）、1 µl通用阻断寡核苷酸、0.5 µl p7（6核苷酸）接头特异性阻断寡核苷酸（该用量可能需根据multiplex条件进行调整）和0.5 µl p7（8核苷酸）接头特异性阻断寡核苷酸（该用量可能需根据multiplex条件进行调整）。
    3. 将样品管放入真空浓缩仪中，管盖开口方向朝向与旋转方向相反。在45 °C下干燥20分钟，或直至液体完全蒸发。
    4. 用8.5 µl 2x杂交缓冲液、3.4 µl杂交组分A和1.1 µl无核酸酶水重悬干燥内容物。室温静置10分钟以充分重悬，每2.5分钟涡旋振荡一次。将重悬后的混合液转移至0.2 ml PCR管中，置于PCR仪中95 °C孵育10分钟。
    5. 从热循环仪中取出杂交样品管，加入2 µl浓度为1.5 pmol/µl的定制探针重悬液。或者，加入4 µl浓度为0.75 pmol/µl的定制探针重悬液。在65 °C条件下孵育杂交反应过夜（16–24小时）。
      注意：可使用不同供应商购买的探针，并应遵循制造商的说明。杂交步骤的持续时间也可能有所不同。
  2. 珠的制备与捕获
    1. 从4 °C取出链霉亲和素偶联的超顺磁性微珠，室温平衡30分钟。将10倍浓度洗涤缓冲液（I、II、III和严苛洗涤缓冲液）以及2.5倍浓度微珠洗涤缓冲液稀释，配制成1倍工作浓度的溶液。
    2. 将140 µl 1×洗涤缓冲液I分装至新的1.5 ml离心管中。将全部1×严格缓冲液和分装的1×洗涤缓冲液I置于预热至65 °C的金属浴中，孵育至少2小时。
    3. 每份捕获反应取100 µl链霉亲和素偶联的顺磁性微珠，加入1.5 ml离心管中。置于磁力架上，弃上清液。按每100 µl微珠加入200 µl微珠洗涤缓冲液，涡旋振荡10秒。置于磁力架上2–5分钟，或直至上清液澄清。上清液澄清后，弃去上清液，并重复洗涤一次，共完成两次洗涤。
    4. 去除珠洗缓冲液后，加入与初始起始体积相等的珠洗缓冲液（即，每次捕获100 µl。重悬后转移至0.2 ml PCR管中。将管置于磁力架上2–5分钟，或直至上清液澄清。弃去上清液。
    5. 将杂交样品和磁珠置于65 °C的热循环仪中，把杂交混合液转移至含有磁珠的管中，用移液器吹打10次混匀。在65 °C孵育45分钟，涡旋振荡后使用固定转速（6.0 × g）的台式小型离心机离心4秒。
  3. 珠子洗涤
    1. 从PCR仪中取出捕获管，加入100 µl预热的1×洗涤缓冲液I，涡旋振荡10秒以充分混匀。将混合液转移至新的低吸附1.5 ml离心管中。将管子置于磁力分离架上，静置2–5分钟，或直至上清液变澄清。弃去上清液。
    2. 加入200 µl预热的1x严格洗涤缓冲液，上下吹打10次混匀。65 °C孵育5分钟。将离心管置于磁力分离架上，静置2–3分钟或直至上清液变澄清。弃去上清液。严格洗涤步骤再重复一次，共洗涤两次。
    3. 加入200 µl室温1×洗涤缓冲液I，涡旋振荡2分钟以充分混匀。将离心管置于磁力分离架上，静置2–5分钟或直至上清液澄清。弃去上清液。
    4. 加入200 µl室温1×洗涤缓冲液II，涡旋振荡1分钟以混匀。将离心管置于磁力分离架上，静置2–5分钟或直至上清液澄清。弃去上清液。
    5. 加入200 µl室温1×洗涤缓冲液III，涡旋振荡30秒以混匀。将离心管置于磁力分离架上，静置2–5分钟进行分离，或直至上清液变澄清。弃去上清液。
    6. 从磁力架上取下离心管，加入 20 µl 无核酸酶水以重悬磁珠。用移液器上下吹打 10 次，充分混匀。
