一种快速战略新Faustoviruses从环境样品使用隔离<em> Vermamoeba vermiformis</em
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Summary
We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
Abstract
巨病毒的隔离是病毒学的新时代的极大兴趣，特别是因为这些巨大的病毒都与原生生物。巨病毒可能是原生生物的许多种潜在的病原。它们属于Megavirales的最近描述的顺序。新血统Faustovirus已经从污水样品中分离是远亲哺乳动物病原体非洲猪瘟病毒。该病毒还具体到了amoebal主机，Vermamoeba vermiformis，保健水系统常见的原生生物。 这是继续以扩大其基因型收集并研究了其泛基因组中分离新Faustovirus基因型是至关重要的。我们通过改进使用抗生素和抗真菌组合以避免阿米巴共培养的细菌和真菌污染和有利于病毒增殖开发的附加菌株的分离的新策略。我们还实施了新的starvatioñ中保持V. vermiformis在病毒共培养的最佳条件。最后，我们使用流式细胞术而非显微镜观察，这是费时的，以检测细胞病变效应。我们获得了从污水样品2株，证明了这种方法的效率，从而扩大Faustoviruses的收集，以便更好地了解他们的环境，宿主特异性和遗传的内容。
Introduction
巨病毒，特别是那些属于Megavirales顺序的发现，完全在粒度和基因组的复杂性的角度改变的病毒的世界。病毒以前被认为是小的实体，以及巨病毒的出现打破所有规则。1宏基因组数据表明巨病毒不仅在环境，2-5而且在人类中的普遍存在6因此，仍然需要来搜索这些病毒大规模。这些巨型病毒的多样性进行了筛选各种人体标本12,13和环境样品抽检不仅有各种水生环境及其相关的沉积物在世界范围内，7-11也评估7,9的棘阿米巴多食巨病毒是采用原生生物吞噬，这主要是棘阿米巴属共培养分离出14-16巨病毒的整个集合当时也从这个指定的原生生物的主机，这使得科学界对限制棘阿米巴属其研究和分离过程分离出来。显然，这依赖于一个单一的宿主物种已导致被忽视病毒的很大一部分。该巨病毒，CroV，是与高度能动海洋原生动物馆roenbergensis分离的事实，17,18表明，有必要使用范围更广原生动物以发现新的谱系或巨病毒家族。 Reteno 等人成功地选择其他原生动物细胞宿主以前从未被使用的，以及分离出的病毒巨头新Asfa酒店相关谱系（新命名的Faustovirus）。19
在试图为了扩大这个病毒家族的成员来隔离新Faustovirus基因型，我们修改隔离程序，并用它们来筛选能够收获新Faustoviruses的环境样本。然后，我们描述的整个协议来表征新菌株。我们评估Vermamoeba vermiformis，最常见的自由生活的原生生物在人类环境中发现的，20-22这是已经在第一Faustovirus原型E12 19此原生生物目前仍在主机的特异性Faustovirus的分离中使用。我们知道，没有任何已知病毒巨头病原是该变形虫，因为在我们的实验室中表明阿米巴裂解或病毒生长没有尝试种植其他巨型病毒。出于这个原因，我们认为五vermiformis是众所周知的隔离新Faustoviruses最好的和最独特的电池支持。
Protocol
1.样品采集收集来自不同的环境和区域70的样品。在这种情况下，使用以下命令：5脏水样本圣徒皮埃尔·德·Meyzoargues（法国），从马赛（法国）的博雷利公园湖中15个样品的村; 15海水样品从Samena在马赛（法国），从阿尔卑斯山（法国）25河水样品的岩石口泥沙，最后，从污水中10个样品中拉西约塔（法国）。 涡旋样品均质接种，在室温下一分钟无任何治疗之前。 2.分离过程主机准备的盲文化程序及抽样接种 五，使用vermiformis（株CDC19）作为共培养细胞的支持。 保持在28℃的阿米巴，在用30毫升的蛋白酶蛋白胨-酵母提取物-葡萄糖培养基的75cm 2的细胞培养烧瓶（PYG）。请检查PYG成分见表1。 注：48小时后，变形虫是由正常的使用次数计数的幻灯片（ 例如 ，Kovaslides）量化。 收获的细胞以在720×g离心10分钟的5×10 5〜10 6格/ ml，并将粒料变形虫的浓度通过离心。 通过抽吸除去上清液，并重新悬浮在30毫升无菌页的amoebal盐水（PAS） 表1的阿米巴沉淀。