本文介绍了用于电子顺磁共振研究的五聚体配体门控通道的定点自旋标记和重组方法。该方案可适用于任何膜蛋白。此处描述的重组方法也可用于在特定脂质体系中进行宏观和单通道电流的膜片钳测量。
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本文内容
摘要
摘要
离子通道门控是由刺激驱动的蛋白质运动协调过程，可导致通道在关闭态、开放态和失敏态之间发生构象转变。这些转变的基础在于蛋白质固有的柔性，而这种柔性受到膜脂质组成的关键调控。为了更好地理解通道功能的结构基础，有必要在生理性的膜环境中研究蛋白质的动力学行为。电子顺磁共振（EPR）波谱技术是表征功能状态之间构象转变的重要工具。与核磁共振（NMR）和X射线晶体学相比，EPR所提供的信息本质上分辨率较低。然而，与其他技术不同的是，EPR对蛋白质的分子量没有上限要求，样品需求量显著更少，更重要的是，蛋白质不受晶体晶格力的限制。因此，EPR特别适用于研究大型蛋白质复合物以及在重建体系中的蛋白质。本文将以一种来自Gloeobacter violaceus（GLIC）的原核质子门控五聚配体门控离子通道（pLGIC）为例，介绍位点特异性自旋标记和膜重建的一般实验方案。本文将描述稳态连续波（CW）和脉冲式（双电子-电子共振，DEER）EPR技术的联合应用，以实现对通道动力学的全面定量表征。
引言
在过去十年中，由于获得了该家族多个成员的大量高分辨率结构，人们对五聚体配体门控离子通道（pLGIC）的结构理解取得了突飞猛进的发展。推动该领域当前进展的关键因素包括：原核生物pLGIC通道的发现1-3、真核膜蛋白表达方面的重大进展4-6，以及结构解析方法的巨大突破7。这些结构清晰地揭示了pLGIC三维结构整体上的保守性。然而，目前仍有两个主要方面相对滞后，即这些通道样品的功能表征以及通道功能的机制性描述。
门控构象变化十分复杂，沿通道长度方向可跨越60 Å的距离，且这些转变过程受到膜脂的广泛调控。特别是，阴离子脂质、胆固醇和磷脂已被证明可调节pLGIC的功能8-11。尽管这些脂质成分在通道功能中的确切作用仍不清楚，但要全面理解门控的分子机制，必须在通道的天然环境中对其进行研究。定点自旋标记（Site-Directed Spin Labeling, SDSL）和电子顺磁共振（Electron Paramagnetic Resonance, EPR）波谱技术是研究重建体系中蛋白质动态特性的首选方法。EPR波谱技术不受分子尺寸（如核磁共振NMR）或样品光学性质（如荧光光谱）的限制，因此能够在天然脂质条件下对全长蛋白进行检测。该技术具有极高的灵敏度，且样品需求量极低（在皮摩尔量级）。这两个优势使该技术特别适用于研究难以大量表达（超过毫克量级）的大型膜蛋白。
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方案
1. 定点突变与半胱氨酸突变
- 克隆与定点突变
注意：GLIC 野生型（wt）35 含有一个天然半胱氨酸（C27），该位点被突变为丝氨酸以构建无半胱氨酸背景。在无半胱氨酸背景上，通过携带目标位置半胱氨酸密码子的引物进行定点突变，引入半胱氨酸突变36。- 将 5 μl 10x 反应缓冲液、1 μl 浓度为 100 ng/μl 的无半胱氨酸 GLIC 模板 DNA35、正向和反向引物（各 0.5 μl，浓度 40 μM）36、1 μl dNTPs（100 mM）以及 41 μl 去离子水混合。用移液器反复吹打数次以充分混匀，短暂离心（6,000 rpm），最后加入 1 μl DNA 聚合酶。
- 将热循环仪设置为以下程序：
- 95 ºC 变性 4 分钟。
- 95 ºC 变性 30 秒。
- 55 ºC 退火 1 分钟。
- 68 ºC 延伸 10 分钟（约每 kb 质粒长度延伸 1 分钟）。
- 重复步骤 1.1.2.2 至 1.1.2.4 共 18 个循环。
- 最终在 68 ºC 延伸 10 分钟。
- 4 ºC 保存
注意：退火温度根据引物的 Tm 值计算确定。
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结果
自旋标记GLIC突变体的生化表征
按照上述方案操作，通常每升培养液可获得 10 - 12 mg 的 GLIC-MBP 融合蛋白。尽管该产量在不同突变体间可能存在差异，特别是对于蛋白内部埋藏位点的突变，产量可能会显著降低。在此类情况下，可能需要扩大培养体积。为操作方便，HRV3C 蛋白酶对融合蛋白的切割反应通常过夜（O/N）进行。通过 SDS-PAGE 凝胶电泳分析样品，我们发现该切割反应在 30 - 60 分钟内即可完成（图 1A）。经凝胶过滤层析纯化后，GLIC 主要以五聚体形式洗脱，保留体积为 11.3 ml；MBP 组分在 15 ml 处洗脱，聚集体在柱的空体积处洗脱（约 7.0 ml）。自旋标记物则在洗脱末期出现（约 24 ml）（图 1B）
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讨论
电子顺磁共振（EPR）波谱技术已被证明是在近天然环境中定量膜蛋白构象变化的一种无与伦比的结构研究方法。该方法使我们得以窥见蛋白质动态的分子细节，而这些细节在X射线晶体学和冷冻电子显微镜获得的高分辨率结构中往往被掩盖。然而，必须考虑该方法的技术局限性，这些局限性可能影响其在其他体系中的普遍适用性，同时也需注意实验过程中可能出现的潜在障碍。下文将讨论其中一些方面，并提供推荐的故障排除策略。
在涉及大量突变扰动的技术中，常见的问题之一是蛋白质产量低以及寡聚稳定性差。当研究对象为离子通道等复杂的多亚基膜蛋白时，这一问题尤为突出。因此，在开展大规模定点突变之前，优化蛋白质的这两个生化特性至关重要。我们发现，在 BL21 细菌的 C41 和 C43 菌株中，毒性 GLIC 突变体的表达耐受性更佳。3,36 此外，将诱导后的温度降低至 15 - 18 ºC，IPTG 浓度减少至 100 μM，并在诱导过程中添加 5% 甘油，似乎有助于降低蛋白质聚集，这可能是通过减缓蛋白质表达速率和减少错误折叠程度实现的。在某些位点（特别是在通透途径中）引入半胱氨酸突变已被证明会增加通道的组.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们非常感谢Chakrapani实验室现任和前任成员对本文手稿的仔细审阅和宝贵意见。 本研究得到了美国国立卫生研究院基金（1R01GM108921）、美国心脏协会（NCRP科学家发展基金12SDG12070069）以及SC的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 定点突变与半胱氨酸突变 | |||
