使用阳离子和阴离子脂质体将治疗性siRNA递送至中枢神经系统

摘要

本实验方案的目标是利用带有神经靶向肽的阳离子/阴离子脂质体作为中枢神经系统递送系统，使siRNA能够穿过血脑屏障。优化siRNA等治疗方法的递送系统，将为朊病毒病及其他神经退行性疾病提供更多治疗选择。

摘要

朊病毒病由正常的细胞型朊蛋白（PrP^C）错误折叠为一种异常的抗蛋白酶异构体PrP^Res所致。野生动物群体中朊病毒病的出现及其对人类健康的日益威胁，促使人们加大努力寻找治疗这些疾病的方法。近期研究已发现多种抗朊病毒化合物，这些化合物可抑制具有感染性的PrP^Res异构体，或下调正常细胞型朊蛋白的表达。然而，这些化合物中的大多数无法有效穿过血脑屏障以抑制脑组织中PrP^Res的形成，不能特异性靶向神经元中的PrP^C，并且通常对动物或人类受试者具有过高毒性。

我们研究了靶向神经元PrP^C并经血管内递送的siRNA是否是一种更安全、更有效的抗朊病毒化合物。本报告概述了一种制备两种siRNA脂质体递送载体的方法，并介绍了将PrP siRNA包装并递送至神经元细胞的流程。这两种脂质体递送载体分别为：1）使用阳离子脂质体的复合siRNA脂质体制剂（LSPCs），以及2）使用阳离子或阴离子脂质体的包封siRNA脂质体制剂（PALETS）。在LSPCs中，带负电荷的siRNA通过静电作用结合到阳离子脂质体上。随后向该复合物中加入带正电荷的肽段（RVG-9r［狂犬病毒糖蛋白］），使脂质体-siRNA-肽复合物（LSPCs）能够特异性地穿越血脑屏障（BBB），靶向中枢神经系统（CNS）中表达乙酰胆碱的神经元。对于PALETS（靶向肽修饰的脂质体包封治疗性siRNA），通过PrP siRNA对阳离子和阴离子脂质进行水化，从而使siRNA被包封于阳离子或阴离子脂质体内。同样，将RVG-9r神经肽结合至脂质体表面，以引导siRNA/脂质体复合物靶向中枢神经系统。利用这些制剂，我们已成功将PrP siRNA递送至表达AchR的神经元，并降低了中枢神经系统中神经元的PrP^C表达水平。

引言

朊病毒病是一类严重的神经退行性疾病，可影响中枢神经系统（CNS）。该类疾病由一种具有传染性的异构体PrP^Res诱导正常细胞型朊蛋白PrP^C发生错误折叠而引发。这类疾病可影响多种物种，包括牛的牛海绵状脑病、羊的痒病、鹿科动物的慢性消耗性疾病以及人类的克雅氏病^1-3。朊病毒引起的神经退行性病变最初表现为突触丢失，随后进展为空泡化、胶质细胞增生、神经元丢失及斑块沉积，最终导致动物或个体死亡⁴。数十年来，研究人员一直在探索能够延缓或阻止朊病毒病进展的化合物，但至今尚未发现有效的治疗方法或高效的系统性递送载体。

内源性PrP^C的表达是朊病毒病发生所必需的⁵。因此，降低或消除PrP^C的表达可能延缓或改善疾病进程。多个研究团队构建了PrP^C表达水平降低的转基因小鼠，或将表达shRNA的慢病毒载体直接注射到小鼠脑组织中，以研究PrP^C表达水平在朊病毒病中的作用。这些研究发现，减少神经元中PrP^C的含量可阻止朊病毒病的进行性神经病理变化，并延长动物的寿命^6-9。我们曾报道，PrP^C siRNA处理可导致小鼠神经母细胞瘤细胞中PrP^Res的清除¹⁰。这些研究表明，采用降低PrP^C表达水平的治疗方法，例如可切割mRNA的小干扰RNA（siRNA），可能足以延缓朊病毒病的进展。然而，目前针对朊病毒病研究的大多数疗法，其给药方式在临床实践中并不实用。因此，siRNA疗法需要一种可系统性给药、通过静脉注射并靶向中枢神经系统（CNS）的递送系统。

