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利用光稳定性氰基染料合成波长位移DNA杂交探针

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DOI：

10.3791/54121

⸱

2016年7月6日

 ,  , 
1Institute of Organic Chemistry, Karlsruhe Institute of Technology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

光稳定的氰基染料连接到寡核苷酸上，通过能量转移来监测杂交过程。

摘要

在本实验方案中，我们演示了一种通过自动化固相合成结合标准亚磷酰胺化学方法合成2'-炔基修饰脱氧核糖核酸（DNA）链的方法。寡核苷酸在合成后通过铜催化的点击化学反应，使用两种新型光稳定的氰染料进行标记。文中描述了供体染料和受体染料的合成过程，均分为三个连续步骤完成。以DNA作为支架结构，当这两种染料通过杂交靠近时，会发生能量转移。因此，两条单链DNA退火过程可通过荧光颜色的变化进行可视化。该颜色变化可通过荧光光谱法表征，也可直接使用手持式紫外（UV）灯观察。这种双荧光颜色读出的概念，结合所描述的光稳定染料，使这些寡核苷酸探针成为分子成像的优良工具。由此可避免成像探针的光漂白，从而实现对生物过程更长时间的实时观测。

引言

分子成像技术是理解活细胞内生物过程的一种基本方法。1-3 针对这类化学生物学应用，基于荧光核酸的探针开发已成为一个不断扩展的研究领域。这些荧光探针需满足若干基本要求，才能成为适用于细胞成像的有效工具。首先，所用染料应具有高量子产率、大斯托克斯位移，最重要的是高光稳定性，以实现长期的体内成像。其次，探针应能提供可靠的荧光信号读出。传统的发色团-淬灭剂体系依赖于荧光强度的简单变化来读取单一荧光颜色信号。4 这种方法存在产生假阳性或假阴性结果的风险，原因可能包括细胞内组分的自发荧光，或因其他组分的非特异性淬灭导致信噪比降低。4

我们最近报道了关于这一概念 "DNA交通灯" 通过使用两种不同的发色团，显示出双重荧光颜色读数。5-6 该概念基于供体染料向受体染料的能量转移（ET），该过程会改变荧光颜色（参见 图1）。这使得读数更加可靠，从而为荧光成像探针提供了强有力的工具。寡核苷酸的荧光染料标记可通过两种不同方法实现：染料可在固相化学DNA合成过程中，通过使用相应修饰的磷酸酰胺构建单元进行掺入。7 该方法仅限于在标准亚磷酰胺和去保护条件下稳定的染料。作为替代方案，寡核苷酸化学中已建立了合成后修饰方法。本文中，我们展示了新型光稳定能量转移对之一的合成过程8,9 利用叠氮化物与炔烃之间的铜催化1,3-偶极环加成反应（CuAAC）对DNA进行合成后标记。10

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方案

警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。这些合成过程中使用的多种化学品具有毒性且可能致癌。请遵守有机化学实验室通常要求的所有适当安全操作规程，例如穿戴实验服、护目镜和手套。

