抗体共价结合至纤维素纸片及其在肉眼可见比色免疫测定中的应用

摘要

本文介绍了在纸质圆片上共价固定抗体的高碘酸盐氧化法和戊二醛交联法。评估了固定化抗体的结合活性。根据这些结果，采用戊二醛交联法开发了一种用于检测免疫球蛋白G（IgG）的新型纸质免疫分析方法。

摘要

本报告介绍了两种将捕获抗体共价固定在1号纤维素滤纸（中速流动滤纸）圆片和113号纤维素滤纸（快速流动滤纸）圆片上的方法。在抗体固定之前，这些纤维素纸片通过硅烷偶联技术接枝了氨基官能团。采用高碘酸盐氧化法和戊二醛交联法将捕获抗体接枝到纤维素纸片表面。为了确保抗体固定后对其靶标的结合能力达到最大，研究了不同浓度的高碘酸钠、戊二醛以及捕获抗体对纸片表面固定效果的影响。通过戊二醛交联剂将抗体包被在氨基功能化纤维素纸片上后，其对靶标的结合活性优于高碘酸盐氧化法。本研究以小鼠参考血清中的IgG作为参考靶标，用于验证通过戊二醛共价固定抗体的应用效果。成功开发并验证了一种新型基于纸张的酶联免疫吸附测定（ELISA）方法用于检测IgG。该方法无需仪器设备，可检测低至100 ng/ml的IgG。快速流动滤纸比中速流动滤纸更灵敏。该检测方法孵育时间短，所需样本体积小。这种肉眼可视的比色免疫测定法可进一步拓展用于检测传统ELISA可识别的其他靶标。

引言

即时检测（POCT）诊断研究对于开发新的治疗策略、个性化医疗和家庭护理具有重要意义¹纤维素纸被广泛用作免疫测定的平台，因其成本低廉、易于获取且用户熟悉。²此外，纤维素纸的多孔结构具有在无需额外能量输入的情况下驱动液体流动的能力。基于纸张的生物分析记录最早可追溯至20世纪^th 世纪，纸色谱法于1952年首次被发明。最常见的例子是免疫层析试验³，例如妊娠和血糖试纸条。这些检测方法具有相对较短的检测时间和低廉的分析成本⁴由于其操作简便，这些传统的试纸条检测方法已广泛应用于即时检验（POCT）诊断中⁵.

已有报道采用比色法⁶、电化学法⁷和电化学发光法⁸等检测方法来测定生物样本中的目标物。除了这些定量方法外，将抗体稳定固定在纤维素纸上的可靠方法对于诊断装置的开发也至关重要。非特异性吸附是将抗体修饰到纸质装置表面的主要策略^{9, 10}，以确保抗体固定后对其靶标具有最大结合能力。然而，先前一项研究 表明，吸附在纤维素纸上的抗体可能从纤维上解吸，解吸率高达40%¹¹ 。因此，将抗体直接吸附在纤维素上可能无法提供可重复的实验结果¹²。将抗体通过共价键接枝到纸张表面进行共价固定，是开发高效纸质生物检测方法的另一种替代....

方案

1. 在纤维素纸片上接枝胺基官能团

1. 准备一张尺寸为1 cm × 1 cm的正方形纸片，以及100个用1号纤维素纸（中流速滤纸）通过打孔器制备的直径为6.0 mm的圆形纸片。
2. 为了获得 -NH₂ 在纸片上形成基团：在通风橱内，将1 ml APS与10 ml丙酮加入50 ml玻璃瓶中混合。将纸片加入新配制的APS试剂混合液中，于室温下以200 rpm转速振荡孵育5小时³².
   注意：请在通风橱中操作 APS 和丙酮。
3. 将50 ml玻璃瓶中的过量溶液倾倒至有机废液容器中。
4. 向玻璃瓶中加入 10 ml 丙酮，充分混匀，然后完全倾倒，以去除未反应的 APS 及其他杂质。重复此步骤两次。
5. 将纸片平铺在纸巾上，并置于 110 °C 在烘箱中加热3小时。让纸片冷却。将纸片置于50 ml离心管中，室温保存。
6. 采用傅里叶变换红外光谱法（FTIR）检测胺基在纤维素方形纸上的接枝情况，具体步骤如下（图3A).
   1. 打开计算机并启动傅里叶变换红外光谱仪。
   2. 打开傅里叶变换红外光谱（FTIR）软件。
   3. 转到“测量 → 初始化”。初始化完成后，“BS: KBr”、“Lamp: Infrared”和“Laser”的矩形框将变为绿色。
   4. 在矩形下方选择“数据”，并为“测量模式”、....

