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方法文章

使用转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）对墨西哥盲鱼（Astyanax mexicanus）进行基因组编辑

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DOI：

10.3791/54113

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2016年6月20日

 ,  , 
1Genetics, Development and Cell Biology, Iowa State University, 2Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, 3Department of Biology, University of Maryland

本文内容

摘要

利用基因组编辑技术，现在可以在多种生物体中实现基因靶向诱变。本文以Astyanax mexicanus（一种包含表层鱼和洞穴鱼的鱼类）为例，演示一种使用转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）进行靶向基因诱变的实验方案。

摘要

确定驱动进化变化的基因等位基因，对于理解进化的机制与原因至关重要。为此，近年来大量研究工作集中于在多种物种中鉴定与性状进化相关的候选基因。然而，直到最近，对这些有趣的候选基因进行功能验证仍具挑战性。近年来发展的基因工程技术使得在多种生物体中对特定基因进行操控成为可能。将该技术应用于具有进化研究意义的生物体，将前所未有地揭示候选基因在进化过程中的作用。Astyanax mexicanus（A. mexicanus）是一种具有地表栖息和洞穴栖息两种形态的鱼类。多个独立的洞穴种群由共同的地表祖先演化而来，这些种群之间以及与地表鱼类之间均可杂交，从而为解析洞穴性状的遗传基础提供了可能。A. mexicanus 已被广泛用于多项进化研究，包括通过连锁分析鉴定多个性状的候选基因。因此，A. mexicanus 是应用基因组编辑技术来检验候选基因功能的理想体系。本文报道了一种利用转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）对地表型 A. mexicanus 进行基因突变的方法。已有研究应用 TALENs 在 A. mexicanus 中对色素基因进行基因组编辑并成功诱导突变。该技术还可用于评估其他多种在 A. mexicanus 洞穴形态中演化出的性状相关候选基因的功能。

引言

理解性状进化的遗传基础是进化生物学家的一项关键研究目标。在鉴定控制性状进化的基因位点以及确定这些位点内的候选基因方面，已取得显著进展（例如1-3）。然而，由于目前用于研究性状进化的许多生物尚不具备良好的遗传可操作性，对这些基因功能作用的验证仍然具有挑战性。基因组编辑技术的出现极大地提高了多种生物的遗传可操控性。转录激活样效应因子核酸酶（TALENs）和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPRs）已被用于在多种生物中实现对基因的靶向突变（例如4-11）。将这些工具应用于具有进化意义的生物体系，有望彻底改变进化生物学家研究进化遗传基础的方式。

Astyanax mexicanus 是一种具有两种形态的鱼类：一种是栖息于河流的表层形态（表层鱼），另一种是多种栖息于洞穴的形态（洞穴鱼）。A. mexicanus 洞穴鱼由表层鱼祖先演化而来（综述见12）。洞穴鱼种群演化出多种特征，包括眼睛退化或缺失、色素减少或消失、味蕾数量增加以及头颅神经丘增多，行为上也发生变化，如失去群游行为、攻击性增强、摄食姿势改变以及暴食现象13-19。洞穴鱼与表层鱼之间可杂交繁殖，已通过遗传定位实验鉴定出与洞穴特征相关的基因位点及候选基因1,20-26。部分候选基因已在细胞培养中1,19、其他物种的模式生物中21，或通过过表达27、使用吗啉寡核苷酸进行瞬时敲低28等方法在 A. mexicanus 中验证其在洞穴特征形成中的功能作用。然而，这些方法均存在局限性。能够在 A. mexicanus 中产生基因突变等位基因，对于理解这些基因在洞穴鱼演化过程中的功能至关重要。因此，A. mexicanus 是应用基因组编辑技术的理想候选生物。

本文概述了一种利用TALENs对A. mexicanus进行基因组编辑的方法。该方法可用于评估显微注射后嵌合体创始鱼的表型，并用于分离在目标基因中具有稳定突变的鱼系29。

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方案

所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院的指导方针，并已获得爱荷华州立大学和马里兰大学机构动物护理与使用委员会的批准。

