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方法文章

抗体共价结合至纤维素纸片及其在肉眼可见比色免疫测定中的应用

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⸱

DOI：

10.3791/54111

⸱

2016年10月21日

 ,  ,  , 
1School of Applied Science, Temasek Polytechnic, 2University of Applied Sciences Utrecht

本文内容

摘要

本文介绍了在纸质圆片上共价固定抗体的高碘酸盐氧化法和戊二醛交联法。评估了固定化抗体的结合活性。根据这些结果，采用戊二醛交联法开发了一种用于检测免疫球蛋白G（IgG）的新型纸质免疫分析方法。

摘要

本报告介绍了两种将捕获抗体共价固定在1号纤维素滤纸（中速流动滤纸）圆片和113号纤维素滤纸（快速流动滤纸）圆片上的方法。在抗体固定之前，这些纤维素纸片通过硅烷偶联技术接枝了氨基官能团。采用高碘酸盐氧化法和戊二醛交联法将捕获抗体接枝到纤维素纸片表面。为了确保抗体固定后对其靶标的结合能力达到最大，研究了不同浓度的高碘酸钠、戊二醛以及捕获抗体对纸片表面固定效果的影响。通过戊二醛交联剂将抗体包被在氨基功能化纤维素纸片上后，其对靶标的结合活性优于高碘酸盐氧化法。本研究以小鼠参考血清中的IgG作为参考靶标，用于验证通过戊二醛共价固定抗体的应用效果。成功开发并验证了一种新型基于纸张的酶联免疫吸附测定（ELISA）方法用于检测IgG。该方法无需仪器设备，可检测低至100 ng/ml的IgG。快速流动滤纸比中速流动滤纸更灵敏。该检测方法孵育时间短，所需样本体积小。这种肉眼可视的比色免疫测定法可进一步拓展用于检测传统ELISA可识别的其他靶标。

引言

即时检测（POCT）诊断研究对于开发新的治疗策略、个性化医疗和家庭护理具有重要意义1纤维素纸被广泛用作免疫测定的平台，因其成本低廉、易于获取且用户熟悉。2此外，纤维素纸的多孔结构具有在无需额外能量输入的情况下驱动液体流动的能力。基于纸张的生物分析记录最早可追溯至20世纪th 世纪，纸色谱法于1952年首次被发明。最常见的例子是免疫层析试验3，例如妊娠和血糖试纸条。这些检测方法具有相对较短的检测时间和低廉的分析成本4由于其操作简便，这些传统的试纸条检测方法已广泛应用于即时检验（POCT）诊断中5.

已有报道采用比色法6、电化学法7和电化学发光法8等检测方法来测定生物样本中的目标物。除了这些定量方法外，将抗体稳定固定在纤维素纸上的可靠方法对于诊断装置的开发也至关重要。非特异性吸附是将抗体修饰到纸质装置表面的主要策略9, 10，以确保抗体固定后对其靶标具有最大结合能力。然而，先前一项研究 表明，吸附在纤维素纸上的抗体可能从纤维上解吸，解吸率高达40%11 。因此，将抗体直接吸附在纤维素上可能无法提供可重复的实验结果12。将抗体通过共价键接枝到纸张表面进行共价固定，是开发高效纸质生物检测方法的另一种替代策略13。已有多种方法被报道用于纤维素的修饰14, 15。理想情况下，抗体在固定后应保持其原有的功能活性12。已有研究使用碳酰二咪唑联合四氟硼酸-1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓16；通过基于紫外活化的1-氟-2-硝基-4-叠氮苯17, 18；基于木葡聚糖修饰的化学酶法策略19；1,4-亚苯基二异硫氰酸酯交联剂20；杂多糖氧化21、点击化学22；以及阳离子卟啉23等方法，实现生物分子在纤维素纸上的共价固定。壳聚糖修饰的纸张因其来源丰富且具有良好的生物相容性27，已被用于开发基于纸张的免疫检测装置24-26。壳聚糖带正电荷，可牢固地吸附于带负电荷的纤维素表面27。捕获抗体通过壳聚糖涂层与戊二醛交联的方式固定在纸张上。高碘酸盐氧化是另一种将捕获抗体接枝到纤维素纸上的方法28。该方法通过在纸上点加高碘酸钠，将纤维素中的1,2-二羟基（邻二醇）基团直接转化为醛基。随后利用这些醛基在多糖与抗体之间形成共价键28。尽管该制备方法简单，但高碘酸钠难以彻底清洗干净。残留的高碘酸钠可能导致已固定在纤维素纸上的抗体发生进一步氧化，从而影响抗体的活性与稳定性。N-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺交联剂也已被用于将抗体共价固定在电纺聚-L-乳酸和醋酸纤维素纳米纤维上，以开发基于纳米纤维的检测方法29。