1. 染料的合成

注意：两种染料均可通过相同类型的反应合成。图2展示了这些反应的概览。

  1. 1-(3-叠氮丙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)乙烯基)吡啶碘化物（染料1）的合成
    1. 1-(3-碘丙基)-4-甲基吡啶碘化物的合成（图2A，步骤a）
      1. 将466 mg 4-甲基吡啶和5.91 g 1,3-二碘丙烷溶于20 ml顶空瓶中的10 ml乙腈中，用隔垫密封盖紧密封。
      2. 加热至85 °C，反应16小时。
      3. 冷却至室温，然后使用旋转蒸发仪在减压下除去溶剂。
      4. 向残留油状物中加入20 ml乙酸乙酯，并在120 W超声浴中处理3分钟。
      5. 通过过滤收集生成的沉淀，用乙酸乙酯洗涤五次。将固体产物在真空中过夜干燥。
    2. 1-(3-叠氮丙基)-4-甲基吡啶的合成（图2A，步骤b）
      1. 将900 mg 1-(3-碘丙基)-4-甲基吡啶碘化物和376 mg叠氮化钠溶于20 ml顶空瓶中的12 ml乙腈中，用隔垫密封盖紧密封。
      2. 加热至85 °C，反应16小时。
      3. 冷却至室温，然后使用旋转蒸发仪在减压下除去溶剂。
      4. 向残留物中加入15 ml二氯甲烷。
      5. 过滤并弃去生成的沉淀。
      6. 使用旋转蒸发仪在减压下除去溶剂，得到呈棕色油状的产物。
    3. 1-甲基-1H-吲哚-3-甲醛的合成（图2A，步骤c）
      1. 在惰性气体（氩气）保护下，将1.45 g 吲哚-3-甲醛、1.52 g 碳酸钾和2.70 g 碳酸二甲酯溶于装有回流冷凝器的50 ml圆底烧瓶中的10 ml无水二甲基甲酰胺中。
      2. 在130 °C下搅拌反应混合物19小时。
      3. 冷却至室温，然后将混合物倒入冰中。
      4. 用150 ml乙酸乙酯萃取水相三次。
      5. 合并有机相，用水洗涤，经无水硫酸钠干燥，使用旋转蒸发仪在减压下于50 °C除去溶剂。
    4. 偶联生成1-(3-叠氮丙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)乙烯基)吡啶碘化物（染料1）（图2A，步骤d）
      1. 在氩气保护及无水条件下操作。将90 mg 1-(3-叠氮丙基)-4-甲基吡啶和48 mg 1-甲基-1H-吲哚-3-甲醛溶于装有回流冷凝器的20 ml圆底烧瓶中的4 ml乙醇中。
      2. 加入0.07 ml哌啶，加热至80 °C反应4小时。
      3. 冷却至室温。
      4. 通过过滤收集生成的沉淀，用乙醚洗涤三次。
      5. 向滤液中加入乙醚，再次通过过滤收集生成的沉淀，用乙醚洗涤三次。
      6. 合并所有沉淀物。
  2. 1-(3-叠氮丙基)-4-(2-(1-甲基-2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙烯基)喹啉碘化物（染料2）的合成
    1. 1-(3-碘丙基)-4-甲基喹啉碘化物的合成（图2B，步骤a）
      1. 将715 mg 4-甲基喹啉和5.91 g 1,3-二碘丙烷溶于20 ml顶空瓶中的10 ml乙腈中，用隔垫密封盖紧密封。
      2. 加热至85 °C，反应16小时。
      3. 冷却至室温，然后使用旋转蒸发仪在减压下除去溶剂。
      4. 向残留油状物中加入20 ml乙酸乙酯，并在120 W超声浴中处理3分钟。
      5. 通过过滤收集生成的沉淀，用乙酸乙酯洗涤五次。将固体产物在真空中过夜干燥。
    2. 1-(3-叠氮丙基)-4-甲基喹啉的合成（图2B，步骤b）
      1. 将900 mg 1-(3-碘丙基)-4-甲基喹啉碘化物和333 mg叠氮化钠溶于20 ml顶空瓶中的12 ml乙腈中，用隔垫密封盖紧密封。
      2. 加热至85 °C，反应16小时。
      3. 冷却至室温，然后使用旋转蒸发仪在减压下除去溶剂。
      4. 向残留物中加入15 ml二氯甲烷。
      5. 过滤并弃去生成的沉淀。
      6. 使用旋转蒸发仪在减压下除去溶剂，得到呈棕色油状的产物。
    3. 1-甲基-2-苯基-1H-吲哚-3-甲醛的合成（图2B，步骤c）
      1. 在惰性气体（氩气）保护下，将1.45 g 2-苯基-1H-吲哚-3-甲醛、0.996 g 碳酸钾和1.77 g 碳酸二甲酯溶于装有回流冷凝器的50 ml圆底烧瓶中的10 ml无水二甲基甲酰胺中。
      2. 在130 °C下搅拌反应混合物19小时。
      3. 冷却至室温，然后将混合物倒入冰中。
      4. 用150 ml乙酸乙酯萃取水相三次。
      5. 合并有机相，用水洗涤，经无水硫酸钠干燥，使用旋转蒸发仪在减压下除去溶剂。
    4. 偶联生成1-(3-叠氮丙基)-4-(2-(1-甲基-2-苯基-1H-吲哚-3-基)乙烯基)喹啉碘化物（染料2）（图2B，步骤d）
      1. 在氩气保护及无水条件下操作。将90 mg 1-(3-叠氮丙基)-4-甲基喹啉和59.7 mg 1-甲基-2-苯基-1H-吲哚-3-甲醛溶于装有回流冷凝器的20 ml圆底烧瓶中的4 ml乙醇中。
      2. 加入0.06 ml哌啶，加热至80 °C反应4小时。
      3. 冷却至室温。
      4. 通过过滤收集生成的沉淀，用乙醚洗涤三次。
      5. 向滤液中加入乙醚，再次通过过滤收集生成的沉淀，用乙醚洗涤三次。
      6. 合并所有沉淀物。