研究人员已对脂质体作为基因治疗产品的递送载体进行了研究。阳离子脂质和阴离子脂质均可用于脂质体的制备。其中，阳离子脂质的应用比阴离子脂质更为广泛，因为阳离子脂质与DNA/RNA之间的电荷差异有利于实现高效的包载。阳离子脂质的另一优势在于其穿越细胞膜的能力强于其他类型的脂质^11-14。然而，阳离子脂质的免疫原性高于阴离子脂质^13,14。因此，研究人员已开始从使用阳离子脂质转向使用阴离子脂质制备脂质体。通过使用带正电荷的鱼精蛋白硫酸盐多肽，可高效地将基因治疗产品包载入阴离子脂质体中，该多肽能够压缩DNA/RNA分子^15-19。由于阴离子脂质的免疫原性低于阳离子脂质，其在体内的循环时间可能更长，在动物模型中也可能具有更好的耐受性^13,14。通过将靶向性多肽连接到脂质体表面，可实现脂质体对特定组织的靶向递送。RVG-9r神经肽可结合烟碱型乙酰胆碱受体，已被用于将siRNA和脂质体靶向递送至中枢神经系统^17-20。

本报告概述了一种制备三种siRNA递送载体的方法，并介绍了将siRNA包装并递送至神经元细胞的流程（图1）。脂质体-siRNA-多肽复合物（LSPCs）由脂质体构成，其中siRNA和RVG-9r靶向多肽通过静电作用结合在脂质体的外表面。多肽靶向脂质体包裹治疗性siRNA（PALETS）则将siRNA和鱼精蛋白包裹于脂质体内，同时将RVG-9r通过共价键连接至脂质体的PEG化脂质基团上。采用以下方法制备LSPCs和PALETS，可在神经元细胞中使PrP^C siRNA将PrP^C的表达水平降低高达90%，在治疗或显著延缓朊病毒病病理发生方面具有巨大潜力。

方案

所有小鼠均在科罗拉多州立大学机构动物护理和使用委员会批准的方案下，由国际实验动物评估和认可委员会认证的实验动物资源实验室饲养和维持。

1. 肝干细胞前体细胞（LSPCs）的制备

1. 使用1:1的DOTAP（1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷）:胆固醇比例制备LSPC。对于4 nmol脂质体的制备，将2 nmol DOTAP和2 nmol胆固醇溶于10 ml氯仿:甲醇（1:1）溶液中，置于烧瓶内混合。
2. 使用 N 蒸发 9 ml 氯仿:甲醇溶液₂ 在通风橱中通入气体。在通风橱中过夜蒸发最后1 ml溶剂，不充入气体。观察烧瓶底部形成的薄层脂质膜。
3. 将10 ml 10%的蔗糖溶液加热至55 °C。
4. 将加热的10%蔗糖溶液缓慢倒入薄层脂膜上， 即 1 ml/min，同时轻轻摇动烧瓶。将10%蔗糖溶液和含脂质的烧瓶维持在55 °C，以确保脂质分子保持在凝胶-液体相。水合过程将形成多层囊泡（MLV）。
5. 在对脂质体进行粒径测定前，于55 °C下孵育至少1小时以使脂质充分水化。
6. 按照制造商的说明组装挤出器，并使用1.0 µm滤膜，或使用1.0 µm注射器滤器进行粒径控制。
7. 将1 ml加热的脂质体悬液加入挤出器的一个注射器中，使悬液在两个注射器之间来回通过11次。确保经过11次挤出后，悬液位于与起始注射器相对的另一个注射器中。
8. 再次将脂质体依次通过0.45 µm和0.2 µm滤膜，以制备大单层囊泡（LUVs）。保持脂质体悬浮液处于加热状态，以便更易进行粒径控制。
9. 将20 µl的4 nmole脂质体悬液（200 µM）与200 µl的20 µM（共4 nmole）siRNA储备液在室温下孵育10分钟。
10. 将80 µl的500 µM（总共40 nmole）RVG-9r储备液与siRNA/脂质体溶液在室温下孵育10分钟。LSPC应尽快使用，但也可在制备后数小时内使用。将LSPC在4 °C下保存数小时。 制备后

