利用基因组编辑技术，现在可以在多种生物体中实现基因靶向诱变。本文以Astyanax mexicanus（一种包含表层鱼和洞穴鱼的鱼类）为例，演示一种使用转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）进行靶向基因诱变的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
确定驱动进化变化的基因等位基因，对于理解进化的机制与原因至关重要。为此，近年来大量研究工作集中于在多种物种中鉴定与性状进化相关的候选基因。然而，直到最近，对这些有趣的候选基因进行功能验证仍具挑战性。近年来发展的基因工程技术使得在多种生物体中对特定基因进行操控成为可能。将该技术应用于具有进化研究意义的生物体，将前所未有地揭示候选基因在进化过程中的作用。Astyanax mexicanus（A. mexicanus）是一种具有地表栖息和洞穴栖息两种形态的鱼类。多个独立的洞穴种群由共同的地表祖先演化而来，这些种群之间以及与地表鱼类之间均可杂交，从而为解析洞穴性状的遗传基础提供了可能。A. mexicanus 已被广泛用于多项进化研究，包括通过连锁分析鉴定多个性状的候选基因。因此，A. mexicanus 是应用基因组编辑技术来检验候选基因功能的理想体系。本文报道了一种利用转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）对地表型 A. mexicanus 进行基因突变的方法。已有研究应用 TALENs 在 A. mexicanus 中对色素基因进行基因组编辑并成功诱导突变。该技术还可用于评估其他多种在 A. mexicanus 洞穴形态中演化出的性状相关候选基因的功能。
引言
理解性状进化的遗传基础是进化生物学家的一项关键研究目标。在鉴定控制性状进化的基因位点以及确定这些位点内的候选基因方面，已取得显著进展（例如1-3）。然而，由于目前用于研究性状进化的许多生物尚不具备良好的遗传可操作性，对这些基因功能作用的验证仍然具有挑战性。基因组编辑技术的出现极大地提高了多种生物的遗传可操控性。转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPRs）已被用于在多种生物中实现对基因的靶向突变（例如4-11）。将这些工具应用于具有进化意义的生物体系，有望彻底改变进化生物学家研究进化遗传基础的方式。
Astyanax mexicanus 是一种具有两种形态的鱼类：一种是栖息于河流的表层形态（表层鱼），另一种是多种栖息于洞穴的形态（洞穴鱼）。A. mexicanus 洞穴鱼由表层鱼祖先演化而来（综述见12）。洞穴鱼种群演化出多种特征，包括眼睛退化或缺失、色素减少或消失、味蕾数量增加以及头颅神经丘增多，行为上也发生变化，如失去群游行为、攻击性增强、摄食姿势改变以及暴食现象13-19。洞穴鱼与表层鱼之间可杂交繁殖，已通过遗传定位实验鉴定出与洞穴特征相关的基因位点及候选基因1,20-26。部分候选基因已在细胞培养中1,19、其他物种的模式生物中21，或通过过....
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方案
所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院的指导方针，并已获得爱荷华州立大学和马里兰大学机构动物护理与使用委员会的批准。
1. TALEN 设计
- 将目标序列输入至TALEN设计网站（例如：https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen），并输入选定的间隔区/重复单元阵列长度。
- 将基因组序列复制到标注为 "Sequence" 的输入框中。
- 在 "Provide Custom Spacer/RVD Lengths" 选项卡中，选择间隔区长度和重复单元阵列长度。
注意：15个碱基对的间隔区长度以及15–17个重复单元的阵列长度效果良好，且可降低构建复杂性。
- 选择一对TALEN。围绕唯一限制性酶切位点设计的TALEN对，可通过限制性酶切PCR产物进行基因型鉴定。
- 使用Primer3等网站设计引物，以扩增TALEN靶位点周围的基因组区域30-32。若使用限制性酶进行基因型鉴定，应设计引物以扩增仅包含一个限制性酶切位点的区域。建议在构建TALEN前，先对该区域进行扩增和测序，以鉴定将用于显微注射的 A. mexica....
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结果
成对的 TALEN 注射后，其 RVD 结构域会结合到特定的 DNA 核苷酸上，从而引起 FokI 结构域的二聚化，导致双链断裂39，这些断裂可通过非同源末端连接（NHEJ）途径进行修复。NHEJ 修复过程常引入错误，导致插入或缺失（indel）。可通过扩增 TALEN 靶位点周围的区域，并用能切割 TALEN 间隔区的限制性内切酶消化扩增产物来检测 indel。不含 indel 的等位基因会被酶切，而含有改变限制性内切酶识别序列的 indel 的等位基因则不能被酶切，从而产生一条抗限制性内切酶的条带（图 2）。
TALEN 注射很可能在 A. mexicanus29 中导致双等位基因突变。因此，部分表型可在创始鱼中进行评估。例如，我们评估了表面鱼在注射靶向 oca2 基因的 TALEN 后的色素沉着情况，该基因被认为在多.......
