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方法文章

一种利用Vermamoeba vermiformis从环境样本中快速分离新型福斯托病毒的策略

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DOI：

10.3791/54104

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2016年6月4日

 ,  ,  , 
1Faculty of Medicine and Pharmacy, Research Unit for Infectious and Tropical Emerging Diseases, Aix Marseille University, 2Pole of Infectious and Tropical Diseases, Clinical and Biological Sector, Federation of Bacteriology-Hygiene Virology, University Hospital Institute Mediterranean Infection

本文内容

摘要

本文介绍了病毒分离技术的最新进展，用于表征福斯托病毒（Faustovirus）的新基因型，该病毒属于与非洲猪瘟病毒相关的一类新型巨大病毒谱系。本方案可应用于病毒的高通量分离，尤其适用于感染阿米巴原虫的巨大病毒。

摘要

巨型病毒的分离在病毒学的新时代具有重要意义，尤其是因为这些巨型病毒与原生生物相关。巨型病毒可能对多种原生生物具有潜在致病性。它们属于最近描述的巨病毒目（Megavirales）。从污水样本中分离出的新谱系法斯托病毒（Faustovirus）与哺乳动物病原体非洲猪瘟病毒具有较远的亲缘关系。该病毒也对其阿米巴宿主具有特异性。 Vermamoeba vermiformis一种在医疗用水系统中常见的原生生物。 继续分离新的福斯托病毒（Faustovirus）基因型对于扩大其基因型库并研究其泛基因组至关重要。我们开发了新的策略以分离更多毒株，通过优化抗生素和抗真菌剂的组合使用，避免阿米巴共培养过程中细菌和真菌的污染，同时促进病毒的增殖。此外，我们还建立了一种新的饥饿培养基以维持 V. vermiformis 在病毒共培养的最佳条件下进行实验。最后，我们采用流式细胞术而非耗时的显微镜观察来检测细胞病变效应。我们从污水样本中成功分离出两个毒株，证明了该方法的有效性，从而扩展了福斯托病毒（Faustoviruses）的收集范围，有助于更好地理解其生态环境、宿主特异性及基因组内容。

引言

巨大病毒的发现，尤其是属于巨病毒目（Megavirales）的病毒，在病毒颗粒大小和基因组复杂性方面彻底改变了病毒世界。此前，病毒被认为是一类微小的实体，而拟菌病毒（Mimivirus）似乎打破了所有这些规则1。宏基因组数据表明，巨大病毒不仅广泛存在于环境中2-5，也存在于人体内6。因此，仍有必要大规模地寻找这类病毒。这些巨大病毒的多样性评估不仅依赖于对全球多种水生环境及其相关沉积物的采样7-11，还包括对多种人体样本12,13和环境样本的筛查7,9。Acanthamoeba polyphaga 拟菌病毒是通过与吞噬性原生生物共培养分离得到的，主要使用的宿主为Acanthamoeba属原生生物14-16。随后，大量巨大病毒均从这一特定的原生生物宿主中被分离出来，导致科学界在研究和分离过程中局限于使用Acanthamoeba属物种。显然，对单一宿主物种的依赖导致了大量病毒被忽视。巨大病毒CroV是利用高度运动性的海洋原生动物Cafeteria roenbergensis成功分离的17,18，这一事实表明，有必要采用更广泛的原生动物宿主，以发现新的巨大病毒谱系或家族。Reteno et al. 成功筛选出此前从未被用作细胞宿主的其他原生动物，并从中分离出与非洲猪瘟病毒相关的新谱系巨大病毒（新命名为Faustovirus）19。

为了分离新的福斯托病毒（Faustovirus）基因型，从而扩增该病毒谱系的成员，我们改进了分离流程，并用其筛选能够获得新型福斯托病毒的环境样本。随后，我们详细描述了用于鉴定新分离株的完整实验方案。我们选用Vermamoeba vermiformis作为宿主，这是人类环境中最常见的自由生活的原生生物20-22，此前已被用于分离首个福斯托病毒原型株E1219。目前，该原生生物仍是福斯托病毒特异性的宿主。我们已知所有已知的巨型病毒均不致病于此种阿米巴，因为在本实验室中尝试培养其他巨型病毒时，均未观察到阿米巴裂解或病毒增殖现象。基于此，我们认为V. vermiformis是目前已知最适合且最独特的细胞培养体系，可用于分离新的福斯托病毒。