1. TALEN 设计

  1. 将目标序列输入至TALEN设计网站（例如：https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen），并输入选定的间隔区/重复单元阵列长度。
    1. 将基因组序列复制到标注为 "Sequence" 的输入框中。
    2. 在 "Provide Custom Spacer/RVD Lengths" 选项卡中，选择间隔区长度和重复单元阵列长度。
      注意：15个碱基对的间隔区长度以及15–17个重复单元的阵列长度效果良好，且可降低构建复杂性。
  2. 选择一对TALEN。围绕唯一限制性酶切位点设计的TALEN对，可通过限制性酶切PCR产物进行基因型鉴定。
  3. 使用Primer3等网站设计引物，以扩增TALEN靶位点周围的基因组区域30-32。若使用限制性酶进行基因型鉴定，应设计引物以扩增仅包含一个限制性酶切位点的区域。建议在构建TALEN前，先对该区域进行扩增和测序，以鉴定将用于显微注射的 A. mexicanus 实验室种群中可能存在的多态性。

2. TALEN 组装（修改自 TALEN 试剂盒方案）33,34

有关更多详细信息和故障排除，请参见方案34。

  1. 根据制造商说明书，从TALEN试剂盒中制备并测序所需的质粒。
  2. 设置反应A和反应B的#1反应。在反应A中加入重复可变二残基（RVDs）1-10和目的载体pFUS_A。在反应B中加入RVDs 11-(N-1)和目的载体pFUS_B(N-1)，其中N为TALEN中RVD的总数。
    1. 向每个反应中加入：每种含有RVD的质粒各1 µl（100 ng/µl），目标载体1 µl（100 ng/µl），1 µl BsaI 限制性内切酶，1 µl 牛血清白蛋白（BSA）（2 mg/ml），1 µl 连接酶，2 µl 10x 连接酶缓冲液，加水至总体积为 20 µl。例如，参见 表1.
      注意：也可使用半反应。
    2. 将反应物置于热循环仪中，运行以下程序：10个循环（37 °C/5分钟 + 16 °C/10分钟）+ 50 °C/5分钟 + 80 °C/5分钟。
  3. 用核酸酶孵育反应体系。向每个反应体系中加入1 µl 25 mM ATP和1 µl核酸酶，于37 °C孵育1小时。
  4. 转化反应
    1. 将每个反应的2.5 µl转化至25 µl化学感受态细胞中。
      注意：可使用自制的感受态细胞。然而，感受态较低的细胞可能导致无菌落生长。
      1. 将2.5 µl反应液与25 µl化学感受态细胞混合，冰上孵育5分钟，然后在42 °C孵育30秒。
      2. 将离心管置于冰上放置 2 分钟。加入 125 µl 含分解代谢抑制物的超优培养基（SOC）。在 37 °C 下振荡培养 1 小时。
    2. 将100 µl转化后的细胞涂布于含有壮观霉素（50 µg/ml）、X-gal和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的LB平板上，37 °C过夜培养。
  5. 为每个反应挑选2-3个白色菌落，使用引物pCR8_F1和pCR8_R1通过菌落PCR进行鉴定（表2).
    1. 配制试剂的预混液。例如，参见 表3.
    2. 挑取一个菌落，将其涂布于PCR管底部，然后将剩余的菌落转入含壮观霉素（50 µg/ml）的2 ml LB培养基中。向含有菌落的PCR管中加入15 µl的主混合液。
    3. 运行以下PCR程序（表4)
    4. 在1.5%琼脂糖凝胶上通过电泳检测PCR产物（使用全部反应体积）。正确的克隆应出现预期大小的条带，同时伴有弥散条带和梯状条带。有关适当弥散条带的示例，参见34,33.
    5. 在37 °C摇床培养箱中，于LB培养基中过夜培养2 ml正确克隆的菌液。
  6. 按照制造商说明书进行质粒小提。
  7. 使用 pCR8_F1 和 pCR8_R1 检测 TALEN 序列。遵循先前所述方法35.
  8. 使用经测序验证的正确克隆，进行反应#2（TALEN试剂盒），将A和B载体中的RVD以及最终RVD插入到目的载体中。
    1. 准备反应2的混合液（表5).
      注意：可以使用半反应。
    2. 将反应体系置于热循环仪中，并运行以下程序：37 °C/10 分钟 + 16 °C/15 分钟 + 37 °C/15 分钟 + 80 °C/5 分钟。
  9. 转化反应
    1. 将每个反应体系中的2.5 µl转化至25 µl化学感受态细胞中。
      1. 将2.5 µl反应液与25 µl化学感受态细胞混合，冰上孵育5分钟，42 °C热激30秒。
      2. 将试管置于冰上，加入125 µl SOC，然后将试管放入37 °C摇床培养箱中孵育1小时。
    2. 将100 µl转化后的细胞涂布于含有氨苄青霉素（100 µg/ml）、X-gal和IPTG的LB平板上，37°C过夜培养。
  10. 每个反应挑选1-3个白色菌落，使用引物TAL_F1和TAL_R2通过菌落PCR进行鉴定（表2).
    1. 按照所述方法配制聚合酶主混合液、水和引物的溶液 表3挑取一个菌落，将其涂布于PCR管底部，然后将剩余的菌落转入含氨苄青霉素（100 µg/ml）的2 ml LB培养基中。向含有菌落的PCR管中加入15 µl该溶液。
    2. 运行PCR程序（表6).
    3. 在1.5%琼脂糖凝胶上通过电泳检测PCR产物。正确的克隆将呈现弥散条带和梯状条带。有关适当弥散条带的示例，参见34,33.
    4. 在37 °C摇床培养箱中，于LB培养基中过夜培养2 ml正确克隆的菌液。
  11. 根据制造商说明书进行质粒小提。
  12. 使用 TAL_F1 和 TAL_R2 引物，按照先前描述的方法对 TALEN 序列进行测序验证35.