2. PALETS 的制备

1. 制备PALETS时，使用55:40:5的摩尔比，可选择DSPE（1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺）:胆固醇:DSPE-PEG或DOTAP:胆固醇:DSPE-PEG。对于4 nmol的脂质体制备，将2.2 nmol的DSPE或DOTAP、1.6 nmol的胆固醇和0.2 nmol的DSPE-PEG溶于10 ml体积比为2:1的氯仿:甲醇溶液中，混匀于烧瓶内。
2. 严格按照上述步骤1.1和1.2所述方法制备脂质体悬液。将DSPE脂质体用10 ml预热至75 °C的1× PBS重悬，添加速度为1 ml/min。在75 °C条件下充分水合至少1小时后再进行粒径均一化处理。
3. 严格按照步骤1.6–1.8所述方法对脂质体悬液进行粒径均一化处理。
4. 在DOTAP和DSPE脂质体完成粒径均一化后，取每种4 nmol（200 µM）脂质体悬液各20 µl，分装为单次使用 aliquot，使用台式冷冻干燥机冻干30分钟（图2）。
5. 将200 µl浓度为20 µM（总含量4 nmol）的siRNA储备液与1.4 µl浓度为26.6 µM的硫酸鱼精蛋白溶液在室温下孵育10分钟，用于后续封装至DSPE PALETS脂质体中的siRNA处理。 
6. 用200 µl浓度为4 nmol的siRNA储备液重悬DOTAP PALETS脂质体，或用201.4 µl siRNA/鱼精蛋白溶液重悬DSPE PALETS脂质体。将脂质体/siRNA混合液在室温下孵育10分钟。
7. 向DOTAP和DSPE PALETS的脂质体/siRNA混合液中各加入10 µl浓度为60 mM的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液。
8. 向DOTAP和DSPE PALETS的脂质体/siRNA混合液中各加入10 µl浓度为150 mM的N-羟基磺基琥珀酰亚胺（sulfo-NHS）溶液。
9. 将EDC和sulfo-NHS与siRNA/脂质体悬液在室温下共同孵育2小时。
10. 将80 µl浓度为500 µM（总含量40 nmol）的RVG-9r储备液加入siRNA/脂质体交联反应体系中，在室温下孵育10分钟。
    注意：EDC/sulfo-NHS可使RVG-9r共价结合至PEG化脂质上。PALETS应在制备后数小时内使用。制备后可于4 °C保存数小时。  
11. 测定PALETS中siRNA的包封率：
    1. 使用设定在260 nm波长的分光光度计，测量加入鱼精蛋白和脂质体前后siRNA的浓度。
    2. 使用50 kDa截留分子量的离心过滤装置，将未包封的siRNA从脂质体/包封siRNA悬液中滤除。在1,000 × g条件下离心20分钟。
    3. 使用分光光度计在260 nm波长下测定滤过液中未包封siRNA的浓度，以及截留液中包封siRNA的浓度。

3. 向小鼠注射LSPCs或PALETS

1. 将小鼠暴露于热灯下 5-10 分钟，以扩张血管系统。
2. 在注射前 5-10 分钟开始，使用 2-3% 异氟烷/氧气气流对小鼠进行麻醉，并在注射过程中持续维持麻醉。通过脚趾夹捏测试确认麻醉效果：当动物不再活动且呼吸减慢时，表明已进入麻醉状态。将小鼠仰卧或侧卧固定，以便接触尾静脉。在麻醉期间，使用兽用眼膏涂抹小鼠眼睛，防止角膜干燥。
3. 用 70% 乙醇擦拭或喷洒尾部，使用 26 G 胰岛素注射器将 300 µl 的 LSPCs 或 PALETS 注入小鼠尾静脉。从尾部远端开始注射，若静脉塌陷或破裂，则向近端移动继续注射。
4. 将小鼠置于清洁的笼子中，直至其能够维持胸卧位。在完全恢复之前，不得将其与同笼动物放在一起。 小鼠通常在 5 至 15 分钟内恢复。  若恢复时间较长，可将其置于加热垫上或热灯下以维持体温。  应密切监测小鼠，防止过热。
5. 注射后数小时内持续观察动物，确保麻醉作用完全消退，且治疗未引起不良反应。让 LSPCs 或 PALETS 在体内循环至少 24 小时。