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方案

1. 样品采集

  1. 从不同环境和区域采集70份样品。本实验中使用以下样品：5份来自法国圣皮埃尔德梅佐阿尔格村（Saint Pierre de Meyzoargues）的污水样品，15份来自法国马赛博雷利公园（Parc Borély）湖泊的样品，15份来自法国马赛萨梅纳（Samena）岩石海湾含沉积物的海水样品，25份来自法国阿尔卑斯山区的河水样品，以及最后10份来自法国拉西约塔（La Ciotat）的污水样品。
  2. 接种前将样品在室温下涡旋振荡1分钟，以实现均质化，无需任何预处理。

2. 分离步骤

  1. 盲法培养操作的宿主准备及样本接种
    1. 使用 V. vermiformis （菌株 CDC19）作为共培养的细胞载体。
    2. 将阿米巴在28 °C、75 cm²培养瓶中培养2 含30 ml蛋白胨-多肽-酵母提取物-葡萄糖培养基（PYG）的细胞培养瓶。PYG的成分请见 表1.
      注意：48 小时后，使用计数板通过常规计数法对阿米巴进行定量例如，Kovaslides）
    3. 以 5 x 10 的浓度收集细胞5 至 106 细胞/ml，720 × g 离心 10 分钟沉淀阿米巴。
    4. 吸除上清液，将阿米巴虫沉淀物重悬于 30 ml 无菌 Page 阿米巴生理盐水（PAS）中 表1重复此洗涤步骤。
    5. 在30 ml含有抗生素和抗真菌剂混合物的饥饿培养基中重悬阿米巴，浓度约为106 阿米巴/毫升。饥饿培养基是一种维持阿米巴存活的培养基，可使其在不形成包囊或增殖的情况下保持生存。检查其成分。 表1.
      注意：抗菌剂混合物包含 10 µg/ml 万古霉素、10 µg/ml 亚胺培南、20 µg/ml 环丙沙星、20 µg/ml 多西环素和 20 µg/ml 伏立康唑。该混合物用于减少可能降低或改变病毒增殖的细菌和真菌污染。
    6. 直接将每份样本各25 µl接种至96孔板的扁平底部孔中，每个孔内含200 µl阿米巴单层培养物，以利于阿米巴贴壁，并在30 °C湿润环境中孵育（湿润环境指将浸湿的纱布置于盛放培养板的密封袋内，以防止蒸发）。此为初代培养。保留两孔阿米巴不接种任何样本，作为空白对照。将此初代培养物孵育三天。
    7. 首次接种三天后，无需显微镜观察，按上述方法将原代培养板转接至新鲜的阿米巴原虫中进行继代培养。将新培养板置于与原代培养相同的条件下孵育三天。
    8. 在为期三天的培养结束后，以与初代培养和传代培养相同的方法进行终末培养。将终末培养物继续培养两天，随后进行检测。
  2. 通过自动流式细胞术检测裂解
    注意：盲法培养结合流式细胞术与以往的标准分离方法不同，具有更高的灵敏度、精确性和自动化程度。在检测方面，我们采用了一种新开发的技术，可实现最快速度的裂解检测，且无需显微镜观察。该技术在样本筛查中具有优势，其灵敏度优于传统方法。7-9
    1. 使用最终共培养的96孔板检测裂解情况。
    2. 打开细胞仪，按照制造商方案运行清洗和冲洗循环，以获得较低的背景噪音。
    3. 启动高通量采样器（HTS）并结合流式细胞仪，根据制造商说明书，自动从96孔板中加载样品，并在40分钟内完成完全自动化的数据采集。
    4. 设置高通量筛选参数如下：样品体积 150 µl，混匀体积 50 µl，混匀速度 180，混匀次数 5，每次样品间清洗体积 400 µl，流速 2.5 µl/sec，记录事件数 10,000。
    5. 首先评估最终共培养微孔板的阴性对照孔，以圈定阿米巴虫群体，并根据其物理特性确定这些宿主细胞的百分比。确保阿米巴虫群体均一，同时存在另一个对应于碎片和噪声的较低事件数的群体。
      注意：该门控程序通过前向散射信号估计大小，以区分亚细胞碎片和细胞聚集体与单个细胞。因此，采用尽可能优化的门控方法准确确定各细胞群的百分比至关重要。这些百分比可能会有所变化，尤其是在使用多种原生动物的情况下，因此必须设置阴性对照，作为其余样品分析时的参考细胞群。
    6. 通过点击“获取样本”开始设门。
    7. 记录的事件数不少于 10,000 个。
    8. 使用箭头定位目标变形虫种群。此方法用于定义门控区域。
    9. 完成设门后，点击“Home”让HTS自动定位或查找孔板，然后自动运行整块板。根据大小和结构参数（分别为FSC（前向散射）和SSC（侧向散射））进行数据采集与分析。
      注意：检测到被门控的阿米巴种群信号减少，表明存在导致阿米巴裂解的病原体。与病毒感染相关的原生动物裂解通过设定任意的阈值来检测，即分析仪门控的阿米巴种群裂解率达到50%，并与用作可靠阴性对照的相同未感染种群进行比较。

