方法文章

具有不同代谢表型的未成熟、成熟及耐受性树突状细胞的制备

DOI：

10.3791/54128

⸱

2016年6月22日

 ,  ,  , 
1Translational Immunology, Institute of Molecular and Cell Biology, Agency for Science, Technology and Research, 2Singapore Immunology Network, 3Institute of Biomedical Studies, Baylor University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

不成熟树突状细胞可被选择性地分化为耐受性或成熟树突状细胞，以调节免疫与耐受之间的平衡。本研究提供了一种从不成熟单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）生成的方法 体外 具有不同代谢表型的耐受性与成熟moDCs。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

免疫反应源于非特异性识别抗原的先天免疫系统与特异性识别抗原的适应性免疫系统之间复杂的相互作用。免疫系统始终处于维持对自身分子耐受与快速应对病原体之间的动态平衡。树突状细胞（DCs）是一类强大的专业抗原呈递细胞，能够连接先天免疫系统与适应性免疫系统，并在自身与非自身之间调节适应性免疫应答的平衡。根据不同的成熟信号，未成熟的树突状细胞可被选择性地刺激分化为免疫原性树突状细胞或耐受性树突状细胞。免疫原性树突状细胞可为抗原特异性T细胞提供增殖信号，促进其克隆扩增；而耐受性树突状细胞则通过诱导抗原特异性T细胞的删除或调节性T细胞的克隆扩增来调控免疫耐受。由于这一独特特性，树突状细胞作为治疗癌症和自身免疫性疾病的治疗剂备受关注。树突状细胞可被负载特定抗原 体外 并注入人体以引发特异性免疫反应，包括免疫原性和耐受性免疫反应。本研究提供了一种生成方法 体外 从单核细胞、未成熟的单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）、耐受性moDCs以及成熟moDCs，这些细胞在表面标志物表达、功能和代谢表型上存在差异。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

树突状细胞（DC）最早由 Paul Langerhans（即 Langerhans 细胞）于19世纪末首次描述，Jolles 1 引用了相关文献，随后 Ralph Steinman 和 Zanvil Cohn 于1973年对其进行了表征，并确认其为专职的抗原呈递细胞 2。DC 广泛分布于外周血及机体大多数组织中，尤其在暴露于外界环境的组织中含量丰富，例如皮肤（以 Langerhans 细胞形式存在）、鼻腔、肺、胃和肠道黏膜，这使其能够接触外源性抗原。未成熟 DC 具有内吞能力，但刺激 T 细胞的能力相对较弱 3。未成熟 DC 表达多种模式识别受体（PRRs），可识别病原体相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs）4。危险信号的激活促使 DC 向免疫原性表型成熟，而自身分子则导致 T 细胞无应答及凋亡 5。免疫原性 DC 的特征是主要组织相容性复合体（MHC）分子和共刺激表面分子表达上调，并具备激活初始 T 细胞的能力 6,7。

未成熟的树突状细胞也可在维生素D3代谢产物1a,25(O)作用下向诱导调节性T细胞（Treg）或耐受性状态分化。2D3 以及某些免疫抑制剂，如白细胞介素-10（IL-10）、地塞米松和雷帕霉素 8-9耐受性树突状细胞的特征是表达含有免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIMs）的表面受体和配体。在耐受性树突状细胞中，含有ITIMs的ILT家族成员ILT3和ILT4的信号转导可抑制同种异体增殖，并促进Foxp3的表达+ 调节性T细胞扩增 10,11这些耐受性树突状细胞的独特特性使其具有强大的效能 体内即诱导对移植的同种异体移植物产生持久耐受性，并抑制自身免疫性疾病的发展。因此，耐受性树突状细胞可被视为一种成熟极化型树突状细胞亚型，其功能在于抑制免疫激活。

目前，人类外周血中的树突状细胞主要有两种亚群：浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid DCs）和髓系树突状细胞（myeloid DCs）12。循环中的树突状细胞数量稀少，占人类血液白细胞的比例不足2%，这为分离出足够数量的树突状细胞以研究其免疫调节功能带来了困难。为克服这一问题，通常采用单核细胞来源的树突状细胞作为体外（in vitro）研究树突状细胞功能的模型。这些体外（in vitro）培养的树突状细胞在受体表达和功能方面与体内（in vivo）的树突状细胞相似。其他实验室已对体内（in vivo）树突状细胞与体外（in vitro）生成的单核细胞来源树突状细胞（moDCs）进行了详细的比较研究13,14,15。另有报道指出，moDCs与CD1c+树突状细胞在抗原呈递和T细胞诱导功能方面具有等效性15。

本文介绍了一种从外周血单核细胞生成未成熟单核细胞来源的树突状细胞（moDCs），并进一步将其分化为免疫原性或耐受性树突状细胞的方法。这些单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）通过其表面标志物、细胞因子谱、免疫调节功能及代谢状态进行表征。免疫原性和耐受性树突状细胞可分泌不同的细胞因子，从而分别促进同种异体T细胞或调节性T细胞的扩增。本文采用多重技术平台进行细胞因子谱分析，即将细胞培养上清与抗体偶联的编码微球共同孵育，并在小型分析仪中读取结果。树突状细胞的代谢状态则通过细胞外通量分析仪进行检测，该仪器可测量氧消耗率（反映细胞呼吸作用）和细胞外酸化率（反映树突状细胞的糖酵解通量）。这些生物能量代谢速率的测定为追踪树突状细胞发育与功能所依赖的细胞代谢变化提供了有效手段。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究已获得机构审查委员会的批准（NUS-IRB 10-250）。