  4. 捕获后 PCR 扩增
    1. 将磁珠从4 °C取出，在室温下平衡30分钟。
    2. 从 -20 °C 中取出 2x 热启动 PCR 预混液和 PCR 引物混合物，在室温下解冻，然后置于冰上。通过将 27.5 µl 的 2x 热启动 PCR 预混液与 2.75 µl 的 PCR 引物 1 和 2.75 µl 的 PCR 引物 2 混合，制备文库扩增主混合液（这些体积适用于 1 个杂交文库加 10% 过量）。
    3. 在PCR管中加入20 µl磁珠及捕获的DNA，再加入30 µl文库扩增预混液，总体积为50 µl。盖紧管盖，涡旋振荡混匀。使用固定转速的迷你台式离心机在6.0 × g条件下离心4秒。
      1. 设置以下PCR程序：选择预热盖子选项并设为100 °C，然后设定初始变性为98 °C、45秒，进行10 - 12个循环的变性（98 °C、15秒）、退火（65 °C、30秒）和延伸（72 °C、60秒），最后进行一次终延伸循环（72 °C、60秒），随后在4 °C保存。
    4. 从PCR仪中取出样本，加入75 µl磁性 beads。充分混匀，室温孵育15分钟。
    5. 将离心管置于室温下的磁力架上静置 2 - 3 分钟，随后移除上清液。在磁力架上向磁珠中加入 200 µl 80% 乙醇，孵育 30 秒后移除上清液，进行洗涤。重复此步骤，共完成两次 80% 乙醇洗涤。
    6. 室温孵育5 - 10分钟，使磁珠干燥，避免过度干燥导致开裂。将磁珠重悬于22 µl Tris-EDTA pH 8.0（1x TE溶液）中，静置3分钟以促进洗脱。将样品置于磁力架上3 - 5分钟，随后转移20 μl洗脱产物至新的低吸附1.5 ml离心管中，注意避免磁珠残留。
    7. 使用荧光计对捕获的 cDNA 进行定量7 并使用毛细管电泳系统测定捕获的cDNA质量 8.
  5. 台式测序仪上样流程 9
    1. 将捕获的cDNA文库用含0.1% Tween 20的10 mM Tris-Cl pH 8.5稀释至终浓度为4 nM。在冰上解冻10 N NaOH和杂交缓冲液。使用前约30分钟，将桌面测序仪v2试剂盒盒1置于室温水中解冻。液面不得超过最大填充线 10请注意，此为特定测序平台的操作流程，具体步骤可能因制造商说明而有所不同。
    2. 在微量离心管中，将20 µl 10 N NaOH与980 µl无核酸酶水混合，配制1 ml 0.2 N NaOH（务必现配现用）。将PhiX文库（文库对照）稀释至4 nM：取2 µl 10 nM文库对照与3 µl含0.1% Tween 20的10 mM Tris-Cl（pH 8.5）混合。
    3. 将5 µl 4 nM文库与5 µl 0.2 N NaOH混合，涡旋振荡短暂混匀，使最终文库及文库对照变性。使用固定转速的微型台式离心机在6.0 × g条件下离心4秒。室温孵育5分钟以完成文库变性。
    4. 向含有10 µl变性文库的管中加入990 µl预冷的杂交缓冲液，得到20 pM的文库。标记变性后的20 pM文库及其日期，可在-20 °C保存最多3周。
    5. 将375 µl的20 pM文库对照与225 µl预冷的杂交缓冲液混合，得到浓度为12.5 pM的稀释文库对照。反复倒置数次以充分混匀溶液。
    6. 将594 µl变性的最终文库与6 µl 12.5 pM的变性文库对照混合，涡旋振荡以充分混匀。将混合后的样本文库与文库对照置于冰上暂存，待样本准备加载至台式测序仪试剂盒时再行使用。