3. 裂解检测后新分离株的表征

  1. 初步染色以检测巨大病毒的存在
    1. 流式细胞术检测裂解后，用移液器吹打裂解后的共培养物以重悬剩余的阿米巴。随后直接取50 µl悬液，以800 x g离心10分钟进行细胞离心涂片。
    2. 离心后，用纯甲醇溶液固定载玻片。使用市售的伊红/蓝阿紫快速染色试剂和DAPI染色，然后在1,000倍光学显微镜下观察，以检测病毒工厂的存在。
      1. 快速染色时，将玻片浸入第一种伊红溶液中（每次4秒，重复三次），随后直接将玻片浸入含蓝色亚甲蓝的第二种固定液中6秒，最后用pH 7.2的磷酸盐缓冲液冲洗45秒。室温下自然干燥玻片，然后进行观察。
      2. 对于DAPI染色，将15 µl DAPI商品化储备液滴加至固定的干燥载玻片上，避光保护，随后进行观察。
  2. 电子显微镜技术
    1. 在载玻片上首次鉴定后，通过透射电子显微镜观察培养上清液，评估巨大病毒的存在。
    2. 将5 µl阳性样品滴加到辉光放电的载网上，室温下静置约20分钟。
    3. 小心地将载网干燥，并在其上滴加一滴1%磷钼酸铵，作用10秒。将载网静置干燥5分钟。
    4. 在200 keV下进行透射电子显微镜观察。
    5. 将网格放置于样品台上，将样品台插入显微镜。点击相应图标检查真空概览。关闭阀门，在束斑尺寸为5、放大倍数为25,000倍的条件下开始观察。
    6. 使用 ImageJ 或直接在显微镜上利用采集界面中的显微镜测量工具测量巨型病毒。
      注意：将该样本归类为囊膜直径约200 nm的福斯托病毒属（Faustovirus）群。
  3. 分子生物学
    注意：在完成上述鉴定后，分子生物学检测对于确认结果至关重要，以区分法斯托病毒（Faustovirus）与马赛病毒（Marseillevirus），后者在透射电镜下具有相同的衣壳大小和形态，尽管二者的宿主特异性不同。马赛病毒无法在 Vermamoeba，Faustovirus 特异性针对 Vermamoeba 并在其他阿米巴（如）上培养它的所有尝试均 棘阿米巴 迄今为止尚未成功. Reteno 研究中列出的特异性引物/探针系统的设计与应用 等 通过扩增和测序病毒基因，实现了对新分离病毒更精确的初步分类。
    1. 使用自动化提取系统，按照制造商提供的方案从阳性培养样品中提取DNA。
    2. 使用热循环仪按照 Reteno 中所述方法进行实时 PCR 等19
    3. 使用与扩增时相同的引物进行测序。引物靶向DNA指导的RNA聚合酶亚基1基因：Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3'（正向）和Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3'（反向），并使用Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCTTCAACGACA-TAMRA探针。

4. 病毒的制备、纯化与基因组测序

  1. 对单病毒阿米巴培养物进行亚培养，用于终点稀释克隆。
  2. 用于生产：准备20个含有30 ml PYG培养基的培养瓶，每个加入10 ml Vermamoeba vermiformis 和5 ml已从孔板转移至小培养瓶的分离病毒。
  3. 在30 °C下孵育，直至阿米巴完全裂解。每天通过倒置光学显微镜观察，直至所有阿米巴均发生裂解。
  4. 完全裂解后，将所有培养瓶中的内容物汇集至一个容器中，使用0.45 µm滤膜过滤以去除碎片。
  5. 通过超速离心进行初步纯化，条件为89,800 × g离心75分钟。开始离心前务必校准各离心管重量。
  6. 离心后，通过抽吸去除每管上清液，并将沉淀物重新悬浮于与校准体积相同的PAS缓冲液中，随后重复离心步骤。
  7. 同上，去除上清液后，将所有沉淀物重新悬浮于1 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中。
  8. 使用25%蔗糖溶液（将27.5 g蔗糖溶于100 ml PBS中，经0.22 µm滤膜过滤）对产生的病毒进行纯化。
    1. 取8 ml蔗糖溶液与2 ml病毒悬液混合，于89,800 × g离心1小时15分钟。将沉淀物重新悬浮于1 ml PBS中，于-80 °C保存。