重复此漂洗过程。 以大约10 6变形虫/ ml的浓度重悬在30毫升饥饿培养基具有抗生素和抗真菌混合物变形虫。在饥饿培养基为变形虫生存介质，使其能够没有包囊或乘法活着。检查组合物在表1中。 注意：抗微生物剂混合物含有10微克/毫升万古霉素，10微克/毫升亚胺培南，20微克/毫升环丙沙星，20μ微克/毫升的强力霉素和20μg/ ml的伏立康唑。这种混合有助于减少细菌和真菌污染，可以减少或改变病毒的繁殖。 直接接种25微升各样品到200微升变形虫单层在96孔板平底利于变形虫粘附和在潮湿环境下在30℃孵育（潮湿环境由放置湿敷包含内袋的板以避免蒸发）。这是初次 – 文化。离开没有任何样品接种变形虫的两口井;这充当阴性对照。孵育此初次 – 培养三天。 三天后的第一个接种，亚文化，没有任何显微镜观察上述新鲜变形虫的初次 – 培养板。孵育相同的条件作为初次 – 培养下三天的新板。 孵化三天后进行最后的文化方式与日同Ëprimo-和亚文化。孵育的最后培养两天。然后进行检测。 裂解检测自动通过流式细胞术注：加上流动盲文化从术隔离以前的标准体系不同。它是更灵敏，准确和自动的。为了检测目的，我们应用开发以最高速度和无显微观察来检测裂解的新技术。这种技术是用于筛选的样品有利的，并且具有比旧的技术更好的灵敏度。7-9 使用最终共培养的96孔板来检测裂解。 打开仪和以根据制造商的协议，以获得较低的背景噪声运行一个清洁和漂洗循环。 启动高通量采样（HTS）与流动相结合仪自动加载从96孔板的样品和在40分钟内执行完全自动采集according至制造商的协议。 成立了HTS如下：样品体积150微升，混合容积50微升，搅拌速度180，混合5号，每个样本400微升的洗涤容量，流速2.5微升/秒，记录的事件10000号。 评估的最终共培养微板的阴性对照孔首先以栅极变形虫人口，并根据它们的物理特性，以确定这些细胞宿主的百分比。一定要有均匀的变形虫人口和相应的碎片和噪音更低事件的第二个群体。 注：此门程序由单细胞的大小，前向散射估计区分亚细胞碎片和团块。它准确地确定使用最佳选通过程的每个种群的百分比是重要的。这些百分比可以改变，尤其是在使用多种类型的原生动物，所以重要的是总是有一个是负面e控制，其可被用作样品的其余部分的参考群体。 开始通过点击获取样品门。 记录事件不大于10000的事件较少的数量。 本地化使用箭头感兴趣的变形虫人口。这是如何定义的大门。 门后，让现场HTS或通过单击“主页”定位板，然后自动运行整个板块。根据尺寸和结构参数执行数据采集和分析（分别为，FSC（前向散射）和SSC（侧向散射））。 注意：检测阿米巴 – 门控群体的损失信号负责阿米巴裂解致病剂的存在。与病毒感染相关的原生动物裂解与由分析器控和相比用作可靠阴性对照相同的非感染人群阿米巴人口的50％溶解的任意设计阈值检测。 <p类=“jove_title”> 3。裂解检测后的新分离的表征初步染色显示巨病毒的存在通过流式细胞仪检测溶解后，吸取裂解共培养暂停剩下的阿米巴。然后直接cytocentrifuge 50微升悬浮液在800×g离心10分钟。 离心后，修复用纯甲醇溶液中的幻灯片。使用曙红/蓝色海岸和DAPI染色的商业快速染色染色的幻灯片，以检查病毒工厂的存在在1,000X倍的光学显微镜下观察。 为快速染色，沉浸所述滑入第一曙红溶液（4秒重复三次），然后直接传递到沉浸滑入含有蓝色海岸为6秒第二定影溶液，最后用磷酸盐缓冲溶液冲洗45秒的幻灯片pH值7.2。离开幻灯片在室温下干燥，然后进行observati上。 对于DAPI染色，存款15微升的DAPI商业原液到固定干燥幻灯片。避光然后进行观察。 电子显微镜在幻灯片上的第一个经过鉴定，评估的巨型病毒，通过培养上清电子显微镜观察的存在。 存款5微升的阳性样品到辉光放电电网。等待在室温下大约20分钟。 仔细擦干电网并沉积在其1％钼酸铵为10秒的小降。离开网格干燥5分钟。 继续在200千电子伏电子显微镜。 放置在保持器的网格;引进的持有人到显微镜。通过点击相应的图标检查真空概述。关闭阀，开始观察在光点大小5，并且x 25,000放大倍数。 测量使用ImageJ或直接巨型病毒LY使用位于屏幕收购在显微镜测量工具显微镜。 注：分类的样品放入Faustovirus组具有大约200nm的衣壳大小。 分子生物学注意：在此之后的识别，分子生物学试验是为确认，以便从Marseillevirus，其具有下式电子显微镜对相同衣壳大小和外观区分Faustovirus至关重要的，虽然它们不具有相同的宿主特异性。