本研究采用硅烷偶联技术将氨基官能团接枝到纤维素纸片上。该技术有助于保持纤维素滤纸原有的孔径、毛细渗透性和过滤速率，从而在免疫分析中实现最大的垂直流过效果。硅烷偶联技术已广泛应用于生物传感器中，用于在基底表面引入仲胺基团，随后进一步通过生物分子进行修饰。基质表面氨基的接枝过程包括有机功能硅烷试剂的-OH基团与基质基底之间的缩合反应30。本研究通过3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APS）31，利用硅烷偶联法对纤维素纸片进行氨基官能化。随后采用两种不同方法共价固定捕获抗体。第一种方法是将高碘酸盐氧化后的捕获抗体与氨基官能化的纤维素纸片结合；第二种方法则使用戊二醛作为交联剂，将捕获抗体连接至含氨基官能团的纤维素纸片上。通过兔抗人IgG-异硫氰酸荧光素（FITC）标记物并结合荧光分子成像仪检测，确认了捕获抗体的存在。同时，利用过氧化物酶底物评估了兔抗人IgG-FITC与羊抗兔IgG之间的结合活性。研究还考察了不同浓度的高碘酸钠、戊二醛以及捕获抗体的影响。最终，通过检测IgG血清成功完成了固定化捕获抗体的应用测试。

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方案

1. 在纤维素纸片上接枝胺基官能团

  1. 准备一张尺寸为1 cm × 1 cm的正方形纸片，以及100个用1号纤维素纸（中流速滤纸）通过打孔器制备的直径为6.0 mm的圆形纸片。
  2. 为了获得 -NH2 在纸片上形成基团：在通风橱内，将1 ml APS与10 ml丙酮加入50 ml玻璃瓶中混合。将纸片加入新配制的APS试剂混合液中，于室温下以200 rpm转速振荡孵育5小时32.
    注意：请在通风橱中操作 APS 和丙酮。
  3. 将50 ml玻璃瓶中的过量溶液倾倒至有机废液容器中。
  4. 向玻璃瓶中加入 10 ml 丙酮，充分混匀，然后完全倾倒，以去除未反应的 APS 及其他杂质。重复此步骤两次。
  5. 将纸片平铺在纸巾上，并置于 110 °C 在烘箱中加热3小时。让纸片冷却。将纸片置于50 ml离心管中，室温保存。
  6. 采用傅里叶变换红外光谱法（FTIR）检测胺基在纤维素方形纸上的接枝情况，具体步骤如下（图3A).
    1. 打开计算机并启动傅里叶变换红外光谱仪。
    2. 打开傅里叶变换红外光谱（FTIR）软件。
    3. 转到“测量 → 初始化”。初始化完成后，“BS: KBr”、“Lamp: Infrared”和“Laser”的矩形框将变为绿色。
    4. 在矩形下方选择“数据”，并为“测量模式”、“切趾函数”、“扫描次数”、“分辨率”和“范围（cm-1）”分别选择“%透射率”、“Happ-Genzel”、“45”、“4.0”和“最小值：400，最大值：4000”。
    5. 点击“测量”。
    6. 选择“数据文件”作为背景数据。记录下备注信息。
    7. 单击“BKG”以获取背景的基线。
    8. 将方形纸片固定在薄膜样品台上。
    9. 选择样本数据的“数据文件”。记录下备注信息。
    10. 单击“样品”以获取样品的光谱。
    11. 关闭傅里叶变换红外光谱仪软件并关闭计算机。
  7. 重复上述步骤（步骤1.1至1.6），制备氨基功能化的113号等级纤维素方形纸和圆片（快速流动滤纸），并获取113号等级方形纸的FTIR光谱图3B).