2. DNA链的合成

注意：DNA链的合成采用M. Caruthers11所述的磷酸亚胺法，在DNA合成仪上进行固相合成。在合成程序开始前需测试合成仪的工作状态，必要时更换试剂。

  1. 预处理
    1. 将市售的2'-O-丙炔基脱氧尿苷亚磷酰胺（cU）溶解于1.2 ml亚磷酰胺稀释剂（超干乙腈）中。将溶液转移至合成仪专用小瓶中，并旋紧安装到合成仪上。
    2. 按照制造商说明执行"漏气检测"，确保无氩气泄漏。若"漏气检测"失败，请更紧密地旋紧小瓶。
    3. 通过填充连接至固相合成反应室的管路，对cU溶液进行引管预处理。
    4. 用乙腈清洗所有管路。
  2. DNA链的合成
    1. 使用连接的计算机，根据制造商操作指南的提示输入DNA序列和偶联方法。cU结构单元的偶联步骤需168秒，共7次脉冲（每次脉冲16 µl），而常规亚磷酰胺结构单元的偶联时间为40秒，同样为7次脉冲。
    2. 将装有CPG（可控孔径玻璃）的柱子安装至合成仪中，该柱子作为固相载体，其上修饰有1 µmol的第一碱基（DNA合成方向为3'至5'）。
    3. 启动DNA合成仪进行合成11。
  3. 合成后处理DNA链
    1. 在真空条件下过夜干燥含有合成DNA链的柱子。
    2. 使用钳子打开柱子，将CPG转移至反应小瓶中。加入700 µl浓氨水溶液，以脱保护寡核苷酸并使DNA链从CPG上释放。
    3. 盖紧小瓶，并在反应容器上加装安全盖以防爆裂，随后在50 °C下加热18小时。
    4. 在减压（100 mbar）、30 °C条件下离心30分钟，除去氨。
    5. 开始从CPG中过滤：将反应容器在11,000 × g下离心3分钟。取上清液转移至孔径为0.45 µm的离心过滤装置中，在1,000 × g下离心4分钟。
    6. 同时向CPG中加入300 µl双蒸水，涡旋振荡20秒，在11,000 × g下离心3分钟。将上清液转移至同一离心过滤装置中，在1,000 × g下离心4分钟。重复此洗涤步骤两次。
    7. 将合并的水溶液在0.1 mbar、25 °C条件下真空离心过夜，除去水分。

3. "点击" 操作步骤

  1. 向冻干的炔基修饰DNA样品中加入50 µl双蒸水、25 µl抗坏血酸钠溶液（0.4 M，溶于水）、34 µl三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺（0.1 M，溶于DMSO/tBuOH 3:1）、114 µl叠氮化合物（0.01 M，溶于DMSO/tBuOH 3:1）以及17 µl四(乙腈)铜(I)六氟磷酸盐溶液（0.1 M，溶于DMSO/tBuOH 3:1）。
  2. 将样品在60 °C下孵育1.5小时。
  3. 冷却至室温。
  4. 向DNA样品中加入150 µl Na2EDTA（0.05 M，溶于水）和450 µl乙酸钠（0.3 M，溶于水），并转移至10 ml离心管中。
  5. 加入10 ml乙醇（100%），于-32 °C放置16小时。
  6. 在1,000 × g条件下离心15分钟，弃去上清液。
  7. 用2 ml冷乙醇（80%）洗涤DNA沉淀。
  8. 在减压条件下干燥沉淀。