该Marseillevirus不能Vermamoeba增长，Faustovirus是特定于Vermamoeba和所有尝试生长它在其他阿米巴如棘阿米巴未能日期。在设计和Reteno 等人的作品中列出的特定的引物/探针系统的应用。启用的新分离出的病毒更精确的初步分类，通过病毒基因的扩增和测序。 前根据制造商的方案使用自动提取系统从培养阳性样品道的DNA。 执行使用热循环仪的PCR作为Reteno 等人所述实时19 序列采用了用于扩增的相同的引物。使用的引物靶向DNA指导的RNA聚合酶亚基1基因：Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3'（正向）和Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3'（反向）与在Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA探针。 4.病毒生产，纯化和基因组测序继代培养的终点稀释克隆的单个病毒变形虫文化。 为生产：制备装有30ml PYG，10毫升Vermamoeba vermiformis和5ml从井中已经转移到小瓶中分离的病毒的20烧瓶中。 孵育在30℃，直到完全阿米巴溶解。倒置光学显微镜观察每一天，直到所有的阿米巴裂解。 完成裂解后，全部集中到瓶一个收件人。用0.45微米的过滤器过滤，以消除碎屑。 在89800 XG 75分钟开始通过超速离心提纯。确保在开始离心前校准管的重量。 离心后，通过抽吸除去从每个管的上清液，用用于校准相同体积重悬浮在PAS沉淀，重复离心前。 如上述，取出上清液并重新悬浮在1ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的所有颗粒。 纯化所产生，用25％的蔗糖（27.5在100ml PBS中的蔗糖，上过滤0.22微米过滤器）的病毒。 使用8毫升蔗糖和2ml病毒悬浮液。离心89800 XG为1小时15分钟。重新悬浮于1ml PBS中的沉淀。存储在-80℃。 </li>
Representative Results
在这个手稿研究该系统通过隔离两个新的验证Faustoviruses的概念证明。测试的70个样本中，有检测裂解的两集，而相比之下，我们的可靠阴性对照。用于裂解阴性对照含86％人口的阿米巴。相比之下，阳性标本（ST1为圣徒皮埃尔·德·Meyzoargues）和（LC9的拉西约塔样品9）显示门变形虫的大幅下降;变形虫的60％以上，用碎片的比例最高裂解。这些我们的方法的检测级的健壮的结?…
Discussion
该Faustovirus可能是一个新Megavirales家族接近非洲猪瘟病毒的第一个成员的可能性首先由Reteno。等，19建议，但有些差别仍可以区分。这似乎不清楚Faustovirus是否应该加入非洲猪瘟病毒科的家人或是否应该将形成一个新的公认的病毒家族。这个问题将需要进一步调查，特别是它的形态有更全面的描述，寄主范围，复制周期和基因剧目。更多Faustovirus基因型应以扩大泛基因组，并更好地理?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements to make.
Materials
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -. M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -. M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al. Evidence of the megavirome in humans. J Clin Virol. 57 (3), 191-200 (2013).
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3, 737-742 (2010).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
Cite This Article
Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (112), e54104, doi:10.3791/54104 (2016).