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讨论
近年来，在理解性状进化的遗传基础方面已取得重大进展。尽管已鉴定出多个与性状进化相关的候选基因，但由于大多数具有进化研究价值的物种缺乏遗传可操作性，对这些基因进行体内功能验证仍然具有挑战性。本文报道了一种在A. mexicanus中进行基因组编辑的方法，该物种常用于研究洞穴动物的进化。遗传定位研究1,21,23和候选基因方法19,40已鉴定出多个与A. mexicanus洞穴型性状进化相关的候选基因。近期发表的洞穴鱼基因组41为鉴定洞穴性状进化的候选基因提供了又一强有力的工具。要验证其中许多候选基因的功能，需要具备降低基因表达的技术手段。目前在A. mexicanus中研究基因表达下调的唯一方法是使用吗啉代寡核苷酸（morpholinos）。然而，吗啉代介导的基因敲降是瞬时的，仅限于受精后数天内有效，无法用于研究成体动物的性状，例如成年洞穴鱼与表层鱼之间的行为差异，如群游行为17、暴食行为19以及振动吸引行为42。利用TALENs等技术构.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由遗传学、发育与细胞生物学系、爱荷华州立大学以及美国国立卫生研究院资助项目EY024941（WJ）资助。Jeffrey Essner博士对本文稿提出了修改意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器 | |||
| PCR仪 | |||
| 显微注射站 | |||
| 凝胶电泳装置 | |||
| 玻璃毛细管拉制仪 | |||
| 超微量分光光度计（Nanodrop） | |||
| 名称 | 公司 | 货号 | 备注 |
| 耗材 | |||
| 注：据我们所知，除非另有说明，不同公司的耗材均可使用 | |||
| Golden Gate TALEN 和 TAL 效应子试剂盒 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| Fisher BioReagents LB 琼脂，Miller（颗粒状） | Fisher | BP9724-500 | |
| Fisher BioReagents 微生物培养基：LB 肉汤，Miller | Fisher | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15（50% 乙醇溶液） | Teknova（通过 Fisher 订购） | 50-843-314 | |
| 硫酸链霉素二盐酸盐，Fisher BioReagents | Fisher | BP2957-1 | |
| Super Ampicillin（1,000 倍溶液） | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal 溶液（即用型） | Thermo Sci Fermentas Inc（通过 Fisher 订购） | FERR0941 | |
| IPTG，Fisher BioReagents | Fisher | BP1620-1 | |
| 培养皿 | Fisher | 08-757-13 | |
| BsaI | New England Biolabs（通过 Fisher 订购） | 50-812-203 | 使用 BsaI，而非 BsaI-HF（参见 Golden Gate TALEN 和 TAL 效应子试剂盒说明书） |
| BSA | New England Biolabs | 随限制性内切酶提供 | |
| 10x T4 连接酶缓冲液 | Promega（通过 Fisher 订购） | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega（通过 Fisher 订购） | PRM7123 | 可使用其他 Taq 酶，但反应条件需相应调整 |
| 快速连接试剂盒 | New England Biolabs（通过 Fisher 订购） | 50-811-728 | 我们使用 Quick Ligase 进行所有 TALEN 构建反应 |
| One Shot TOP10 化学感受态大肠杆菌 | Invitrogen | C4040-06 | 可使用其他化学感受态细胞或自制感受态细胞 |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc（通过 Fisher 订购） | FERER0451 | |
| Plasmid-Safe ATP 依赖性 DNase | Epicentre（通过 Fisher 订购） | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 | Qiagen | 27106 | 初始质粒制备应使用 Qiagen 试剂盒（参见 Golden Gate TALEN 和 TAL 效应子试剂盒说明书） |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | |
| GeneMate LE 快溶琼脂糖 | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega（通过 Fisher 订购） | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 转录试剂盒 | Ambion | AM1348M | |
| RNeasy MinElute 纯化试剂盒 | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly 样品上样染料 | Ambion（通过 Fisher 订购） | AM8551 | |
| Eliminase | Decon（通过 Fisher 订购） | 04-355-32 | |
| Fisherbrand 一次性钠钙玻璃巴斯德吸管 | Fisher | 13-678-6B | |
| 标准玻璃毛细管 | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| Eppendorf Femtotips 显微注射尖端（用于 Femtojet 显微注射仪） | Eppendorf（通过 Fisher 订购） | E5242956003 | |
| 氢氧化钠 | Fisher | S318-500 | |
| Tris 碱 | Fisher | BP152-1 |
参考文献
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
- Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mut....
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