3. TALEN 的 mRNA 转录

  1. 取4 µg经序列验证的模板，加入2 µl SacI，在37 °C下消化2小时。
  2. 取2 µl SacI消化后的质粒，通过电泳在1.5%琼脂糖凝胶上进行检测。正确消化的质粒应显示为单一条带。
  3. 按照PCR纯化试剂盒说明书纯化剩余的SacI消化质粒。在洗脱前用洗涤液洗涤两次，最后将产物洗脱至30 µl无核酸酶水中。
  4. 按照T3 mRNA合成的标准操作流程进行：
    1. 使用上述制备的0.5 µg线性化模板进行半量反应，于37 °C孵育2小时。
    2. 加入0.5 µl DNase（试剂盒提供），于37 °C孵育15分钟。
  5. 按照制造商说明书纯化mRNA，洗脱至30 µl无核酸酶水中。
  6. 通过电泳在1.5%琼脂糖凝胶上检测mRNA：
    1. 使用去RNase污染的产品清洗凝胶装置，并制备1.2%琼脂糖凝胶。
    2. 将1 µl mRNA与4 µl无核酸酶水及5 µl乙二醛上样染料混合，样品于50 °C孵育30分钟。短暂离心后立即置于冰上，随后进行电泳。
  7. 使用核酸浓度定量方法测定浓度，并将RNA分装后于-80 °C保存。分装时应确保每份样品仅经历一次冻融循环。
    注意：通常可获得500–1,000 ng/µl的浓度。只要RNA完整性保持良好（凝胶上显示为清晰条带而非弥散条带），较低浓度的RNA也可使用。