结果

图 3. 未处理及 APS 处理的中速流速滤纸（A）和快速流速滤纸（B）的傅里叶变换红外光谱（FTIR）。A. 未处理中速流速滤纸的光谱与经 APS 处理的中速流速滤纸相似。在 902–1,170 cm^-1 和 1,210–1,500 cm^-1 波段，APS 处理滤纸的强度增强，分别归属于 Si-O-纤维素键以及 SiOC-H 基团的 C-H 变形振动。在 1,650 cm^-1 和 2,885 cm^-1 处波段的增强分别归属于硅烷丙基部分的 -NH₂ 弯曲振动和 CH₂ 振动。 .......

讨论

通过将纯化的山羊抗小鼠IgG-Fc捕获抗体直接包被于未经修饰的纤维素纸片上，用于检测IgG浓度。结果表明，为确保实验的可重复性，需对捕获抗体进行进一步固定。硅烷化技术成功地在纤维素纸片上引入了氨基功能团³⁴。APS的浓度影响抗体的固定效果，因此也对丙酮中APS的用量进行了优化。在10 ml丙酮中加入1 ml APS为最佳浓度，可有效接枝氨基，进而通过戊二醛交联剂实现抗体的固定。抗体通过高碘酸盐氧化法和戊二醛交联法两种方式被接枝到纤维素纸片上。研究结果表明，对于中流速和快速流速的滤纸片，戊二醛交联法固定的抗体结合能力优于高碘酸盐氧化法。此外，通过戊二醛交联法固定在纤维素纸片上的捕获抗体保持了其功能活性，并且即使纸片经受了15次涡旋洗涤所产生的机械应力，抗体仍能稳定地固定在纸片上。实验发现，10%脱脂奶粉封闭缓冲液在经历15次洗涤后仍能保持其封闭效率（图S5）。

共价固定的抗体被用于进行针对IgG检测的夹心ELISA。使用基于纸片的检测方法，肉眼即可检测到浓度为100 ng/ml的IgG。当每一步均孵育一小时时，IgG血清浓度在0.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纤维素滤纸，1号规格（中速流动滤纸）	GE Healthcare Pte Ltd Singapore	1001 110
纤维素滤纸，113号规格（快速流动滤纸）	Sigma-Aldrich, Singapore	1113-320
戊二醛	Sigma-Aldrich, Singapore	G6257	Ⅱ级，25% 水溶液 H2O
表面活性剂	Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore	P2287
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich, Singapore	A2153
脱脂奶粉	Louis François		由 Kitchen Capers, Singapore 分装
Tris 碱	Promega	H5135
高碘酸钠	Merck	106597
Na2HPO4	Merck	106585
KH2PO4	Merck	104873
NaCl	CALBIOCHEM	567441
NaOH	Merck	106462
HCl	Merck	100317
磷酸盐缓冲液（PBS）	N/A	N/A	PBS 含有 137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、8.0 mmol⁠/⁠L Na2HPO4 和 1.5 mmol/L KH2PO4，使用水配制，并用 0.1 mol/L NaOH 或 0.1 mol/L HCl 调节至 pH 7.4
丙酮	Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore	9005-68
TMB 与过氧化氢溶液混合物	1-Step ultra TMB-ELISA 溶液，Thermo Scientific Pierce	34029	1 L
兔抗人 IgG-FITC	TWC/Bio Pte Ltd Singapore	sc-2278
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG	TWC/Bio Pte Ltd Singapore	sc-2030
亲和纯化的山羊抗小鼠 IgG-Fc 包被抗体	Bethyl Laboratories, Inc	A90-131A
小鼠参考血清	Bethyl Laboratories, Inc	RS10-101-5	9.5 mg/ml
HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG-Fc 检测抗体	Bethyl Laboratories, Inc	A90-131P
仪器
傅里叶变换红外光谱仪	Shimadzu IR Prestige-21	N/A
荧光分子成像仪	Pharos FXTM plus 分子成像仪，Bio-Rad, Singapore	N/A
烘箱	NUVE FN500	N/A
Turbo 混匀仪 VM-2000	MYC LTD	N/A
ImageJ	RGB，免费下载	N/A