2. 在氨基功能化纤维素纸片上共价固定抗体

抗体固定化示意图；NaIO4，APS 程序；化学关键词：醛基，硅烷。
图 1. 通过两种不同方法共价固定抗体。 A. 通过高碘酸盐氧化将抗体固定在胺基功能化的纤维素纸片上。碳水化合物残基被高碘酸钠氧化生成醛基官能团。随后，将氧化后的抗体加载到胺基功能化的纤维素纸片上。 B. 抗体通过戊二醛固定在胺基功能化的纤维素纸片上。将胺基功能化的纤维素纸片浸入 0.05% 戊二醛溶液中，以在纸片上引入醛基。洗涤后，将抗体加载到醛基功能化的纸片上。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 通过高碘酸钠氧化法将抗体固定在氨基功能化的纤维素纸片上（图 1A）。
    1. 在 1.5 ml 离心管中，将 1 µl 的 2.5 mM 高碘酸钠与 2 µl 的 0.1 mg/ml 兔抗人 IgG-FITC 及 7 µl 的 100 mM pH 5.5 醋酸盐缓冲液混合，并在避光条件下孵育 30 分钟。
      注意：如有需要，可按照此体积比例制备更多氧化抗体。可通过调整高碘酸钠和兔抗人 IgG-FITC 的体积比例来优化其浓度。
    2. 用 30 µl 的 50 mM 磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4）稀释上述抗体溶液，最终体积为 40 µl。
    3. 准备三个氨基功能化的中流速滤纸片和三个氨基功能化的快速滤纸片（如第 1 节所述）。
      1. 将 5 µl 高碘酸钠氧化的兔抗人 IgG-FITC 加载至每个中流速滤纸片上，将 8 µl 加载至每个快速滤纸片上。将这些纸片在室温下避光放置 1 小时。
    4. 用 0.2 ml 洗涤缓冲液（50 mM Tris 缓冲液含 0.15 M NaCl 和 0.05% 表面活性剂，pH 7.4）洗涤每个纸片。重复洗涤三次。
    5. 通过荧光分子成像仪拍摄荧光图像，以确认各纤维素纸片上是否存在抗体32。使用空白纸片（在无高碘酸钠条件下以相同浓度抗体处理）作为对照（图 S1 至 图 S3）。
      注意：为进行实验优化，应改变一个待优化参数的浓度，同时固定其他所有参数的浓度。较高的荧光强度可增加固定在纤维素纸片上的捕获抗体的量。
  2. 通过戊二醛法将抗体固定在氨基功能化的纤维素纸片上（图 1B）。
    1. 将第 1 节中所述的三个经 APS 处理的中流速滤纸片和三个快速滤纸片加入含有 0.05% 戊二醛的 2 ml 50 mM PBS（pH 7.4）中，室温下以旋转振荡方式处理 1 小时。
      注意：戊二醛应在通风橱中操作。
    2. 将三个纸片分别放入两个 1.5 ml 离心管中。每管加入 1 ml 去离子水（DI 水），振荡 10 秒。用移液器吸除水相。重复此步骤两次，以去除未反应的戊二醛。
    3. 向每个醛基功能化的中流速滤纸片上加载 5 µl 的 25 µg/ml 兔抗人 IgG-FITC（捕获抗体），向每个醛基功能化的快速滤纸片上加载 8 µl。室温下避光孵育约 20 分钟。随后，在不移除抗体的情况下，向每个纸片加入 10 µl 的 50 mM PBS（pH 7.4），继续孵育 40 分钟以完成胺醛反应。
    4. 将纸片置于纸巾上，用 0.2 ml 洗涤缓冲液洗涤。重复洗涤两次。
    5. 通过荧光分子成像仪拍摄荧光图像，以检测各纤维素纸片上抗体的存在情况33。使用空白纸片作为对照。
      注意：在 图 4 中，“0”代表未使用戊二醛处理但以相同浓度 FITC-抗体处理的空白纸片；在 图 5A 中，空白纸片经戊二醛处理，但未加载 FITC-抗体。
  3. 将第 2.1 和 2.2 节所得纸片在 37 °C 下干燥 10 分钟。
  4. 用 15 µl 封闭缓冲液（含 10% 脱脂奶粉的 50 mM Tris 缓冲液，pH 7.4，含 0.15 M NaCl）在室温下封闭纸片 10 分钟。
  5. 分别向中流速和快速滤纸片上加载 5 µl 和 8 µl 的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG PBS 溶液（1:10,000 稀释）。室温下避光孵育 30 分钟。
  6. 将纸片置于纸巾上，用 0.2 ml 洗涤缓冲液洗涤。重复洗涤三次。
    注意：无需完全去除洗涤缓冲液，因其对结果无影响。
  7. 向每个纸片上加载 10 µl 的 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）与过氧化氢溶液的混合液。
  8. 孵育 5 分钟后，使用数码相机或智能手机拍摄纸片图像。
    注意：在 图 5B 中，“0”代表经戊二醛处理后加载抗体-HRP（辣根过氧化物酶）偶联物但未加载 FITC-抗体的纸片。