4. 用 TALEN mRNA 注射 Astyanax mexicanus 胚胎

  1. 准备注射工具。
    1. 将1.2%琼脂糖溶于鱼用水（用碳酸氢钠和海盐调节至pH 7.4、电导率为700 µS的水）中，倒入培养皿制备注射板。在培养皿内放置模具（带有凸起结构的塑料件，用于形成鱼卵凹槽）。待琼脂糖凝固后取出模具，并于4 °C保存。有关模具的详细信息参见36。
    2. 按照制造商说明使用拉针仪制备注射针。
      注意：注射针长度需合适。过长的针过于柔软，不利于注射操作。拉针程序因所用设备而异。合适的注射针示例见图1。对于本实验所用设备，我们制备长度为5–6 cm的针，断裂后针尖外径约为0.011 mm。然而，应通过校准（步骤4.3.4）确定针孔宽度。拉针程序示例见表7。
    3. 通过折断玻璃移液管使其开口足够大以允许卵通过，从而制备用于胚胎转移的玻璃移液管。用火焰烧灼折断端直至不再锋利。
      注意：操作A. mexicanus卵和胚胎时，必须使用玻璃移液管和玻璃器皿，因为这些样本具有黏性，会黏附于塑料表面。
  2. 收集单细胞期卵。
    1. 按照标准方案37繁殖A. mexicanus。
      注意：例如，若鱼类维持在14小时光照:10小时黑暗的循环中，并采用Zeitgeber时间（ZT），其中ZT0为开灯时间，ZT14为关灯时间，则我们的表型鱼通常在ZT15至ZT19之间产卵。各实验室需根据自身条件确定确切的产卵时间。
    2. 通过在交配前3–4天过量喂食并转移鱼类至新鲜水中以诱导产卵。将水温升高2 °F。注意：我们初始水温约为74 °F。
    3. 在黑暗条件下收集表型鱼卵，每15分钟检查一次，以获取处于单细胞期的卵。单对表型鱼可获得数百枚卵。
    4. 使用玻璃器皿收集卵，防止其黏附于塑料表面。在显微镜下观察卵并挑选出处于单细胞期的胚胎进行注射前分离。将卵保存于新鲜系统水（成鱼饲养用的经pH和电导率调节处理的水）中。
  3. 注射TALEN mRNA。
    1. 注射不同总量的mRNA（成对TALEN中每种mRNA等量混合），以确定最佳注射浓度，因为不同TALEN对的毒性和效率存在差异。初始注射总mRNA浓度可设为400–800 pg。将mRNA稀释并混合至目标浓度，用于注射1.5 nl体积。
    2. 将稀释后的mRNA从针尾装入注射针，并将针连接至显微注射仪。
    3. 使用镊子折断针尖。
    4. 校准注射针。例如，连续喷射10次，将产生的液滴收集至微毛细管中。对于10 × 100次使用的1.0 µl、32 mm微毛细管，每次注射1.5 nl时，液滴应填充毛细管至0.5 mm长度。根据需要调整注射时间和压力。
    5. 将针插入单细胞中并注射mRNA。应直接将mRNA注入细胞内，而非卵黄中。
    6. 将注射后的胚胎收集至玻璃器皿中。保持胚胎在23–25 °C环境中培养。在注射后的最初几天内定期清除死亡胚胎（表现为浑浊且形态不规则的胚胎）。记录对照组（未注射）和实验组（注射）培养板中死亡和畸形胚胎的数量。
      注意：mRNA浓度升高可能导致胚胎毒性增加以及畸形或死亡率上升。因此，需权衡毒性与编辑效率，以确定最佳注射mRNA浓度。

