从青蛙和蝾螈活体卵母细胞中分离巨型灯刷染色体

摘要

我们介绍了一种从青蛙和蝾螈活体卵母细胞中分离巨型转录活跃的灯刷染色体的简便技术。我们描述了如何观察这些染色体 "存活的" 通过相差或微分干涉对比观察，并如何固定以进行荧光标记 原位 杂交或免疫荧光染色。

摘要

我们描述了研究蛙类和蝾螈卵母细胞（即未产出的卵）中巨大且具有转录活性的灯刷染色体（LBCs）的方法。单条LBC的长度可达1毫米，位于一个巨大的细胞核内，该细胞核直径本身可达0.5毫米。染色体的巨大尺寸使得通过光学显微镜对活跃基因进行无与伦比的观察成为可能，但同时需要特殊的实验技术来分离细胞核、去除核膜，并将染色体铺展在显微镜载玻片上。卵母细胞核，也称为生发泡（GV），在一种允许核内肌动蛋白部分凝胶化的培养基中被分离，以维持LBC精细结构的完整性。此步骤在解剖显微镜下使用珠宝镊子手工完成。接下来，再次使用珠宝镊子手工去除核膜。随后迅速将核内容物转移至另一种培养基中，该培养基可分散肌动蛋白凝胶，使完整的LBC沉降到显微镜载玻片表面。此时可通过相差显微镜或微分干涉差显微镜观察LBC及其他核内细胞器，但布朗运动的存在会遮蔽更精细的结构细节。为了实现高分辨率显微观察或分子分析，需对整个样品进行离心处理，使脆弱的LBC牢固地附着于载玻片上。随后用多聚甲醛进行短暂固定，继而进行免疫荧光染色或原位杂交。LBC处于转录活跃状态，其巨大的尺寸使得利用共聚焦显微镜或超分辨率显微镜在单个基因水平上开展分子分析成为可能。

引言

大多数脊椎动物（有袋类和胎盘哺乳动物除外）会产生富含卵黄的大卵。尽管这些卵有时体积巨大，但它们仍是单细胞，且在雌性卵巢内即已达到最终大小。卵巢中的卵称为卵母细胞，每个卵母细胞通常含有一个巨大的细胞核，该细胞核自20世纪早期起被称为胚泡^th 世纪时的生发泡，或简称为GV。¹ 常见实验用蛙类的卵母细胞， Xenopus laevis 和 Xenopus tropicalis，分别达到最大直径1.2 mm和0.8 mm（图1）。这两种蛙类成熟卵母细胞的卵母细胞核（GV）直径为0.3 - 0.4 mm（图2、图3）。蝾螈的卵母细胞和卵母细胞核通常更大。墨西哥钝口螈的完全成熟卵母细胞， 墨西哥钝口螈直径超过2 mm，其中核仁（GV）约为0.5 mm，因此这些细胞核肉眼可见，且可进行多种操作，而这些操作在典型的体细胞核上是无法实现的。

同样引人注目的是生发泡（GV）内染色体的巨大尺寸，这一事实早在20世纪末就已被认识。^th 世纪。单个染色体的 Ambystoma 以及其他蝾螈的长度可达1毫米（图4、图5）。那些 非洲爪蟾 明显更小，但长度可达100 µm或以上，因此比大多数生物典型的体细胞染色体要大得多。卵母细胞染色体的一个重要特征是....

方案

有关青蛙和蝾螈的一般信息以及实验动物来源，可访问以下网站获取：Xenbase（http://www.xenbase.org）和 Sal-Site（http://www.ambystoma.org）。本实验方案遵循卡内基科学研究所胚胎学系的动物护理指南。

1. 溶液

1. 制备 10 L "蛙水"：加入10 mL的1 M CaCl₂₂ 和10 mL 1 M NaHCO₃₃ 至10 L去离子水或去氯水₂O，同时搅拌。
2. 配制1 L 20%多聚甲醛：配制1 L 4 mM Na₂CO₃在通风橱中加入200 g粉末状多聚甲醛，加热至约80 ℃ ^oC以溶解。冷却后，用滤纸过滤。注意：多聚甲醛具有毒性，必须小心操作。或者，可购买市售的多聚甲醛溶液。
3. 配制1升两栖动物麻醉溶液：将1.5 g氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐加入1 L蛙用养殖水中，混匀。室温保存。
4. 配制1升卵母细胞培养基OR2¹⁴：82.5 mM NaCl，2.5 mM KCl，1 mM CaCl₂，1 mM MgCl₂，1 mM Na₂HPO₄，5 mM HEPES（来自500 mM 储液，pH 8.3）。最....