4. HPLC 纯化

注意：在分离DNA链之前，确保高效液相色谱仪（HPLC）工作正常，有足够的溶剂，并且色谱柱清洁。用缓冲液/乙腈的起始浓度冲洗色谱柱。

  1. 将粗DNA沉淀溶解于250 µl双蒸水中，并转移至HPLC小瓶中。
  2. 开始HPLC运行，运行时间为45分钟，染料1采用0%乙腈至15%乙腈的梯度，染料2采用0%乙腈至17%乙腈的梯度。通过检测260 nm（DNA吸收峰）以及459 nm（染料1）或542 nm（染料2）监测运行过程。收集在两个波长通道均显示吸收峰的组分。
  3. 使用由3-羟基吡啶甲酸（3HPA）和二铵氢柠檬酸盐组成的基质，通过基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱法检测所收集组分的正确分子量。
    1. 通过将900 µl饱和3-HPA溶液（乙腈与水1:1混合液）与100 µl二铵氢柠檬酸盐水溶液（100 g/L）混合，制备基质溶液。
    2. 取1–2 µl DNA样品点样于靶板上，并在空气中自然干燥。
    3. 向样品中加入0.2 µl 3-HPA/二铵氢柠檬酸盐基质，混匀直至结晶。
    4. 进行MALDI质谱分析。
    5. 合并具有正确分子量的HPLC组分。

5. 浓度测定

注意：浓度通过使用紫外/可见光分光光度计在260 nm处测量吸光度，并根据DNA碱基和染料的消光系数（ε260）来确定。

  1. 将DNA溶解于100 - 200 µl双蒸水中。
  2. 取1 µl DNA溶液加入紫外/可见光分光光度计中。
  3. 测定260 nm处的吸光度，重复三次。
  4. 取平均值计算溶液浓度。计算消光系数时，使用四种天然碱基的ε260nm12以及购得的结构单元cU（视为天然尿苷）的ε260nm12 ，以得到整条DNA链的ε260nm。对于染料1，使用ε260nm = 10,200 L*mol-1*cm-1；对于染料2，使用ε260nm = 13,100 L*mol-1*cm-1。根据消光系数和测得的吸光度，依据朗伯-比尔定律计算溶液浓度13。

6. 样品制备与光谱分析

  1. 单链样品的制备
    1. 分别制备1 ml含有2.5 µM修饰DNA1和DNA2的溶液，溶剂为200 mM NaCl、50 mM NaPi缓冲液，pH = 7。
  2. 双链样品的制备
    1. 在反应容器中制备1 ml溶液，其中含2.5 µM DNA1和2.5 µM DNA2，溶剂为200 mM NaCl、50 mM NaPi缓冲液，pH = 7。
    2. 盖紧盖子并加上安全帽，加热至90 °C持续10分钟，然后关闭加热，静置过夜冷却至室温。
  3. 吸收光谱分析
    注意：为确定荧光光谱的激发波长，需先记录吸收光谱。
    1. 单链测量
      1. 记录仅含200 mM NaCl、50 mM NaPi缓冲液（pH = 7）的空白样品的吸收光谱。
      2. 将制备好的DNA1溶液转移至1 cm石英比色皿中，记录其吸收光谱，并用空白数据进行校正。确定染料吸收的最大值。
      3. 对DNA2重复上述步骤。
  4. 荧光光谱分析
    1. 单链测量
      1. 使用染料1的激发波长，记录仅含200 mM NaCl、50 mM NaPi缓冲液（pH = 7）的空白样品的荧光信号。
      2. 将DNA1溶液转移至1 cm石英比色皿中。
      3. 记录荧光光谱。
    2. 双链测量
      1. 将双链溶液转移至石英比色皿中。
      2. 使用染料1的激发波长记录荧光光谱。
  5. 可视化实验
    警告：应佩戴适当的眼部防护装备，以避免紫外线对眼睛造成损伤！
    1. 为更好地理解所记录光谱的含义，可使用手持式紫外灯照射比色皿（图5），观察从单链到双链DNA荧光颜色的变化。

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结果

单链和双链DNA的吸收光谱和荧光光谱如图4所示。

记录的吸收光谱（图4 右）显示，单链DNA1（染料1）在465 nm处有吸收峰λmax ，单链DNA2（染料2）在546 nm处有吸收峰。退火后的DNA1_2（染料1 & 染料2）在469 nm和567 nm处均出现吸收峰。两个吸收峰均发生红移，染料1红移4 nm，染料2红移21 nm。这些微小的光谱变化是染料在双螺旋DNA结构内发生激子相互作用的结果。

相应的荧光光谱（图4 左）显示，单链DNA1（染料1，激发波长435 nm）在537 nm处出现最大发射峰λmax,，单链DNA2（染料2，激发波长535 nm）在607 ...