1. 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离 

  1. 试剂的制备
    1. 制备 PBS/EDTA：将磷酸盐缓冲液（PBS）补充 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）。通过 0.2 µm 滤膜过滤该溶液以实现灭菌。注意将 PBS/EDTA 储存于 4 °C，使用前恢复至室温。
    2. 制备染色缓冲液：将磷酸盐缓冲液（PBS）补充 2% 胎牛血清（FBS）、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）和 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）。通过 0.2 µm 滤膜过滤该溶液以实现灭菌。
  2. 从血锥中收集血液
    注意：血锥含有医院血小板单采后收集的白细胞成分。若血液采集于肝素或 EDTA 管中，请以 1:1 比例用 PBS 稀释后进行步骤 1.3；若收到的是白细胞层（buffy coat），请以 1:2 比例用 PBS 稀释后进行步骤 1.3。
    1. 剪断血锥两端，使血液流入 50 ml 离心管中。注意血锥通常含有 10 ml 血液。
    2. 使用含有 30 ml PBS/EDTA 的钝头注射器冲洗血锥，并将冲洗液收集至 50 ml 离心管中。
    3. 用 PBS/EDTA 进一步稀释血液，最终体积为 80 ml。
  3. 通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs）16
    1. 将 15 ml Ficoll 分装至 4 个新的 50 ml 离心管中。
    2. 使用 25 ml 血清移液管将 20 ml 稀释后的血液缓慢加至 Ficoll 液面上方。注意将 50 ml 离心管倾斜约 45° 角，并小心避免扰动两相界面。
    3. 在 20 °C 条件下，以 805 × g 离心 30 分钟，离心过程中不启用刹车。
    4. 移除血浆层，并用巴斯德移液管收集位于血浆层下方的 PBMC 环状层。将四管 PBMC 合并至两个 50 ml 离心管中。注意避免收集 PBMC 层下方的透明层。
    5. 每管 PBMC 加入 PBS/EDTA 至终体积 50 ml，然后在 20 °C 条件下，以 548 × g 离心 10 分钟，启用刹车。
    6. 吸除上清液，每管沉淀用 25 ml 染色缓冲液重悬，并合并至一个 50 ml 离心管中。
    7. 在 4 °C 条件下，以 367 × g 离心 5 分钟，启用刹车。
    8. 吸除上清液，沉淀用 10 ml 染色缓冲液重悬。

2. 通过磁性分离法富集单核细胞17

  1. 确定细胞数量
    1. 取 20 µl PBMC 细胞悬液，与 20 µl 台盼蓝混合，使用细胞计数仪计数活细胞数量。
    2. 将细胞悬液在 367 × g 条件下，4 °C 离心 10 分钟，使用刹车。
    3. 完全吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 80 µl 染色缓冲液中，浓度为每 80 µl 含 107 个细胞。
  2. 磁性标记
    1. 每 107 个细胞加入 20 µl CD14 微珠，充分混匀后于 2 - 8 °C 孵育 15 分钟。
    2. 每 107 个细胞加入 1 ml 染色缓冲液洗涤细胞，然后在 367 × g 条件下，4 °C 离心 10 分钟，使用刹车。
    3. 完全吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于染色缓冲液中，浓度为每 50 µl 含 107 个细胞。
  3. 磁性分离
    1. 对于最多 2 × 108 个总细胞，使用中等尺寸的分选柱。
      注意：根据总细胞数量以及数据表中推荐的 CD14+ 细胞数量，选择合适的分选柱和磁性分离器。
    2. 将分选柱置于合适的磁性分离器的磁场中，并用 500 µl 染色缓冲液冲洗分选柱以进行预处理。
    3. 将细胞悬液通过移液器加至分选柱上，用 15 ml 离心管收集未标记的穿柱细胞。
    4. 在分选柱下方更换新的 15 ml 离心管，并用 500 µl 染色缓冲液洗涤分选柱 3 次。每次加洗涤缓冲液前，确保分选柱储液腔已完全排空。
    5. 将分选柱从磁性分离器上取下，放置于一个新的 15 ml 离心管上。
    6. 向分选柱中加入 1 ml 染色缓冲液，立即用套件中提供的推杆用力插入分选柱，将磁性标记的细胞快速洗脱下来。
    7. 使用洗脱所得组分，在新的分选柱上重复步骤 2.3.2 至 2.3.6，以提高 CD14+ 细胞的纯度。注意：在步骤 3.2 的培养过程中，微珠将自动从细胞上解离。

