通过内在血管化进行组织工程 在体 内 组织工程室

摘要

本指南介绍如何在组织工程腔室内利用显微外科动静脉环或贯穿式血管蒂结构构建体内血管化组织。所生成的血管化组织可用于器官再生、组织缺损修复，以及药物筛选和疾病模型研究。

摘要

在重建外科领域，目前自体组织重建方法存在操作复杂、成本高昂且以一处缺损修复另一处缺损的问题，临床亟需替代方案。组织工程有望满足这一日益增长的需求。然而，大多数组织工程策略因血管化不足，难以生成稳定且具有功能的组织替代物。本文重点介绍一种 体内 组织工程腔室模型中的内在血管化，是指将灌注的动脉和静脉以动静脉环或贯通式血管蒂的构型引入一个受保护的中空腔室内。在此基于腔室的系统中，血管新生的芽状出芽从动静脉血管发生，同时该系统可吸引缺血和炎症驱动的内源性细胞迁移，逐步使腔室空间被纤维血管组织填充。在构建腔室时植入外源性细胞/基质可增强细胞存活，并决定所形成工程化组织的特异性。我们的研究表明，该腔室模型可成功生成多种组织，如脂肪、心肌、肝脏及其他组织。然而，仍需进行改进与优化，以确保目标组织的形成具有稳定性和可重复性。本文介绍了一种标准化操作流程，用于构建两种不同的血管化组织工程腔室模型 体内.

引言

利用组织工程技术构建具有功能的血管化组织，是再生医学领域的一个新兴范式。^1,2 目前已开发出多种组织工程方法，用于生成新的健康组织，以替代受损组织或有缺陷的器官，^3-6 这些方法在小型动物模型中进行了实验，展现出良好的临床应用前景。^7,8 然而，血管化仍是组织工程面临的主要挑战之一，限制了其构建具有临床应用规模组织的潜力。⁹

目前用于使组织血管化的方法主要遵循外源性途径，即新生血管从受体的血管床长出，并侵入植入的组织构建物中¹⁰ 或一种内在血管化途径，其中血管与新发育的组织同步生长和扩展。¹¹ 外源法传统上涉及将细胞接种到支架上 体外 并将完整的构建物植入活体动物体内，期望原本由培养基提供的营养物质能够通过血液循环供给。^12,13 该概念过于简单化，因为血管长入速度过慢，且仅适用于非常薄的植入物（<1-2毫米厚）的组织仍可保持活性。通过充分且快速的血管化来提供营养和氧气，是构建更复杂、更大体积的组织工程替代物（如骨、肌肉、脂肪和实体器官）成功的关键所在。^14,15 内在血管化具有促进更大组织构建物发育的潜力，其组织生长与不断扩展的血液供应相匹配。一种设计是 体内 植入带有或不带有细胞接种支架的血管蒂腔室。^5,6 这为生成更厚的、具有内在血....

方案

本文所述方案已获得澳大利亚墨尔本圣文森特医院动物伦理委员会的批准，并严格遵循澳大利亚国家卫生与医学研究委员会指南进行。

注意：下文描述了两种腔室方案。两种不同的模型及其特定的腔室设计如图1所示。腔室（1）由聚碳酸酯制成（用于大鼠动静脉袢模型），呈圆柱形，内径为13 mm，高度为4 mm。腔室壁上设有一个窗口，可使血管蒂无阻碍地进入。第二种模型（用于大鼠贯通式血管蒂腔室模型）的腔室由聚丙烯酸酯制成，呈长方体形（内部尺寸为10 × 8 × 4 mm³），在相对两侧各有一个1.5 mm的开口，以容纳穿过腔室的股动脉和股静脉。

1. 大鼠动静脉环路腔室模型（每只动物一个腔室）

注意：在开始手术前，确保所有器械均已正确灭菌。同时，应将器械放置在无菌毛巾上，并置于距离手术区域适当的位置，以避免手术过程中发生污染。

1. 手术前动物准备
   1. 选用体重至少250 g的大鼠，因其血管较大，便于构建动静脉环路。
   2. 通过吸入4%异氟烷对动物进行麻醉。通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉深度足够。麻醉后，在整个手术过程中通过吸入2%异氟烷维持充分的麻醉状态 。
   3. 将动物仰卧置于加热垫上，并在眼睛表面涂抹无菌润滑剂，以防止手术期间角膜干燥。
   4. 使用电动剃刀剃除双侧腹股沟区域的毛发，并用湿润纱布擦净残留毛发。
   5. 用氯己定/70%乙醇溶液对术区进....