5. 表型分析创始人鱼并评估 TALEN 效率

  1. 根据机构动物实验方案处死胚胎。
    注意：我们通过将胚胎在冰上快速冷却来进行安乐死。
  2. 使用移液管将胚胎收集到0.8 µl PCR条状管中。
    注意：基因分型可对单个胚胎或成组胚胎进行。
  3. 提取DNA。
    1. 将胚胎放入100 µl 50 mM氢氧化钠（NaOH）溶液中，95 °C孵育30分钟，随后冷却至4 °C。
    2. 加入1/10th 1 M Tris-HCl pH 8 的体积（10 µl）
  4. 使用第1.3步中设计的引物对该区域进行PCR扩增（参见 表 8 和 9 对于单个胚胎，1 µl DNA足以用于PCR反应。（参见样本实验方案）
  5. 用适当的限制性内切酶消化所得的PCR产物，并通过电泳在1.5%琼脂糖凝胶上进行检测。
    1. 例如，对于基因分型 眼皮肤白化病2（OCA2） 显微注射胚胎中的位点，用限制性内切酶消化PCR产物 Bsr通过加入0.5 µl的 Bsr向已完成的PCR反应液中直接加入12.5 µl，于65 °C孵育2小时。将未消化和已消化的产物在凝胶上电泳。限制性酶切抗性条带（即，未被酶切的条带）表明存在TALEN诱导的突变（图2).
  6. （可选）使用 Fiji 分析凝胶图像，通过确定未切割产物的百分比来计算突变率百分比38 使用凝胶分析工具计算每条条带的强度值，方法如前所述29.
  7. 通过TA克隆法克隆经凝胶纯化的限制性酶切抗性突变条带，对克隆进行测序以确定突变等位基因的序列。
    1. 凝胶纯化抗限制性内切酶的突变条带，操作遵循制造商说明书。按照制造商说明书对该条带进行TA克隆。挑取菌落，于37 °C摇床培养箱中在1.5 ml LB培养基中过夜培养。
    2. 按照制造商说明进行质粒小提培养。将DNA送样进行测序。
    3. 使用 ApE 等软件将突变序列与野生型序列进行比对。
      1. 将两个序列复制并粘贴到 ApE 文件中。选择 "比对两条序列" 工具从 "工具" 菜单
      2. 使用下拉菜单指定两个DNA序列。
        注意：根据PCR产物插入克隆载体的方向，可能需要使用所克隆序列的反向互补序列。如果序列无法比对，请重复步骤并检查 "反向互补" 框内 "对齐 DNA" 盒
  8. 在适当的发育阶段，采用与预期表型相适应的方法对创始人鱼进行表型分析29 （例如， 图3）。表型分析方法将基于研究人员使用该方案所靶向基因的预期表型。

6. 筛选生殖系传递

注意：A. mexicanus 在 4 至 8 个月时达到性成熟。

  1. 将性成熟的创始鱼与野生型鱼进行杂交。
  2. 使用步骤 5.1–5.7 中的方法对胚胎或成年鱼进行筛选（图4）。对于成年鱼，可在麻醉后剪取尾鳍组织样本。
    1. 将鱼浸入三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯）溶液中进行麻醉，以减少剪鳍过程中的应激反应。剪鳍后，将鱼置于新鲜水中恢复。鱼恢复迅速；需观察至其完全恢复正常活动（即游泳行为正常）。

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结果

成对的 TALEN 注射后，其 RVD 结构域会结合到特定的 DNA 核苷酸上，从而引起 FokI 结构域的二聚化，导致双链断裂39，这些断裂可通过非同源末端连接（NHEJ）途径进行修复。NHEJ 修复过程常引入错误，导致插入或缺失（indel）。可通过扩增 TALEN 靶位点周围的区域，并用能切割 TALEN 间隔区的限制性内切酶消化扩增产物来检测 indel。不含 indel 的等位基因会被酶切，而含有改变限制性内切酶识别序列的 indel 的等位基因则不能被酶切，从而产生一条抗限制性内切酶的条带（图 2）。

TALEN 注射很可能在 A. mexicanus29 中导致双等位基因突变。因此，部分表型可在创始鱼中进行评估。例如，我们评估了表面鱼在注射靶向 oca2 基因的 TALEN 后的色素沉着情况，该基因被认为在多...