3. 树突状细胞向不同活化状态的分化 

  1. 试剂制备（所有试剂的内毒素水平必须低于 0.1 EU/ml）
    1. 制备细胞培养基：RPMI 1640 培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 非必需氨基酸（NEAA）和 0.05 mM 2-巯基乙醇（2ME）。使用 0.2 µm 滤器过滤该溶液以实现无菌化。
    2. 制备细胞因子：在无菌条件下，分别用细胞培养级水将 IL-4 和 GM-CSF 重悬至浓度为 0.25 mg/ml。将细胞因子分装至 200 µl 微量离心管中，于 -80 °C 保存。
    3. 制备维生素 D3 储存液：在无菌条件下，用细胞培养级水将维生素 D3 重悬至浓度为 100 mM。将维生素 D3 分装至 1.5 ml 微量离心管中，于 -20 °C 保存。
    4. 制备地塞米松储存液：在无菌条件下，用细胞培养级水将地塞米松重悬至浓度为 10 mM。将地塞米松分装至 1.5 ml 微量离心管中，于 -20 °C 保存。
    5. 制备 LPS：在无菌条件下，用细胞培养级水将脂多糖（LPS）重悬至浓度为 1 mg/ml。将 LPS 分装至 1.5 ml 微量离心管中，于 -20 °C 保存。
  2. 生成不同类型的 moDCs
    1. 将四组 CD14+ 单核细胞以 0.3–0.5 × 106/ml 的浓度接种于 6 孔板中，每孔培养基体积为 2 ml，培养基中含 200 ng/ml GM-CSF 和 200 ng/ml IL-4。注意此为第 0 天。
    2. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 的组织培养箱中孵育。
    3. 在第 4 天，从培养物中移除 850 µl 培养基，于 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 1 ml 含有 2 倍浓度（即 200 ng/ml GM-CSF 和 200 ng/ml IL-4）的细胞培养基中，然后将该细胞悬液加回原培养孔中。注意：加入的 2 倍浓度 GM-CSF 和 IL-4 在 1 ml 培养基加回后最终稀释为 1 倍浓度。
    4. 在第 5 天，向其中两组培养物中每毫升培养基加入 1 µl 维生素 D3 储存液和 1 µl 地塞米松储存液，以生成耐受性 moDCs。注意，维生素 D3 的终浓度为 100 nM，地塞米松的终浓度为 10 nM；第 5 天无需添加 GM-CSF 和 IL-4。
    5. 在第 6 天，向所有组别中加入 200 ng/ml GM-CSF 和 200 ng/ml IL-4。
    6. 在第 6 天，向仅用 GM-CSF 和 IL-4 处理的一组中加入 1 µg/ml LPS，以生成成熟 moDCs。
    7. 在第 6 天，向一组耐受性 moDCs 中加入 1 µg/ml LPS，以生成 LPS 耐受性 moDCs。
    8. 在第 7 天，通过 PBS 加 EDTA 冲洗培养皿收集不同类型 moDCs，用于流式细胞术或其他研究。注意仅收集非贴壁细胞。需注意，由 CD14+ 单核细胞生成的未成熟 moDCs、成熟 moDCs、耐受性 moDCs 和 LPS 耐受性 DCs 的得率分别约为 90%、50%、60% 和 60%，且因供血者和 FBS 批次不同而有所差异。

4. 流式细胞术

  1. moDCs 细胞表面标志物表征
    1. 通过移液将细胞从培养皿中脱离。用 PBS/EDTA 洗涤细胞一次，并将细胞重悬于 1.5 ml 微量离心管中，每 50 µl 染色缓冲液含 5 × 105 个细胞。
    2. 将 0.5 × 106 个细胞分装，与以下抗体在 4 °C 避光孵育 30 分钟：PerCP 标记的 HLADR（1:100）、PE 标记的 CD80（1:50）、PE 标记的 CD83（1:25）、PE 标记的 CD86（1:50）、APC 标记的 CD11c（1:50）、PE 标记的 CD14（1:50）、PE 标记的 BDCA3（1:50）以及 APC 标记的 ILT3（1:25）。以同型对照的 PerCP 标记单克隆抗体（MAb，1:20）、PE 标记单克隆抗体（MAb，1:11）和 APC 标记单克隆抗体（MAb，1:11）作为阴性对照。
    3. 使用流式细胞仪检测表面标志物的表达水平18。
  2. moDCs 线粒体膜电位分析
    1. 通过将 94.1 µl 二甲基亚砜（DMSO）加入 50 µg 冻干的红色氯甲基-X-玫瑰胺（Red CMXRos）中，配制 1 mM 的储备液。
    2. 将 2 × 105 个 moDCs 与 100 nM Red CMXRos 在 1 ml Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中于 37 °C 孵育 30 分钟，使用 15 ml 管进行操作。
    3. 向细胞中加入 2 ml PBS/EDTA，室温下以 300 × g 离心 5 分钟，重复两次。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 300 µl 含 2% FCS 的 PBS/EDTA 溶液中，用于流式细胞术分析。注意使用 PE 通道检测 Red CMXRos 信号。
  3. T 细胞标志物表征 
    1. 取 50 µl 含 1.2 × 106 个经 CFSE 标记的同种异体 CD4+ T 细胞（来自步骤 5.6），与 PerCP 标记的 CD3（1:200）、PE/Cy7 标记的 CD4（1:400）以及 APC/Cy7 标记的 CD25（1:100）在 4 °C 避光孵育 30 分钟。使用商业试剂盒对 T 细胞进行染色，加入 Foxp3-Alexa Fluor 647（1:50），室温避光孵育 1 小时。

5. 异体反应研究

  1. 根据制造商说明书，将18 µl DMSO加入冻干的CFSE中，制备5 mM的CFSE储备液。
  2. 从PBMC中纯化CD4+ T细胞
    1. 取20 µl PBMC细胞悬液，与20 µl台盼蓝混合，使用细胞计数仪测定活细胞数量。
    2. 将细胞悬液在4 °C条件下以367 × g离心10分钟，开启刹车。
    3. 完全吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于5 ml聚苯乙烯管中的染色缓冲液中，浓度为每1 ml含5 × 107个细胞。
    4. 按每毫升细胞加入50 µl人CD4+ T细胞富集混合液。充分混匀后于室温（15–25 °C）孵育10分钟。
    5. 涡旋磁性颗粒30秒，按每毫升细胞加入100 µl磁性颗粒。充分混匀后于室温孵育5分钟。
    6. 向细胞悬液中加入染色缓冲液，总体积达2.5 ml。通过轻柔吹打2–3次混匀管内细胞。将管子放入磁架中，孵育5分钟。
    7. 将磁架连同管子翻转，倾倒出悬液（含T细胞）至新的5 ml聚苯乙烯管中。
  3. 测定细胞数量，并将1.2 × 106个CD4+ T细胞与5 µM CFSE在1 ml PBS中于37 °C避光孵育20分钟。
  4. 向细胞中加入相当于初始染色体积5倍的细胞培养基（按步骤3.1.1制备），孵育5分钟。
  5. 在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀重悬于细胞培养基中，浓度为每75 µl含2 × 105个细胞。
  6. 将75 µl含2 × 105个CFSE标记的CD4+ T细胞加入至96孔U型底板中的每孔moDC培养体系中，每孔含75 µl细胞培养基，并分别含有0、2.5 × 103、5 × 103、10 × 103、20 × 103和40 × 103个moDC。在37 °C、5% CO2条件下于组织培养箱中培养6天。
  7. 用移液器将CD4+ T细胞转移至15 ml离心管中，于4 °C以300 × g离心5分钟。收集上清液用于细胞因子分析，将细胞沉淀重悬于2 ml PBS/EDTA中，再次于4 °C以300 × g离心5分钟。

6. 细胞因子分析19

  1. 按照步骤 5.5 所述，收集同种反应研究中的上清液。
  2. 人细胞因子/趋化因子磁珠分析试剂的制备
    1. 为制备单个磁珠小瓶（试剂盒中包含）的抗体偶联磁珠混合瓶，将各抗体磁珠小瓶中的磁珠各取 60 µl 加入混合瓶（试剂盒中包含），并用磁珠稀释液（试剂盒中提供）定容至终体积 3 ml，充分涡旋混匀 1 分钟。
    2. 为制备质控品，将质控品 1 和质控品 2（试剂盒中包含）用 250 µl 去离子水重悬。
    3. 为制备洗涤缓冲液，将 30 ml 的 10 倍浓缩洗涤缓冲液（试剂盒中包含）与 270 ml 去离子水混合稀释。
    4. 为制备人细胞因子标准品，将人细胞因子标准品（试剂盒中包含）用 250 µl 去离子水重悬，得到浓度为 10,000 pg/ml 的溶液。
      1. 在 1.5 ml 微量离心管中，将 50 µl 10,000 pg/ml 人细胞因子标准品加入 200 µl 分析缓冲液（试剂盒中提供）中，配制成 2,000 pg/ml 工作标准品。再取 50 µl 2,000 pg/ml 人细胞因子标准品加入另一管含 200 µl 分析缓冲液的 1.5 ml 微量离心管中，配制成 400 pg/ml 工作标准品。
      2. 取 50 µl 400 pg/ml 人细胞因子标准品加入 200 µl 分析缓冲液中，配制成 80 pg/ml 工作标准品。再取 50 µl 80 pg/ml 人细胞因子标准品加入 200 µl 分析缓冲液中，配制成 16 pg/ml 工作标准品。
      3. 取 50 µl 16 pg/ml 人细胞因子标准品加入 200 µl 分析缓冲液中，配制成 3.2 pg/ml 工作标准品。0 pg/ml 工作标准品仅含 200 µl 分析缓冲液于 1.5 ml 微量离心管中。
  3. 使用移液器将 200 µl 分析缓冲液（试剂盒中提供）加入滤板的每孔中，以预润湿滤板（试剂盒中包含）。密封后将滤板置于平板振荡器上，室温孵育 10 分钟。
  4. 吸除分析缓冲液，向相应孔中加入 25 µl 各标准品或质控品。
  5. 向背景孔、标准品孔和质控孔中各加入 25 µl 细胞培养基（按步骤 3.1.1 制备）。
  6. 向样品孔中加入 25 µl 分析缓冲液，并向相应的样品孔中加入 25 µl 样品。
  7. 涡旋混匀含有抗体偶联磁珠的混合瓶，向每孔加入 25 µl 混合磁珠。密封后于 4 °C 在平板振荡器上振荡孵育过夜。
  8. 吸除液体，每孔加入 200 µl 洗涤缓冲液，吸除液体，重复洗涤 2 次。
  9. 向每孔加入 25 µl 检测抗体（试剂盒中提供）。密封后于平板振荡器上室温振荡孵育 1 小时。
  10. 向含有 25 µl 检测抗体的各孔中加入 25 µl 链霉亲和素-藻红蛋白（Streptavidin-Phycoerythrin，试剂盒中提供）。密封后于平板振荡器上室温振荡孵育 30 分钟。
  11. 吸除液体，按步骤 6.8 所述方法洗涤平板。
  12. 向所有孔中每孔加入 150 µl 鞘液（Sheath Fluid），并在平板振荡器上重悬磁珠 5 分钟。
  13. 使用 3D 系统20检测磁珠的荧光强度。采用五参数对数-逻辑曲线拟合方法分析中位荧光强度数据，以计算样品中细胞因子/趋化因子的浓度21。

7. 实时氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）测定

  1. 试剂/材料的准备
    1. 制备OCR培养基：在检测培养基中添加25 mM葡萄糖和1 mM丙酮酸钠（pH 7.35）。通过0.2 µm滤膜过滤对该溶液进行灭菌。请注意，该培养基不添加胎牛血清（FBS），因为FBS中的成分复杂，且不同批次之间存在差异。
    2. 制备ECAR培养基：在基础培养基中添加2 mM L-谷氨酰胺（pH 7.35）。通过0.2 µm滤膜过滤对该溶液进行灭菌。请注意，该培养基不添加碳酸氢盐、葡萄糖、丙酮酸和FBS。需注意FBS具有缓冲能力，会干扰ECAR读数。
    3. 制备用于OCR检测的化合物：用630 µl OCR培养基重悬寡霉素，配制成100 µM的储存液，并用OCR培养基稀释至16 µM的工作浓度。用720 µl OCR培养基重悬羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP），配制成100 µM的储存液，并用OCR培养基稀释至4.5 µM的工作浓度。用540 µl OCR培养基重悬鱼藤酮/抗霉素A，配制成50 µM的储存液，并用OCR培养基稀释至10 µM的工作浓度。
    4. 制备用于ECAR检测的化合物：用3 ml ECAR培养基重悬葡萄糖，配制成100 mM的储存液，并稀释至80 mM的工作浓度。用720 µl ECAR培养基重悬寡霉素，配制成100 µM的储存液，并稀释至18 µM的工作浓度。用1.5 ml ECAR培养基重悬2-脱氧-D-葡萄糖，配制成1,000 mM的储存液。
    5. 在测量前一天，向每孔检测板中加入200 µl校准剂，并于37 °C、无CO2条件下储存。
  2. 实时OCR检测
    1. 收集moDCs，并将每种类型的moDCs以每150 µl OCR培养基含60 × 103个细胞的浓度重悬于OCR培养基中。
    2. 将60 × 103个细胞/孔接种至多聚-D-赖氨酸包被的96孔平底板中，在37 °C、无CO2培养箱中孵育1小时。注意：使用50 µl浓度为50 ng/ml的多聚-D-赖氨酸对板进行包被，孵育1小时后用无菌水洗涤，并在室温下干燥2小时后使用。
    3. 向所有孔的加样口A中加入25 µl OCR培养基；向所有孔的加样口B中加入含16 µM寡霉素的25 µl OCR培养基；向所有孔的加样口C中加入含4.5 µM FCCP的25 µl OCR培养基；向所有孔的加样口D中加入含10 µM鱼藤酮/抗霉素A的25 µl OCR培养基。注意：寡霉素在孔中的终浓度为2 µM，FCCP为0.5 µM，鱼藤酮/抗霉素A为1 µM。
    4. 将板放入细胞外通量分析仪中，同时对所有moDCs进行完整的OCR检测，分为四个连续阶段：基础呼吸（加样口A加入培养基后）、线粒体复合体V抑制（加样口B加入药物后）、最大呼吸诱导（加样口C加入药物后）和电子传递链抑制（加样口D加入药物后）22。注意：两次加样之间有3个循环，每次测量间隔6分钟。
  3. 实时ECAR检测
    1. 收集moDCs，并将每种类型的moDCs以每150 µl ECAR培养基含60 × 103个细胞的浓度重悬于ECAR培养基中。
    2. 将6 × 104个细胞/孔接种至多聚-D-赖氨酸包被的96孔平底板中，在37 °C、无CO2培养箱中孵育1小时。
    3. 向所有孔的加样口A中加入25 µl ECAR培养基；向所有孔的加样口B中加入含10 mM葡萄糖的25 µl ECAR培养基；向所有孔的加样口C中加入含18 µM寡霉素的25 µl ECAR培养基；向所有孔的加样口D中加入含1,000 mM 2-脱氧-D-葡萄糖的25 µl ECAR培养基。注意：葡萄糖在孔中的终浓度为10 mM，寡霉素为2 µM，2-脱氧-D-葡萄糖为100 mM。
    4. 将板放入细胞外通量分析仪中，同时对所有moDCs进行完整的ECAR检测，分为四个连续阶段：基础呼吸（加样口A加入培养基后）、糖酵解诱导（加样口B加入药物后）、最大糖酵解诱导（加样口C加入药物后）和糖酵解抑制（加样口D加入药物后）22。
    5. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey多重比较事后检验分析统计学差异。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单核细胞纯化与树突状细胞分化

通过外周血密度梯度离心（图1A）从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离单核细胞，随后进行CD14+阳性选择磁分离（图1B），并在含有GM-CSF和IL-4的完全培养基中培养，以获得未成熟树突状细胞（图2A）。在使用GM-CSF和IL-4后添加维生素D3和地塞米松，可诱导未成熟单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）分化为耐受性moDCs（图2B）。加入LPS以诱导未成熟moDCs成熟为成熟moDCs（图2C），并对耐受性moDCs施加LPS刺激，以验证其抵抗成熟的能力（图2D）。本研究所用血液样本均来自已签署知情同意书的健康供体。

moDC 表型鉴定

通过流式细胞术进行表面标志物表征

DC表面标志物分析显示，与LPS处理的耐受性moDC、耐受性moDC以及未成熟moDC相比，成熟moDC表达最高水平的成熟标志物HLA-DR、CD83和CD86（图3）。这些结果表明，在LPS刺激后，耐受性moDC相较于未成熟moDC对成熟具有抵抗性。此外，LPS处理的耐受性moDC和耐受性moDC相较于未成熟和成熟moDC，其CD14、BDCA3（CD141）以及免疫球蛋白样转录物（ILT）3的表达水平升高。本研究中生成的耐受性moDC与既往报道一致23。

moDCs 的功能表征

moDCs 诱导成熟后具有免疫原性，并释放促进 CD4 增殖的细胞因子+ T细胞。我们通过检测共培养T细胞的增殖情况，评估了不同亚型moDC的免疫原性。与成熟moDC相比，耐受性moDC的免疫原性较低，表现为CD4的同种增殖反应较弱+ T细胞（图4A）。耐受性moDC的特点是其低水平的IFN-Γ，低IL-12p40和高IL-10细胞因子产生，在与CD4的同种反应共培养中+ T细胞（图4B）。此外，在成熟 moDCs 的共培养体系中增加耐受性 moDCs 的数量，可诱导同种特异性的 CD4+ T细胞增加了CD25的表达频率高 Foxp3+ 调节性T细胞（图4C).

线粒体活性分析

使用 Red CMXRos 检测线粒体活性，以分析 moDCs 中的线粒体膜电位水平。与其它分化的 moDC 亚型相比，耐受性 moDC 表现出更高的线粒体活性（图 5A）。接下来，利用生物分析仪评估不同 moDC 亚型的线粒体氧消耗率（OCR）。OCR 测定可提供高分辨率的代谢特征信息，包括但不限于基础呼吸、备用呼吸能力、质子泄漏和非线粒体呼吸。OCR 的测量为评估细胞应对压力的能力提供了手段。通过依次添加三种不同的化合物，对细胞代谢进行扰动。第一次注射为寡霉素（ATP 偶联剂），可抑制电子传递链（ETC）的复合物 V，从而抑制 ATP 合成。此步骤可区分用于 ATP 合成的耗氧比例与用于克服线粒体内膜质子泄漏的耗氧比例。第二次注射为 FCCP（ETC 加速剂），其通过将氢离子跨线粒体膜运输（而非经由复合物 V 的质子通道）来破坏 ATP 合成。线粒体膜电位的崩溃导致能量和氧气被迅速消耗，但不生成 ATP。FCCP 处理可用于计算细胞的备用呼吸能力。在应激条件下维持备用呼吸能力对细胞存活至关重要。该能力由多种因素决定，包括底物的可利用性以及参与 ETC 的酶的功能状态。第三次注射为鱼藤酮（复合物 I 抑制剂）与抗霉素 A（复合物 III 抑制剂）的组合。该组合可关闭线粒体呼吸，导致因线粒体功能受损而观察到 OCR 下降（图 5C）。耐受性 moDC 的基础 OCR 水平高于成熟 moDC（图 5D）。此外，耐受性 moDC、LPS 耐受性 moDC 和未成熟 moDC 的备用呼吸能力均高于成熟 moDC（图 5E）。

moDCs 的代谢特征分析

由于乳酸和质子在糖酵解过程中从细胞中释放出来，我们通过实时分析细胞外酸化率（ECAR）来评估moDCs的糖酵解活性（图6B）。在存在葡萄糖的情况下，所有moDCs的糖酵解速率均较基础状态升高，其中成熟moDCs的糖酵解速率高于未成熟moDCs（图6D）。与LPS处理的moDCs相比，耐受性moDCs和未成熟moDCs表现出更高的最大糖酵解水平（在葡萄糖存在下由寡霉素诱导）（图6B）。耐受性moDCs和未成熟moDCs的糖酵解能力高于成熟moDCs（图6E）。与它们较高的糖酵解速率相反，成熟moDCs的糖酵解储备最低（图6F）。

figure-results-1
图 1：外周血中单核细胞的纯化。 (A) 每个 50 ml 离心管中，将 25 ml 血液小心地铺在 15 ml Ficoll 液面上，随后进行离心。密度梯度离心后，外周血单个核细胞（PBMCs）聚集在血浆层下方。 (B) 将 PBMCs 与连接有单克隆人 CD14 抗体（亚型：小鼠 IgG2a）的磁珠共同孵育，然后加载到置于分离器磁场中的层析柱上，以分离 CD14+ 单核细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-2
图2：moDCs的形态学表征。（A） 在第0、4、6天向纯化的CD14+单核细胞中加入200 ng/ml的GM-CSF和IL-4，以生成未成熟moDCs；（B） 在第5天额外加入100 nM维生素D3和10 nM地塞米松进行刺激，以生成耐受性moDCs。在第6天，未成熟moDCs和耐受性moDCs均用1 µg/ml LPS刺激，以分别生成（C）成熟moDCs和（D）LPS耐受性moDCs。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-3
图3：通过流式细胞术进行表面标志物表征。 耐受性（绿色）、LPS耐受性（黑色）、未成熟（红色）、成熟（蓝色）moDCs表面标志物HLA-DR、CD80、CD83、CD86、CD11、CD14、BDCA3和LT3的表达水平。同型对照以灰色显示。每种细胞类型的直方图分别绘制，X轴为荧光强度的对数值，Y轴为细胞数，并进行叠加。所有直方图均代表四次独立实验的结果。 此图已根据以下来源修改 J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049/jimmunol.1303316 (2015年6月1日)。经版权许可复制并再版。 版权所有 2015。美国免疫学家协会，有限公司 请点击此处以查看此图的放大版本。