结果

要观察巨型灯刷染色体，首先需要从青蛙或蝾螈中分离卵母细胞。 图1 显示从青蛙卵巢中取出后置于缓冲盐溶液中的一组成熟卵母细胞， 非洲爪蟾此类卵母细胞在室温下可保持良好状态数天。随后用珠宝匠镊子在生理盐水溶液中去除卵母细胞的细胞核（或生发泡），图2）或在油中（图3）。通过轻轻压碎在油中分离的细胞核，可用相差显微镜或微分干涉差显微镜（DIC）观察其核内容物。若要观察在盐溶液中分离的细胞核内容物，需先用钟表镊去除核膜，使内容物沉降到载玻片上。随后将样品离心，使染色体牢固附着于载玻片，之后可用抗体对染色体进行染色（图4）或进行处理 原位 杂交。蝾螈的灯刷染色体比青蛙的大得多（图5在这两种情况下，单个转录单元（基因）可被视为从染色体轴侧向伸出的染色质环。

讨论

最初的观察 "活体" 80年前，美国生物学家William Duryee通过手工分离青蛙和蝾螈的卵母细胞生发泡制备了LBCs，¹⁹ 在相差显微镜和微分干涉差显微镜（DIC）出现之前，在荧光免疫染色和荧光原位杂交（FISH）技术应用之前。为了在单个基因水平上研究染色体结构和转录的细节，需开发出将灯刷染色体（LBCs）固定于玻片、以接近生命状态保存其形态，并在不破坏其基本形态的前提下应用分子技术的方法。几乎每一种实现这些目标的技术都需要根据所研究物种进行一定调整，并在保持自然形态与实现分子表征之间做出权衡。例如，有尾两栖类的卵母细胞核（GVs）和灯刷染色体（LBCs）因其体积巨大，且其核内容物在适宜介质中极易扩散，因而特别易于操作。然而直到最近，人们对这些物种的基因组信息知之甚少，导致难以将丰富的细胞学特征与分子细节相对应。相反，来自其他物种的LBCs则 非洲爪蟾 与有尾两栖动物相比，其体型相当小（图5），但两者的基因组 X. tropicalis 和 X. laevis 已测序且注释较为完善。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
多聚甲醛（试剂级，结晶状）	Sigma-Aldrich	P6148-500G	尽管许多实验方案中有相关警示，但浓溶液可在室温下长期保存
3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐	Sigma-Aldrich	A5040-100G	有时称为 MS-222
Ethicon RB-1 1/2 圆弧锥形针 3-0 缝合线	VWR	95057-000
Paraplast（石蜡）	Sigma-Aldrich	P3558-1KG
p-苯二胺	Sigma-Aldrich	P6001
明胶	杂货店		市售Knox明胶即可满足要求
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher Scientific	P10144
Gold Seal 盖玻片  22 x 22 mm #1 1/2（厚度 0.16 - 0.19 mm）	Electron Microscopy Sciences	63786-01	该厚度盖玻片适用于超分辨率显微镜
Dumont #5 镊子	Electron Microscopy Sciences	72700-D	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx
石蜡油（轻质）	EMD Chemicals	PX0047-1	用于在油中分离GVs
粘附式 in situ PCR 和杂交腔室（25 µL）	BioRad	Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201	http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers
硅胶隔离器	Grace-Biolabs	从产品目录链接中选择	http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html
Coplin 染色缸和染色皿	Electron Microscopy Sciences	从产品目录链接中选择	http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx