方法文章

通过超声心动图成像评估横主动脉缩窄小鼠模型中的心脏形态与功能变化

DOI：

10.3791/54101

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2016年6月21日

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1Department of Physiology and Biophysics, University of Washington

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本实验方案的目的是利用B型和M型超声心动图以及彩色/脉冲波多普勒成像，无创性地评估经主动脉横缩手术建立的小鼠心脏病模型中心脏结构和功能的变化。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小鼠横断性主动脉缩窄（TAC）已被用作研究心肌肥厚和心力衰竭机制的重要模型1。在心脏病动物模型中，评估心脏形态和功能实时变化的可靠无创方法至关重要。经胸超声心动图是无创评估心脏结构和功能的重要工具2。本文中，我们采用高分辨率超声成像系统，在TAC小鼠模型中随时间监测心肌重构及心力衰竭的进展。通过B型、M型和多普勒成像，精确评估TAC术后小鼠的心肌肥厚、心室扩张及功能恶化情况。利用彩色多普勒和脉冲波（PW）多普勒成像，无创测量TAC所造成主动脉缩窄处的压力梯度，并评估小鼠的二尖瓣血流。因此，经胸超声心动图成像可为心脏病小鼠模型提供全面的心脏尺寸和功能无创测量手段。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

诸如主动脉缩窄（TAC）和心肌梗死（MI）的小鼠心脏病模型已被证实对研究疾病机制以及开发新的治疗策略具有重要价值3。TAC最初会引发代偿性心肌肥厚，但长期的压力超负荷将导致心脏扩张和心力衰竭4。主动脉狭窄的紧密程度直接决定了心肌肥厚的程度及其向心力衰竭的转变。在这些研究中，对主动脉狭窄处压力梯度进行无创且可靠的测量至关重要。多普勒成像已被用于评估TAC引起的压力梯度5，这是一种基于导管测压的无创替代方法。

超声心动图已广泛用于非侵入性地测量小鼠的心脏形态以及收缩和舒张功能6-8。二维B型成像用于检测心脏的异常运动或结构改变。一维M型成像用于心脏尺寸和收缩力的定量分析。近年来，彩色多普勒和脉冲波多普勒成像已应用于啮齿类动物超声检查，在超声心动图中具有广泛的应用，包括血流方向和速度的测量，以及收缩和舒张功能的评估9。

采用B型、M型、彩色多普勒及脉冲波多普勒模式的超声心动图对心脏功能进行纵向实时监测，可全面评估生理和病理条件下小鼠的心脏结构与功能。本文详细描述了利用超声心动图成像技术监测小鼠在经胸主动脉缩窄术（TAC）或假手术后动态心脏形态学及功能变化的方法。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方案遵循华盛顿大学机构动物护理和使用委员会的指导原则。

1. 成像前的手术操作与准备

  1. 对C57BL/6小鼠进行TAC或假手术处理，方法如前所述10.
  2. TAC 或假手术一周后，在诱导室中使用混有 1 L/min 氧气的 2% 异氟烷麻醉小鼠2通过捏压脚趾或尾巴确认动物无反应，以确保麻醉效果。麻醉期间使用兽医用眼膏涂抹眼睛，防止角膜干燥。 去除胸部毛发，使用脱毛膏。用70%乙醇对小鼠皮肤进行消毒。
  3. 将小鼠仰卧位固定于动物操作平台。为维持稳定的麻醉水平，使用鼻罩输送0.5 - 1%异氟烷与1 L/min氧气的混合气体。2.
  4. 将电极凝胶涂抹于小鼠足部，并用胶带将其固定在电极板上。
  5. 插入直肠探头以监测体温。通过加热垫或加热灯将体温维持在37 °C。
  6. 在小鼠胸部涂抹一层预热的超声耦合剂，主要覆盖心脏区域。注意：成像结束后，用无菌纱布擦除超声耦合剂并擦干小鼠。