figure-results-4
图4：moDCs的功能表征。（A） CD4异体增殖频率的定量分析+ 与耐受性（TOL；绿色）、LPS耐受性（L-TOL；黑色）、未成熟（IMM；红色）和成熟（MAT；蓝色）单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）共培养后诱导产生的T细胞。数据来自四项独立实验的合并结果；均值 + 标准误（S.E.M.）。所有moDC组与成熟moDC组之间的统计学差异采用双因素方差分析（two-way ANOVA），并进行Dunnett多重比较检验。 （B） 干扰素-γ细胞因子分析Γ （左图）、IL-12p40（中图）和IL-10（右图）在CD4同种反应上清液中的表达+ 与不同数量的耐受性（绿色）、未成熟（红色）或成熟（蓝色）单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）共培养的T细胞。数据来自六次独立实验；均值 ± 扫描电子显微镜 (C) CD4+ T细胞异体增殖及调节性T细胞扩增受成熟moDCs共培养诱导，并随耐受性moDCs数量增加而变化。左侧Y轴，CD4+ T细胞增殖。右侧Y轴，CD25频率高 Foxp3+ 增殖性CD4细胞门控+ T细胞。数据来自三次独立实验；均值 ± S.E.M. 耐受性moDCs存在与不存在之间的统计学差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Dunnett多重比较检验进行分析。 (D) CD4+ T细胞同种增殖（左）及在成熟moDC数量递增条件下与耐受性moDC共培养诱导的CD25highFoxP3+细胞频率（右）。数据来自2至3次独立实验；均值 ± S.E.M. 成熟 moDCs 存在与缺失之间的统计学差异通过双因素方差分析（two-way ANOVA）结合 Dunnett 多重比较事后检验进行分析。该图已修改自 J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049/jimmunol.1303316 (2015年6月1日)。经版权许可复制和再版。 版权所有 2015。美国免疫学家协会，有限公司 请点击此处查看此图的放大版本。

figure-results-5
图5：moDCs线粒体活性的分析。（A）通过流式细胞术分析获得moDCs中线粒体膜电位（Red CMXRos）水平。数据来自四项独立实验的汇总结果。均值±标准误。（B） 实时线粒体呼吸的示意图。氧耗率（OCR）分析从基础呼吸开始，依次加入寡霉素（复合体V抑制剂）、FCCP（最大呼吸诱导剂）和鱼藤酮/抗霉素A混合物（电子传递链[ETC]抑制剂）后记录变化。线粒体备用呼吸容量（SRC）由最大呼吸减去基础呼吸后的OCR曲线计算得出。（C） 使用依次添加寡霉素（Olig）、FCCP和鱼藤酮/抗霉素A（Rot-AA）的方法，对耐受性（TOL，绿色）、LPS耐受性（L-TOL，黑色）、未成熟（IMM，红色）和成熟（MAT，蓝色）moDCs中线粒体OCR（pmol/min）的代表性动力学研究。（D） moDCs基础呼吸的OCR定量分析，以及（E） moDCs的备用呼吸容量。数据来自五项独立实验的汇总结果。均值±标准误。 该图改编自J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049/jimmunol.1303316 (2015年6月1日)。经版权许可复制和再版。版权所有 2015 美国免疫学家协会 请点击此处查看本图的放大版本。

figure-results-6
图6：moDCs的代谢特征。(A) 实时糖酵解示意图。ECAR分析始于基础ECAR，此时细胞在无葡萄糖培养基中孵育，随后依次加入葡萄糖（诱导糖酵解）、寡霉素（诱导最大糖酵解并抑制复合体V），最后加入2-脱氧-D-葡萄糖（抑制糖酵解）。糖酵解速率（糖酵解诱导值减去基础ECAR）、糖酵解能力（最大糖酵解值减去基础ECAR）和糖酵解储备（最大糖酵解值减去糖酵解诱导值）均由ECAR曲线得出。 (B) 通过依次添加葡萄糖（Gluc）、寡霉素（Olig）和2-脱氧葡萄糖（2-DG），对耐受性（TOL，绿色）、LPS耐受性（L-TOL，黑色）、未成熟（IMM，红色）和成熟（MAT，蓝色）单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）中糖酵解依赖性细胞外酸化率（ECAR，mpH/min）进行代表性动力学研究。 (C) 条形图显示基础 ECAR 水平 （D） 糖酵解速率 (E) 糖酵解能力，以及 (F) moDCs的糖酵解储备能力。数据来自三次独立实验；均值±标准误。统计学差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey多重比较检验进行分析。 此图已根据原图修改 J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10.4049/jimmunol.1303316 (2015年6月1日)。经版权许可复制并再版。 版权所有 2015。美国免疫学家协会，有限公司 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种从单核细胞体外生成未成熟moDCs、耐受性moDCs和成熟moDCs的方法。以下段落将详细讨论本方案中的关键步骤。需要注意的是，本方案以人外周血作为起始材料，操作时应遵循处理人源血液的通用安全规范。尽管从技术上讲，也可从人类骨髓中获取树突状细胞24，但由于外周血比骨髓更容易获得，因此更倾向于使用外周血中的细胞进行体外树突状细胞分化。在外周血所含的各类细胞中，造血CD34+干细胞和单核细胞常用于体外生成树突状细胞。造血CD34+干细胞在GM-CSF和TNF-α的培养条件下，可分化为CD1a+和CD14+亚群，随后进一步分化为类似朗格汉斯细胞和树突状细胞。相反，单核细胞则在GM-CSF和IL-4的培养条件下生成未成熟的moDCs。目前有多种方法可用于从外周血中富集单核细胞，例如通过贴壁法、离心淘析法以及商品化分离试剂盒25, 26。贴壁法的优点是对细胞损伤最小且相对经济，但可能影响细胞纯度，并且需要额外步骤将细胞从培养皿上解离下来以用于后续实验。离心淘析法是一种根据细胞大小和密度进行分离的技术，其优势在于细胞活力高，且分离后的单核细胞可直接用于后续实验；但该技术受限于离心淘析仪的可及性，并且无法有效分离沉降参数相似的不同细胞群体（如T细胞和单核细胞）。市面上的分离试剂盒通常利用磁性微珠对单核细胞群进行正向选择或负向选择。某些方案更倾向于采用负向选择法进行单核细胞分离，因为所获得的单核细胞保持“未接触”状态（即未与标记物或微珠结合）。在本方案中，使用CD14磁珠对人外周血单个核细胞（PBMCs）中的单核细胞进行正向选择。CD14缺乏胞内结构域，抗体与CD14结合不会触发信号转导。此外，磁珠在培养后会从单核细胞上脱落，因此不会干扰后续的分化过程。同时，CD14在大多数单核细胞上高表达，在中性粒细胞和部分髓系树突状细胞上弱表达，因此该分离方法所获得的细胞纯度高于其他方法17。