6. 数据分析

  1. 序列质量评估
    1. 使用序列质量评估工具计算原始测序数据（fastq 文件）的质量11.
      注意：此步骤有助于在数据进行下游分析之前对其进行评估。该软件使用内置参数运行，并为每个fastq文件生成一组指标。
  2. 对齐
    1. 使用 Tophat2 将序列读段（fastq 文件）比对至参考人类基因组 hg19 和转录组 12 （版本 2.0.10），同时提供已知转录本作为 GTF 文件。输出结果为一种称为 BAM 文件的二进制比对格式。
    2. 使用 Samtools 执行排序和索引等后期处理步骤13 （版本 0.1.19）对 BAM 文件进行处理。使用 Picard 工具进行重复序列标记、SAM 文件重排序、插入片段大小计算，以及添加或替换读段群组14 （版本 1.84）
  3. RNAseq 质量评估
    1. 使用RNAseq质量评估工具计算RNAseq数据的一系列质量控制指标。该软件的输入为BAM文件 15 来自Tophat2比对的结果。输出为一个HTML文件，列出总读段数、重复序列数、比对上的读段百分比以及rRNA百分比。 等等。以及其他。
  4. 变异检测
    1. 使用 STAR（版本 2.4.0）16 进行比对，然后使用 GATK（版本 3.3-0）的 HaplotypeCaller 调用单核苷酸变异位点17遵循 GATK BAM 数据后处理步骤及过滤标准，对输出结果中的假阳性进行标记并剔除。
  5. 基因表达
    1. 使用 Tuxedo 软件套件中的 Cufflinks 软件（版本 2.1.1）计算基因表达水平18.
      注意：输入为来自 Tophat2 比对工具的 BAM 文件。输出在异构体、基因和转录本水平上生成，其中表达量以 FPKM（每千碱基每百万比对读段数）计算。
  6. 融合基因检测
    1. 使用 ChimeraScan 对每个样本进行融合基因检测19 （版本 0.4.5），Tophat Fusion20 定制与TRUP21使用 Oncofuse 对融合基因进行结构域注释22 （版本 1.0.9b2）

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结果

RNAseq捕获技术关键步骤的示意图如图1所示。为验证RNAseq捕获技术的有效性，选用了四种具有已知突变的癌细胞系（携带ABL1融合基因的K562细胞系、携带RET融合基因的LC2细胞系、携带PDGFRalpha融合基因的EOL1细胞系，以及携带FGFR3融合基因的RT-4细胞系）。将这四个样本混合后，在台式测序仪上以2×100 bp的双端读长进行测序，生成FASTQ文件。FASTQ文件通过一个包含五个主要组件的RNAseq分析流程进行处理：1）质量控制评估，2）比对至人类转录组，3）基因表达定量，4）融合基因检测，以及5）变异检测。比对生成的BAM文件用于检测单核苷酸变异并计算基因表达水平。融合基因通过融合检测软件（如TopHat Fusion，其可自行完成比对）进行识别，并利用融合检测软件对结果进行注释。

通过RNAseq与捕获法对基因表达进...

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讨论

RNAseq 捕获是一种介于 RNAseq 与微阵列技术之间的中间策略，用于评估转录组中特定的部分。捕获技术的优势包括成本降低、在台式测序仪上快速完成检测、高通量以及能够检测基因组变异。该方法可被调整用于表征非编码 RNA23、检测单核苷酸变异4-6、分析 RNA 剪接，并识别基因融合或结构重排24。此外，该方法还可应用于经过福尔马林固定并包埋在石蜡块中的临床样本或处理过的样本24,25。

与微阵列、实时定量PCR、Sanger测序和DNA测序相比，RNA测序捕获具有多项显著优势。微阵列技术受限于探针的交叉杂交和非特异性结合所导致的高背景信号。由于背景噪声的存在，低表达基因的定量受到限制，而高表达基因的检测则易受信号饱和的影响1。与RNA测序捕获相比，实时定量PCR难以实现重复性。此外，RNA测序能够检测新转录本，所需起始样本量更少，并可检测可变剪接事件26。与Sanger测序相比，RNA测序具有更高的通量，且可用于分析低表达的miRNA。尽管Sang...