2. 在主动脉弓切面中，使用B型和多普勒成像评估横位主动脉缩窄

  1. 使用B模式设置获取主动脉弓切面，以观察主动脉、主要动脉分支及缩窄部位。
    1. 尽可能将平台左侧向上倾斜，使小鼠转为左侧卧位。用手持支架将超声探头保持垂直位置，并沿右侧胸骨旁线置于胸部，探头缺口朝向小鼠下巴。 注意：降低探头时不要压迫小鼠胸壁；仅需施加最小程度的压力。
    2. 在肩胛骨水平将探头向上倾斜，并轻微顺时针旋转，直至显示主动脉弓。观察横主动脉缩窄部位，该部位位于无名动脉（IA）与左颈总动脉（LCCA）分叉之间（图1）。
      注意：假手术小鼠中未检测到缩窄。
  2. 点击工作站上的"彩色多普勒"按钮，切换至彩色多普勒模式，以监测通过缩窄部位的血流方向和速度。点击"动态存储"按钮获取并保存图像。
  3. 点击"PW多普勒"按钮，切换至脉冲波多普勒模式，将取样容积（虚线光标框）置于缩窄部位远端，寻找速度最高的狭窄射流，然后点击"PW多普勒"按钮获取主动脉血流波形并测量峰值速度（图2）。
  4. 使用修正的伯努利方程计算缩窄部位的压差：压差 = 4 × Vmax2。仅纳入压差在40至80 mmHg范围内的小鼠进行后续分析。

3. 在胸骨旁长轴切面中，使用B型和M型超声成像评估心脏尺寸与收缩功能

  1. 将小鼠仰卧于平台上，垂直握持探头，使探头凹槽朝向小鼠头部。将探头沿胸壁平行于左侧胸骨旁线下降，并逆时针旋转30°。
  2. 使用B型成像获取完整的长轴图像 "矢状" 心脏切面图像。调整探头角度和聚焦深度，以清晰显示左心室、室间隔壁以及少量右心室壁。保存图像，用于后续测量心壁厚度和心腔大小。使用 "心脏功能检测套餐"选择参数，如IVS或LVAW、LVID和LVPW，然后点击图像以绘制每个参数对应的测量线，从而获得测量值。
  3. 观察心壁运动模式，并检查是否存在可能的运动异常，包括无动力、低动力及不同步现象。
    注：无动症和运动减弱分别指心壁运动的完全丧失和部分减弱。不同步性指心壁运动不规则且不协调。
  4. 切换至M型模式，在乳头肌水平将M型光标垂直置于左心室壁，采集图像以用于后续测量心脏尺寸和缩短分数（fractional shortening）图3).

4. 在胸骨旁短轴切面中，使用B型和M型超声成像评估心脏形态与功能

  1. 从胸骨旁长轴切面，将探头顺时针旋转90°获得胸骨旁短轴切面。调整探头位置，以获得水平横截面图像。 "横断面" B模式下心脏的切面图像，两个乳头肌清晰可见，位于右侧（2点和4点位置）。
  2. 切换至 M 型模式，将 M 型取样线置于左心室中段水平。采集并储存图像，用于后续测量心室壁厚度、心腔大小及缩短分数。图4）。使用 "心脏检测套餐"在短轴（SAX）图像中选择参数，包括室间隔（IVS）或左室前壁（LVAW）、左室内径（LVID）和左室后壁（LVPW），然后点击图像以绘制各参数对应的测量线，获取测量值。
    注意：此处获得的测量值应与胸骨旁长轴切面所获得的测量值密切相关。图5).