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讨论

近年来，在理解性状进化的遗传基础方面已取得重大进展。尽管已鉴定出多个与性状进化相关的候选基因，但由于大多数具有进化研究价值的物种缺乏遗传可操作性，对这些基因进行体内功能验证仍然具有挑战性。本文报道了一种在A. mexicanus中进行基因组编辑的方法，该物种常用于研究洞穴动物的进化。遗传定位研究1,21,23和候选基因方法19,40已鉴定出多个与A. mexicanus洞穴型性状进化相关的候选基因。近期发表的洞穴鱼基因组41为鉴定洞穴性状进化的候选基因提供了又一强有力的工具。要验证其中许多候选基因的功能，需要具备降低基因表达的技术手段。目前在A. mexicanus中研究基因表达下调的唯一方法是使用吗啉代寡核苷酸（morpholinos）。然而，吗啉代介导的基因敲降是瞬时的，仅限于受精后数天内有效，无法用于研究成体动物的性状，例如成年洞穴鱼与表层鱼之间的行为差异，如群游行为17、暴食行为19以及振动吸引行为42。利用TALENs等技术构...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由遗传学、发育与细胞生物学系、爱荷华州立大学以及美国国立卫生研究院资助项目EY024941（WJ）资助。Jeffrey Essner博士对本文稿提出了修改意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器
PCR仪
显微注射站
凝胶电泳装置
玻璃毛细管拉制仪
超微量分光光度计（Nanodrop）
名称公司货号备注
耗材
注：据我们所知，除非另有说明，不同公司的耗材均可使用
Golden Gate TALEN 和 TAL 效应子试剂盒 2.0AddgeneKit #1000000024
Fisher BioReagents LB 琼脂，Miller（颗粒状）FisherBP9724-500
Fisher BioReagents 微生物培养基：LB 肉汤，MillerFisherBP1426-500
Teknova TET-15（50% 乙醇溶液）Teknova（通过 Fisher 订购）50-843-314
硫酸链霉素二盐酸盐，Fisher BioReagentsFisherBP2957-1
Super Ampicillin（1,000 倍溶液）DNA Technologies6060-1
ThermoScientific X-Gal 溶液（即用型）Thermo Sci Fermentas Inc（通过 Fisher 订购）FERR0941
IPTG，Fisher BioReagentsFisherBP1620-1
培养皿Fisher08-757-13
BsaINew England Biolabs（通过 Fisher 订购）50-812-203使用 BsaI，而非 BsaI-HF（参见 Golden Gate TALEN 和 TAL 效应子试剂盒说明书）
BSANew England Biolabs随限制性内切酶提供
10x T4 连接酶缓冲液Promega（通过 Fisher 订购）PR-C1263
GoTaq Green Master mixPromega（通过 Fisher 订购）PRM7123可使用其他 Taq 酶，但反应条件需相应调整
快速连接试剂盒New England Biolabs（通过 Fisher 订购）50-811-728我们使用 Quick Ligase 进行所有 TALEN 构建反应
One Shot TOP10 化学感受态大肠杆菌InvitrogenC4040-06可使用其他化学感受态细胞或自制感受态细胞
Esp 3IThermo Sci Fermentas Inc（通过 Fisher 订购）FERER0451
Plasmid-Safe ATP 依赖性 DNaseEpicentre（通过 Fisher 订购）NC9046399
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒Qiagen27106初始质粒制备应使用 Qiagen 试剂盒（参见 Golden Gate TALEN 和 TAL 效应子试剂盒说明书）
QIAquick PCR 纯化试剂盒Qiagen28104
GeneMate LE 快溶琼脂糖BioExpressE-3119-125
Sac IPromega（通过 Fisher 订购）PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 转录试剂盒AmbionAM1348M
RNeasy MinElute 纯化试剂盒Qiagen74204
NorthernMax-Gly 样品上样染料 Ambion（通过 Fisher 订购）AM8551
EliminaseDecon（通过 Fisher 订购）04-355-32
Fisherbrand 一次性钠钙玻璃巴斯德吸管Fisher13-678-6B
标准玻璃毛细管World Precision Instruments1B100-4
MicrocapsDrummond Scientific Company1-000-0010
Eppendorf Femtotips 显微注射尖端（用于 Femtojet 显微注射仪）Eppendorf（通过 Fisher 订购）E5242956003
氢氧化钠FisherS318-500
Tris 碱FisherBP152-1

参考文献

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TALEN基因组编辑基因突变胚胎显微注射mRNA制备PCR分析限制性酶切表型分析OCA2基因进化生物学
使用转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）对墨西哥盲鱼（Astyanax mexicanus）进行基因组编辑
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