| 10x PfuUltra HF 反应缓冲液 | Agilent Technologies | 600380-52 | |
| dNTPs | New England BioLabs Inc | N0447L | 每种 dNTP 10 mM |
| pfu Ultra DNA 聚合酶 | Agilent Technologies | 600380-51 | 2.5 U/μL |
| DPNI | New England BioLabs Inc | R0176S | 20,000 U/mL |
| XL10 GOLD | Agilent Technologies | 200314 | |
| SOC 培养基 | New England BioLabs Inc | B9020S | |
| 卡那霉素 | Fisher Scientific | BP905 | |
| LB 培养基 | Invitrogen | 127957084 | |
| 质粒小提试剂盒 | QIAGEN | 27106 | |
| C43 感受态细胞 | Lucigen | 60446 | |
| 表达与纯化 | |||
| 葡萄糖 | Fisher Scientific | D16 | |
| 胰蛋白胨 | Fisher Bioreagents | BP1421-500 | |
| 酵母提取物 | Amresco | J850 | |
| 甘油 | Fisher Bioreagents | BP229 | |
| K2HPO4 | Amresco | 0705 | |
| K2HPO4 | Amresco | 0781 | |
| IPTG（异丙基硫代-β-半乳糖苷） | Gold Biotechnology | I2481C25 | |
| Trizma Base | Sigma Life Science | T1503 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| DNase I | Sigma Life Science | DN25 | |
| PMSF | Amresco | M145 | |
| 亮抑蛋白酶肽 | Amresco | J580 | |
| 胃蛋白酶抑制剂 | Amresco | J583 | |
| DDM（正十二烷基-β-D-麦芽糖苷） | Anatrace | D310S | |
| 直链淀粉树脂 | New England BioLabs Inc | E8021L | |
| TCEP | Amresco | K831 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118 | |
| 麦芽糖 | Acros Organics | 329915000 | |
| Superdex 200 GL | GE Healthcare | 17-5175-01 | |
| 空的聚丙烯层析柱 | BioRad | 731-1550 | |
| 定点自旋标记 | |||
| MTSL（1-氧基-2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉-3-甲基）甲烷硫代磺酸盐 | Toronto Research Chemicals Inc | O873900 | |
| (1-乙酰氧基-2,2,5,5-四甲基-Δ3-吡咯啉-3-甲基) 甲烷硫代磺酸盐 | Toronto Research Chemicals Inc | A167900 | |
| DMSO | J.T. Baker | 9224-01 | |
| 重组 | |||
| 大豆磷脂酰胆碱脂质 | Avanti Polar Lipids Inc | 541602C | |
| 生物珠（聚苯乙烯珠） | Bio Rad | 152-3920 | |
| 甲醇 | Fisher chemicals | A413 | |
| FRET | |||
| 荧光素马来酰亚胺 | ThermoFisher Scientific | F-150 | |
| 四甲基罗丹明马来酰亚胺 | ThermoFisher Scientific | T-6027 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids Inc | 850457C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids Inc | 840457C | |
| E.coli 极性脂质提取物 | Avanti Polar Lipids Inc | 100600C | |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | |
| EPR 测量 | |||
| TPX 塑料毛细管 | Bruker | ER221 | |
| EDDA（乙二胺-N,N'-二乙酸） | Aldrich | 158186 | |
| Ni(OH)2 | Aldrich | 283622 |
参考文献
- Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4(2005).
- Hilf, R. J., Dutzler, R.
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重印与许可
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