5. 在心尖四腔心切面中，使用多普勒成像评估收缩期和舒张期功能

  1. 获取心尖四腔切面，以显示左心室和右心室，心房位于屏幕底部。在B模式下，从短轴切面开始，倾斜平台的左上角，使小鼠头部向下，并将探头朝向小鼠的右肩。这实际上是获得心脏的"冠状面"视图，从心尖方向向上观察。
  2. 在B模式下观察二尖瓣，并切换至彩色多普勒模式，将取样容积（虚线光标框）置于二尖瓣瓣尖处。
  3. 切换至脉冲波多普勒（PW Doppler）模式，以评估通过二尖瓣的血流模式。将多普勒探头光标与二尖瓣血流方向平行对齐。使用小于20°的探头角度测定峰值流速（图6）。
  4. 保存图像以供后续测量。使用"心脏分析软件包"，并选择"二尖瓣血流（MV flow）"。点击各个参数，并绘制相应直线以获取测量值。可测量的参数包括：E峰流速（舒张早期，心室主动舒张充盈）、A峰流速（舒张晚期，心房收缩充盈）、二尖瓣等容舒张时间与等容收缩时间（IVRT和IVCT）、以及射血时间（ET）。
  5. 通过公式 MPI = (IVCT + IVRT)/ET 计算心肌性能指数（MPI）。

6. 动物术后处理

  1. 必要时向手术动物腹腔注射镇痛剂和/或无菌生理盐水。
  2. 让动物俯卧于加热垫上恢复。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。动物在完全恢复之前，不得放回与其他动物同居的环境中。

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结果

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图1显示了假手术（图1A）或TAC手术（图1B）小鼠心脏主动脉弓切面的B型超声图像。图中可见主动脉弓、无名动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉。注意，在TAC小鼠心脏中可清晰观察到主动脉狭窄，而假手术组则无此现象。图2A展示了主动脉切面的彩色多普勒图像。通过脉冲波多普勒（PW Doppler）成像记录了狭窄部位跨壁主动脉血流的波形（图2B）。成功的TAC手术将导致狭窄下游血流速度显著升高（通常TAC小鼠中约为~4 m/sec）。根据改良的伯努利方程，利用峰值流速计算出狭窄处的压力阶差（图2C）。

图3显示了假手术组（图3A）和TAC心脏（图3B）的胸骨旁长轴...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

超声心动图已广泛用于评估心脏疾病啮齿类动物模型的心脏功能2,6与压力-容积环测量等侵入性或终点性方法相比11 和 离体 工作心脏12，超声心动图提供了一种强大且无创的工具，用于评估活体动物持续发生的心脏结构和功能变化。为获得可靠的数据，保持体温和心率在生理范围内至关重要13 通过仔细调节加热装置和麻醉水平。所有图像均应按照标准化成像流程进行一致地采集和分析，以便于不同品系或基因型小鼠之间的比较。

TAC 常用于在小鼠中诱导心肌肥厚和心力衰竭1。通过多普勒成像无创测量缩窄部位的压力梯度，可可靠地评估小鼠压力超负荷的程度。成功的 TAC 通常会产生 ≥40 mmHg 的压力梯度。只有经历相似程度压力超负荷的小鼠才应纳入后续分析，而压力梯度过低或过高的小鼠应被排除。TAC 术后，小鼠通常在 1–2 周内出现心肌肥厚，4 周后出现心脏扩张，具体表现取决于压力超负荷的程度以及所用小鼠的遗传背景。如上所述，可通过超声心动图成像可靠地评估 TAC 术后心脏动态重塑及功能...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作部分由美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所资助，资助编号为 R00HL0908076 和 R01HL116507（授予 Q.L.）。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
麻醉设备Harvard Apparatus, 84 October Hill Road
Holliston, MA		723015
Vevo 2100 成像系统VisualSonics Inc., 3080 Yonge Street Suite 6100, Box 66, Toronto, Ontario, CanadaVevo 2100
Aquasonic 超声耦合剂Parker Laboratories, 286 Eldridge Rd, Fairfield, NJ 03-50
异氟烷Piramal Healthcare, Inc, 3950 Schelden Circle
Bethlehem, PA 		NDC 66794-017-25
F/air 麻醉气体过滤装置A.M. Bickford, Inc, 12318 Big Tree Rd, Wales Center, NY 80120

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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