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讨论

本方案展示了通过叠氮化荧光染料经CuAAC反应对DNA进行合成后标记的完整操作流程。内容包括染料的合成、炔基修饰DNA的制备以及标记过程。

染料的合成包含四个步骤。由于产物带有正电荷，均可通过较为简单的沉淀法获得，无需耗时的柱层析纯化。在中心偶联反应之前引入叠氮官能团，使染料的合成步骤从原先的五步缩短为四步。在烷基化步骤中采用1,3-二碘丙烷替代3-碘丙醇，从而避免了Appel反应以及后续将羟基转化为碘代基团的Finkelstein反应。与已发表的方法相比，这些改进使我们能够以更大的规模和更短的时间合成染料。

所使用的染料具有优异的光稳定性，但在固相DNA合成及后处理过程中缺乏必要的稳定性。因此，选择采用合成后标记策略。 alternatively，可在DNA合成过程中使用此类昂贵染料进行标记，但这需要极为温和的偶联和脱保护条件（例如，使用碳酸钾进行脱保护）。该方法成本显著更高，且需要合成相应的染料修饰的磷酰胺单体作为DNA合成单元，或在固相载体上进行标记（珠上标记）。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢德国研究基金会（DFG, Wa 1386/17-1）、DFG资助的研究培训组GRK 2039以及卡尔斯鲁厄理工学院（KIT）提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
合成
4-皮考啉Sigma Aldrich239615
1,3-二碘丙烷Sigma Aldrich238414
乙腈Fisher Scientific10660131HPLC 级
乙酸乙酯Fisher Scientific10456870工业级
叠氮化钠Sigma Aldrich71290p.a. 级
二氯甲烷Fisher Scientific10626642工业级
吲哚-3-甲醛；98%ABCRAB112969
碳酸钾，99+%Acros424081000
碳酸二甲酯Sigma Aldrich517127
N,N-二甲基甲酰胺，99.8%，分子筛干燥Acros348435000
硫酸钠Bernd Kraft12623.46
乙醇，99.5%Acros397690010
哌啶，99%Acros147181000
乙醚Fisher Scientific10407830工业级
2-苯基吲哚-3-甲醛；97%ABCRAB125050
4-甲基喹啉ABCRAB117222
DNA 合成
Expedite 8909 核酸合成仪Applied Biosystems -
DMT-dA(bz) 磷酸三酯Sigma AldrichA111081
DMT-dT 磷酸三酯Sigma AldrichT111081
DMT-dG(dmf) 磷酸三酯Sigma AldrichG11508
DMT-dC(bz) 磷酸三酯Sigma AldrichC11108
DNA 合成用磷酸三酯稀释液Sigma AldrichL010010
DNA 合成用超纯乙腈Sigma AldrichL010400
封端试剂 ASigma AldrichL840000
封端试剂 BSigma AldrichL850000
CPG dT 柱，1.0 µmolProligo ReagentsT461010
CPG dA(bz) 柱，1.0 µmolProligo ReagentsA461010
CPG dG(ib) 柱，1.0 µmolProligo ReagentsG461010
CPG dC(bz) 柱，1.0 µmolProligo ReagentsC461010
氨水（水溶液） Fluka Analytical318612
离心浓缩装置 Nanosep 0.45 µmPallODGHPC34
5-(苄硫基)-1H-四唑（活化剂）Sigma Aldrich75666
2'-O-丙炔基脱氧尿苷磷酸三酯Chem GenesANP-7754
后处理
真空浓缩仪Christ
点击反应步骤
六氟磷酸四(乙腈)合铜(I)Sigma Aldrich346276
乙酸钠Sigma AldrichS2889
(+)-L-抗坏血酸钠Sigma AldrichA7631
EDTA 二钠盐Sigma AldrichE5134
TBTA 配体 - -根据文献方法合成1
HPLC
HPLC 系统Shimadzu
MALDI-Biflex-IV 质谱仪Bruker Daltonics
LC-318 C18 色谱柱Supelcosil via Sigma Aldrich58368
浓度测定
ND 1000 分光光度计nanodrop
样品制备与光谱分析
Cary 100 BioVarian
Fluoromax-3 荧光光谱仪Jobin-Yvon
1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.

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DNA

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