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结果

本研究中所采用的系统通过分离出两种新的法斯托病毒（Faustoviruses）验证了其概念可行性。在测试的70个样本中，检测到两次裂解事件，而我们的可靠阴性对照则未出现裂解。裂解的阴性对照样本中， amoeba 细胞比例保持在86%。相比之下，阳性样本（ST1，来自Saint Pierre de Meyzoargues）和（LC9，来自La Ciotat样本9）中门控的 amoeba 细胞数量显著下降，超过60%的 amoeba 细胞发生裂解，并伴随最高比例的细胞碎片。本方法检测阶段的这些有力结果如图1所示。伊红/蓝色美兰（Eosin/blue Azur）染色和DAPI染色证实了病毒工厂存在于 amoeba 细胞内，如图2所示。电子显微镜观察显示病毒具有典型的巨病毒目（Megavirales）形态特征：二十面体衣壳，直径约200 nm，无纤维结构（图3）。针对巨型病毒特别是法斯托病毒（Faustovirus）的特异性PCR检测进一步证实了我们先前的结果。必须通过PCR检测...

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讨论

Reteno 首次提出，Faustovirus 可能是与非洲猪瘟病毒（ASFV）亲缘关系较近的一个新 Megavirales 科的首个成员 等人，19 但仍然可以区分出一些差异。目前尚不明确法斯托病毒（Faustovirus）是否应归入非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae），还是应建立为一个新的假定病毒科。这一问题需要进一步研究，特别是对其形态学、宿主范围、复制周期以及基因组成进行更全面的表征。应分离更多法斯托病毒基因型，以扩展其泛基因组，并更深入地理解该病毒类群或科的起源及其亲缘关系。我们所采用的技术使我们能够持续分离这一潜在新病毒科的更多成员。该技术结合了稍加改良的共培养方法，作为富集步骤以提高检测效率。流式细胞术在获取数百个样本数据时所需时间不超过半小时，相较于以往的标准共培养系统，具有显著优势。9 该技术远优于先前的标准系统，尤其在灵敏度更高和定量更精确方面。

在启动的70个样本中，我们从污水中又分离出两种福斯托病毒（Faustoviruses），这可能为了解该病毒的环境特异性或生态系统提供信息。事实上，福斯...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

作者无任何致谢事项。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
LSR FORTESSA 流式细胞仪 BD Biosciences法国 649225B4
TECNAI G2 F20FEI德国 5027/11
倒置光学显微镜leica 法国72643
DNA 提取Qiagen EZ1 Advanced XL 提取机器人法国 L106A0452
PCR 循环仪 CFX96Bio rad法国785BR06298
PYG 培养基、PAS、饥饿培养基实验室自制 马赛 URMITEx
阿米巴菌株 CDC-19ATCC法国50237
培养板Cellstar法国655180
PCR 材料、引物 eurogentec法国引物见文稿中列出
带网格的 Glasstic 载玻片 10Kova 美国H899871441F
伊红/蓝色阿祖蓝-血染色剂（Eosin/blue Azur-Hemacolor 染色）Merck milipore 法国111955,6,57,109468
真空驱动滤器Thermo scientific法国BPV4550 / 20170115
磷酸盐缓冲液（PBS）Thermo Fisher scientific 法国 10010-023
DAPI 染色剂Life Technologies 法国 D1306
细胞离心涂片机 Cytospin 4Thermo Fisher scientific法国10522013JT184-31
单细胞学隧道Biomedical polymers inc.法国BMP-cyto-S50
碳支持膜铜网 Euromedex法国 FCF400NI
钼酸铵VWR internationanl 法国 21276185
培养瓶 SARSTEDT德国833911
0.22 μm 滤膜 Milex millipor 法国SE2M229104
超速离心机 Sorval WX 80Thermo scientific法国9102448
快速流动滤器Nalgene法国450-0020

参考文献

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