3. 基于纸张的ELISA法检测IgG

ELISA 方法示意图，显示抗体、封闭、抗原结合、HRP 信号、TMB 氧化。
图2. 基于纸张的IgG检测ELISA方法示意图。 捕获抗体通过戊二醛共价固定在醛基功能化的纤维素纸片上。纤维素纸片用封闭缓冲液进行封闭。然后将目标IgG加入纸片，接着加入HRP标记的信号抗体。最后，将TMB和过氧化氢混合溶液加至每张纸片以产生显色信号。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 向一个 20 ml 玻璃瓶中加入 5 ml 0.05% 戊二醛溶液（用 50 mM PBS 缓冲液配制，pH 7.4）。将 15 个氨基功能化的中流速滤纸圆片浸入该溶液中，室温下振荡孵育 1 小时。
    1. 同时，重复步骤 3.1，制备另外 15 个醛基功能化的快速滤纸圆片。
      注意：应在通风橱中操作戊二醛。
  2. 为去除滤纸圆片上未反应的戊二醛，将 15 个中流速滤纸圆片放入一个 15 ml 离心管中，另将 15 个快速滤纸圆片放入另一个 15 ml 离心管中。每管加入 5 ml 去离子水，振荡 10 秒。用移液器吸除水相。重复洗涤两次，以彻底去除未反应的戊二醛。
  3. 将滤纸圆片置于 37 °C 烘箱中干燥。
  4. 分别向每个中流速和快速滤纸圆片上加入 5 µl 和 8 µl 的 0.025 mg/ml 小鼠 IgG-Fc 片段抗体，孵育 20 分钟。
  5. 在不移除抗体的情况下，向每张滤纸圆片上加入 10 µl 50 mM PBS（pH 7.4），孵育 40 分钟，以完成氨基与醛基的反应。
  6. 将滤纸圆片置于纸巾上，用 0.2 ml 洗涤缓冲液洗涤。重复洗涤三次。
  7. 将滤纸圆片在 37 °C 烘箱中干燥。
  8. 用 15 µl 封闭缓冲液在室温下封闭滤纸圆片 10 分钟。
  9. 将每张滤纸圆片置于纸巾上，用 0.2 ml 洗涤缓冲液洗涤。重复洗涤三次。
  10. 运行 IgG 标准品。
    1. 将不同浓度的 IgG 溶液（例如，0、10、125、250 和 500 ng/ml，溶于 PBS 中）各取 10 µl，每种浓度设三个重复，分别加样至各圆片上。室温孵育 1 小时。
  11. 将滤纸圆片置于纸巾上，用 0.2 ml 洗涤缓冲液洗涤。重复洗涤三次。
  12. 向每张滤纸圆片上加样 10 µl 辣根过氧化物酶（HRP）标记的小鼠 IgG-Fc 片段抗体（1:10,000 稀释，溶于 10 mM PBS，pH 7.4），室温孵育 1 小时。
  13. 将滤纸圆片置于纸巾上，用 0.2 ml 洗涤缓冲液洗涤。重复洗涤三次。
    注意：无需完全去除洗涤缓冲液，因为缓冲液的存在不影响检测结果。
  14. 向每张圆片上加样 10 µl TMB 与过氧化氢的混合液。
  15. 孵育 5 分钟后，使用数码相机或智能手机拍摄所有滤纸圆片的图像。
    注意：在 图 6A 中，“0”代表仅进行了捕获抗体固定化处理，并加入了抗体-HRP/TMB 溶液但未加 IgG 血清的滤纸圆片。
  16. 使用 Image J 软件分析图像中每张滤纸圆片的信号强度。
    1. 将步骤 3.15 中拍摄的图像转换为 '.tif' 格式。
    2. 打开 'Image J' 软件。
    3. 点击 'File → Open'，选择待分析的图像。
    4. 选择形状工具中的 'Oval'（椭圆）。
    5. 点击 'Image → Type → 32 bit'。
    6. 点击 'Edit → Invert'（反相）。
    7. 点击 'Analyze → Measure'（分析→测量）。
    8. 将测得的数据复制至电子表格中进行分析。