4. 通过流式细胞术分析蛋白质表达

1. 以每分钟20%的CO₂流速处死小鼠，持续15分钟。
2. 使用剪刀剪开小鼠的皮肤和颅骨，取出半个脑半球。用镊子或剪刀末端将半个脑半球从颅骨上剥离下来。
3. 在培养皿中，用注射器推杆将每只小鼠的半个脑半球组织通过40 µm细胞筛网过滤，使用2.5 ml FACS缓冲液（1x PBS，1%胎牛血清，10 mM EDTA）进行压碎和冲洗。
4. 用额外的2.5 ml FACS缓冲液冲洗细胞筛网和培养皿。将获得的单细胞悬液转移至15 ml锥形管中，置于冰上保存。
5. 取5 ml单细胞悬液中的100 µl加入1.5 ml微量离心管中，以350 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml FACS缓冲液中。再次以350 × g离心5分钟。用另1 ml FACS缓冲液重复洗涤一次。将细胞悬液始终保持在冰上。
6. 将细胞与100 µl FACS缓冲液中的鼠源Fc阻断剂（0.5 mg/ml大鼠抗小鼠Fc阻断剂，按1:100稀释）在冰上孵育30–60分钟。参照步骤4.5的方法离心并洗涤细胞。将细胞悬液保持在冰上。
7. 将细胞与100 µl含7%小鼠血清的FACS缓冲液中的荧光标记抗体（抗小鼠PrP^C，20 µg/ml）在冰上孵育30–60分钟。参照步骤4.5的方法离心并洗涤细胞。将细胞悬液保持在冰上。
8. 离心后将细胞重悬于1 ml红细胞裂解缓冲液（1x PBS，155 mM NH₄Cl，12 mM NaHCO₃，0.1 mM EDTA）中，裂解1 分钟。参照步骤4.5进行离心，再将细胞重悬于1 ml FACS缓冲液中。将细胞悬液保持在冰上。
9. 使用流式细胞仪分析PrP^C表达水平，方法如前所述¹⁰。从总细胞群体中圈选活细胞，再从活细胞群体中圈选PrP^C阳性细胞，以测定MFI（中位荧光强度）。

结果

为了提高siRNA在阴离子PALETS中的包封效率，将siRNA与鱼精蛋白混合。为确定siRNA的最佳鱼精蛋白浓度，将siRNA与不同浓度的鱼精蛋白按1:1至2:1的比例混合（图3A）。在未使用鱼精蛋白的情况下，阴离子脂质体的siRNA包封效率为60-65%。当鱼精蛋白与siRNA的摩尔比在1:1至1.5:1（133-266 nM）范围内时，siRNA包封效率达到80-90%。摩尔比高于1.5:1时，会导致siRNA/鱼精蛋白复合物发生沉淀。这些沉淀的复合物无法被包封进阴离子脂质体中。在将鱼精蛋白加入siRNA后，siRNA浓度因稀释作用而略有下降；然而，在加入鱼精蛋白后浓度保持稳定（图3B）。经50 kDa滤膜过滤后，90-95%的siRNA存在于脂质体截留物中，而5-10%的siRNA以“游离”形式存在于滤过液中。在仅含鱼精蛋白或仅含脂质体的样品中未检测到siRNA（图3C）。

讨论

本报告描述了一种构建两种靶向递送系统的方法，可高效地将siRNA递送至中枢神经系统（CNS）。既往将siRNA递送至CNS的方法包括：直接向脑内注射siRNA/shRNA载体、静脉注射靶向siRNA，或静脉注射非靶向脂质体-siRNA复合物。向CNS内注射siRNA/shRNA载体虽可降低靶蛋白的表达水平，但siRNA/shRNA在CNS中无法自由扩散。此外，此类注射会造成邻近神经组织的损伤^6-9。静脉注射靶向siRNA也可降低靶蛋白水平，但大部分siRNA会被血清蛋白降解²⁰。最后，静脉注射非靶向脂质体-siRNA复合物会导致siRNA被肝脏截留，并被单核吞噬细胞系统降解²¹。上述siRNA递送载体LSPCs和PALETS通过直接将siRNA递送至CNS，提供了一种比既往方法更安全、更有效且高效的递送系统。LSPCs和PALETS还能够将其他小分子药物递送至CNS。

PALETS 或 LSPCs 应在组装后数小时内使用，否则 siRNA 可能会失活或降解。另一个不能停止或中断的关键步骤是用于流式细胞术的细胞悬液的制...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DOTAP 脂质	Avanti Lipids	890890
胆固醇	Avanti Lipids	700000
DSPE	Avanti Lipids	850715
DSPE-PEG	Avanti Lipids	880125
氯仿	Fisher Scientific	AC268320010
甲醇	EMD Millipore	113351
N2 气体	AirGas
蔗糖	Fisher Scientific	S5-500
挤出器	Avanti Lipids	610023
1.0、0.4 和 0.2 μm 滤膜	Avanti Lipids	610010, 610007, 610006
PBS	Life Technologies	70011-044
硫酸鱼精蛋白	Fisher Scientific	ICN10275205
EDC	Thermo Scientific	22980	分装为单次使用剂量
Sulfo-NHS	Thermo Scientific	24510	分装为单次使用剂量
40 μm 细胞筛	Fisher Scientific	08-771-1
大鼠抗小鼠 CD16/CD32 Fc 封闭抗体	BD Pharmigen	553141
抗 PrP 抗体 (PRC5)	proprietary - PRC