结果

组织工程舱的显微外科构建方法如上文方案所述。舱内生成的组织可按照方案步骤3所述进行组织学检查。体内血管化舱已成功用于多种组织类型的工程化构建（图2），包括利用新生大鼠心肌细胞构建的心脏组织（图2A）、利用大鼠骨骼肌成肌细胞构建的肌肉组织（图2B），以及利用源自脂肪组织细胞外基质的水凝胶构建的脂肪组织（图2C）。

可使用体视学分析系统或ImageJ软件对组织进行形态计量学评估。^{3,4,8,17,22,29} 除对各种组织成分进行定性评估外，体视学系统还可实现对特定组织体积的无偏定量分析。例如，利用体视学系统结合视频显微镜，可对凝集素（啮齿类动物内皮细胞的标记物）染色的横切面（图3）进行分析，以估算所获取组织构建物的血管体积。类似定量方法也可用于评估其.......

讨论

微循环的构建目前主要通过两种方法进行研究。第一种方法是在构建物内形成高度相互连通的血管网络 体外 因此，当植入后，宿主血管床的毛细血管会通过一种称为吻合（inosculation）的过程与移植构建物中的毛细血管相连接，从而确保营养物质不仅送达周边区域，也输送至核心部位。^21,32,33 这称为预血管化。第二种方法旨在直接增强宿主自身的血管系统 体内以便毛细血管出芽发生在植入细胞分化和组织生长之前或同时进行。^17,34

本文介绍的体内组织工程腔室技术方案，通过将动脉和静脉以动静脉袢或贯通式血管蒂的构型置于一个受保护的空腔内，利用后一种原理，随时间推移促进大量新生毛细血管的出芽与形成。³ 该腔室技术的优势包括：（1）无需进行体外操作；（2）可形成完全自体来源的血管网络，不会被宿主排斥；（3）无需经历1至7天的吻合期，避免组织构建物在此期间发生缺血风险。^35,36

然而必须指.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 把 15 号刀片手术刀	Braun	BB515
1 把带齿 Adson 镊子	Braun	BD527R
1 把持针器	Braun	BM201R
1 把双极电凝器	Braun	US335
1 把显微持针器 B-15-8.3	S & T	00763
1 把显微扩张镊 D-5a.2	S & T	00125
1 把显微珠宝镊 JF-5	S & T	00108
1 把直头显微剪刀 SAS-11	S & T	00098
1 把弯头显微剪刀 SDC-11	S & T	00090
2 把单夹 B-3	S & T	00400
2 根 10/0 尼龙缝线	S & T	03199
1 根 6/0 尼龙缝线	Braun	G2095469
2 根 4/0 丝线缝线	Braun	C0760145
1% 利多卡因（Xilocaine）	Dealmed	150733	10 mg/ml
肝素钠	Dealmed	272301	5,000 UI/ml
乳酸林格液	Baxter	JB2323	500 ml
1 个穹顶形组织工程腔室	定制
1 个灌流腔室	定制
凝集素 I，扁豆状木蓝（Griffonia Simplicifolia）	Vector Laboratories	B-1105	1.67 μg/ml
肌钙蛋白 T 抗体	Abcam	Ab8295	4 μg/ml
人特异性 Ku80 抗体	Abcam	Ab80592	0.06 μg/ml
结蛋白（Desmin）抗体	Dako	M0760	2.55 μg/ml
细胞示踪染料 CM-DiI	Thermo Fisher Scientific	C-7000	3 mg/106 cells
戊巴比妥钠（Lethabarb）	Virbac Animal Health	LETHA450	325 mg/ml
柔性加热垫	Redzone Heating	RZ/Medium