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结果

显示吸收率与波数关系的纤维素纸张类型的红外光谱图
图 3. 未处理及 APS 处理的中速流速滤纸（A）和快速流速滤纸（B）的傅里叶变换红外光谱（FTIR）。A. 未处理中速流速滤纸的光谱与经 APS 处理的中速流速滤纸相似。在 902–1,170 cm-1 和 1,210–1,500 cm-1 波段，APS 处理滤纸的强度增强，分别归属于 Si-O-纤维素键以及 SiOC-H 基团的 C-H 变形振动。在 1,650 cm-1 和 2,885 cm-1 处波段的增强分别归属于硅烷丙基部分的 -NH2 弯曲振动和 CH2 振动。 ...

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讨论

通过将纯化的山羊抗小鼠IgG-Fc捕获抗体直接包被于未经修饰的纤维素纸片上，用于检测IgG浓度。结果表明，为确保实验的可重复性，需对捕获抗体进行进一步固定。硅烷化技术成功地在纤维素纸片上引入了氨基功能团34。APS的浓度影响抗体的固定效果，因此也对丙酮中APS的用量进行了优化。在10 ml丙酮中加入1 ml APS为最佳浓度，可有效接枝氨基，进而通过戊二醛交联剂实现抗体的固定。抗体通过高碘酸盐氧化法和戊二醛交联法两种方式被接枝到纤维素纸片上。研究结果表明，对于中流速和快速流速的滤纸片，戊二醛交联法固定的抗体结合能力优于高碘酸盐氧化法。此外，通过戊二醛交联法固定在纤维素纸片上的捕获抗体保持了其功能活性，并且即使纸片经受了15次涡旋洗涤所产生的机械应力，抗体仍能稳定地固定在纸片上。实验发现，10%脱脂奶粉封闭缓冲液在经历15次洗涤后仍能保持其封闭效率（图S5）。

共价固定的抗体被用于进行针对IgG检测的夹心ELISA。使用基于纸片的检测方法，肉眼即可检测到浓度为100 ng/ml的IgG。当每一步均孵育一小时时，IgG血清浓度在0...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由新加坡教育部通过转化与创新基金（MOE2012-TIF-2-G-009）提供经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
纤维素滤纸，1号规格（中速流动滤纸）GE Healthcare Pte Ltd Singapore 1001 110
纤维素滤纸，113号规格（快速流动滤纸）Sigma-Aldrich, Singapore1113-320
戊二醛Sigma-Aldrich, SingaporeG6257Ⅱ级，25% 水溶液 H2O
表面活性剂Tween-20, Sigma-Aldrich, SingaporeP2287
牛血清白蛋白 Sigma-Aldrich, SingaporeA2153
脱脂奶粉Louis François 由 Kitchen Capers, Singapore 分装
Tris 碱PromegaH5135
高碘酸钠Merck106597
Na2HPO4Merck106585
KH2PO4Merck104873
NaClCALBIOCHEM567441
NaOHMerck106462
HClMerck100317
磷酸盐缓冲液（PBS）N/AN/APBS 含有 137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、8.0 mmol⁠/⁠L Na2HPO4 和 1.5 mmol/L KH2PO4，使用水配制，并用 0.1 mol/L NaOH 或 0.1 mol/L HCl 调节至 pH 7.4
丙酮Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore9005-68
TMB 与过氧化氢溶液混合物 1-Step ultra TMB-ELISA 溶液，Thermo Scientific Pierce340291 L
兔抗人 IgG-FITCTWC/Bio Pte Ltd Singaporesc-2278
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgGTWC/Bio Pte Ltd Singaporesc-2030
亲和纯化的山羊抗小鼠 IgG-Fc 包被抗体Bethyl Laboratories, IncA90-131A
小鼠参考血清Bethyl Laboratories, IncRS10-101-59.5 mg/ml
HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG-Fc 检测抗体Bethyl Laboratories, IncA90-131P
仪器
傅里叶变换红外光谱仪Shimadzu IR Prestige-21 N/A
荧光分子成像仪Pharos FXTM plus 分子成像仪，Bio-Rad, SingaporeN/A
烘箱NUVE FN500N/A
Turbo 混匀仪 VM-2000MYC LTDN/A
ImageJRGB，免费下载N/A

参考文献

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抗体共价结合至纤维素纸片及其在肉眼可见比色免疫测定中的应用
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