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披露

S.R. 获得诺华（Novartis）和Ariad Pharmaceuticals公司资助，用于开展临床试验。S.R. 的直系亲属持有强生公司（Johnson and Johnson）的股票。

致谢

我们特别感谢 Ezra Lyon、Eliot Zhu、Michele Wing、Esko Kautto 和 Eric Samorodnitsky 提供的技术支持。同时感谢 Jenny Badillo 为我们团队提供的行政支持。我们感谢俄亥俄超级计算中心（OSC）为我们分析工作提供的磁盘空间、计算资源及技术支持。我们感谢俄亥俄州立大学韦克斯纳医学中心综合癌症中心（CCC）对本研究工作的行政支持。S.R. 及其团队的研究得到了美国癌症协会（MRSG-12-194-01-TBG）、前列腺癌基金会青年研究者奖、美国国立人类基因组研究所（NHGRI，项目编号：UM1HG006508-01A1）、Fore 癌症研究基金会、美国肺脏协会以及 Pelotonia 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Thermomixer REppendorf21516-166
Centrifuge 5417REppendorf5417R
miRNeasy Mini KitQiagen217004
分子生物学级乙醇Sigma AldrichE7023-6X500ML
24 x 1.5 ml 热块Eppendorf21516-166
MiSeq 试剂盒 v2（300 个循环）IlluminaMS-102-2002
MiSeq 桌面测序仪Illumina
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
TruSeq Stranded Total RNA Kit 配套 RiboZero Gold SetAIlluminaRS-122-2301
25 rxn xGen® 通用阻断寡核苷酸 - TS-p5IDT127040822
25 rxn xGen® 通用阻断寡核苷酸 - TS-p7(6nt)IDT127040823
25 rxn xGen® 通用阻断寡核苷酸 - TS-p7(8nt)IDT127040824
Agencourt® AMPure® XP - PCR 纯化磁珠 Beckman-CoulterA63880
Dynabeads® M-270 链霉亲和素磁珠Life Technologies65305
COT 人源 DNA，荧光级，1 mgRoche Applied Science05480647001
Qubit® 检测管 Life TechnologiesQ32856
Qubit® dsDNA HS 检测试剂盒Life TechnologiesQ32851
SeqCap® EZ 杂交与洗涤试剂盒 （24 或 96 次反应）Roche NimbleGen 05634261001 或 05634253001 
Qubit® 2.0 荧光计 Life TechnologiesQ32866
10 x 2 ml IDTE pH 8.0（1x TE 溶液）IDT
Tween20 BioXtraSigmaP7949-500ML
无核酸酶水Life TechnologiesAM9937
C1000 Touch™ 梯度PCR仪，配备 96–孔快速反应模块Biorad185-1196
SeqCap EZ 杂交与洗涤试剂盒Roche Applied Science05634253001
SuperScript II 逆转录酶 200 U/μlLife Technologies18064-014
D1000 ScreenTapeAgilent Technol. Inc.5067-5582
Agencourt RNAClean XP - 40 mlBeckman Coulter IncA63987
RNA ScreenTapeAgilent Technol. Inc.5067-5576
RNA ScreenTape LadderAgilent Technol. Inc.5067-5578
RNA ScreenTape 样品缓冲液Agilent Technol. Inc.5067-5577
氢氧化钠Sigma72068-100ML
DynaBeads MyOne 链霉亲和素 T1Life Technologies65602
DYNAMAG -96 侧磁架Life Technologies12331D
氯仿SigmaC2432-1L
KAPA HotStart ReadyMixKAPA BiosystemsKK2602
NanoDrop 2000 分光光度计Thermo Scientific
My Block Mini 干式恒温器BenchmarkBSH200
D1000 试剂Agilent Technol. Inc.5067- 5583
Vacufuge PlusEppendorf022829861 

参考文献

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RNA RNA PCR
靶向RNA测序实验用于分析基因表达与基因组变异
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