血液单核细胞可分化为树突状细胞（DCs）或巨噬细胞，而单核细胞的分化命运在很大程度上取决于细胞因子环境。本文通过向人外周血单核细胞添加粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素4（IL-4）来生成moDCs。GM-CSF是单核细胞存活所必需的，而IL-4对巨噬细胞分化具有抑制作用；联合使用GM-CSF和IL-4相比单独使用任一种细胞因子，可获得更高比例的未成熟moDCs27。此外，也有其他方案通过向外周血单核细胞添加肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素α（IFN-α）和白细胞介素13（IL-13）来生成moDCs28,29,30。GM-CSF与IL-4的组合在20世纪90年代得到优化，现已成为一种公认的标准方案，可用于生成可塑性的未成熟DCs，这些DCs可进一步分化为免疫原性或耐受性moDCs，并极化为促进Th1、Th2或Th17反应的moDCs。

通过添加维生素D3和地塞米松，可将未成熟moDCs分化为耐受性moDCs。目前已有多种生成耐受性DC的方法，例如通过抑制核因子-κB（NF-κB）、激活β-连环蛋白、使用维生素D3、地塞米松和雷帕霉素31,32,33,34,35,9,36,37。尽管已有报道显示单独使用维生素D3或地塞米松均可在DC上诱导耐受效应，但联合使用维生素D3和地塞米松对同种异体增殖的抑制作用强于单独用药。因此，现有的耐受性DC制备方案被优化为联合使用维生素D3和地塞米松。该方法目前已被广泛接受为具有治疗潜力的人源耐受性DC模型。还需注意的是，配制后的维生素D3和地塞米松保存期限较短。

在本方案中，添加脂多糖（LPS）作为树突状细胞（DC）成熟的诱导剂。未成熟 moDCs 也可通过促炎性因子混合物（肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）和前列腺素E2）或促炎性细胞因子（TNF-α 和干扰素γ（IFN-Γ））诱导其成熟。促炎性因子混合物可诱导生成具有较强共刺激和迁移功能的成熟 moDCs，但其产生的 IL-12 水平相对较低38。单独使用 TNF-α 或 IFN-Γ 无法诱导出稳定的树突状细胞表型39。LPS 通过刺激 Toll 样受体 4（TLR4），介导 NF-kB 和丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的活化，从而诱导 DC 成熟。由 LPS 诱导的 DC 成熟表现为 DC 成熟标志物（CD83、CD86、HLA-DR）的上调，并促进 IL-12p70 的产生。此外，该步骤还可进一步优化，将 LPS 与 TLR3 激动剂联用，以生成适用于临床癌症疫苗的成熟 DCs。本文显示，耐受性 DCs 在 LPS 处理后对成熟具有抵抗性。这类类似半成熟状态的 DCs 不具有免疫原性，且不释放促炎性细胞因子40。

该方案的局限性在于分化过程。从第0天到第7天共需8天时间，难以适用于高通量分析。需要对该方案进行改进，以缩短分化周期，同时获得大量处于不同状态的活细胞。其次，本方案通过添加细胞因子诱导树突状细胞生成，而这些细胞因子无法长期维持树突状细胞群体。此外，所用细胞因子的浓度远高于 在体内 并可能导致通路的偏倚性发育，这些通路在生理上并不完全等同于 体内 DCs。例如 体外 DC前体的培养物已被证实可对GM-CSF产生反应，但GM-CSF并非正常DC分化所必需的细胞因子 在体内41然而，细胞因子刺激可能是生成大量树突状细胞的一种有效方法 体外 用于实验。利用本方案所获得的细胞可进一步进行免疫荧光染色、流式细胞术、同种反应研究及代谢研究等多种分析，从而提升了该方法的实用性。这些 体外 DCs 可作为研究 DC 发育、成熟及抗原提呈的良好模型，此前由于 DC 数量稀少，相关研究难以开展 在体内 DCs

树突状细胞（DCs）在调节免疫应答与免疫耐受之间的平衡方面具有独特能力，使其成为治疗癌症和自身免疫性疾病极具前景的候选手段42,43,44,45。本方案中生成的免疫原性DC可用于提高针对感染性疾病和肿瘤的疫苗疗效；而耐受性DC则可用于控制异常的T细胞应答，并预防移植后的排斥反应。免疫与耐受之间的精细平衡在很大程度上取决于DC的分化状态。DC的分化是一个受多种信号通路和代谢命运共同调控的协调性细胞程序。不同分化状态的DC在生物能量和生物合成需求方面存在差异；例如，与静息状态的DC相比，活化的DC需要更强的能量代谢适应能力，以支持其存活和迁移。值得注意的是，已知可诱导耐受性DC的维生素D3、地塞米松和雷帕霉素也被报道能够影响DC的代谢。本文利用细胞外通量分析仪对不同分化状态的moDCs的能量代谢进行了表征，结果显示耐受性moDCs具有最高的代谢可塑性，而LPS诱导的成熟过程会降低这种可塑性。合成代谢支持DC的成熟过程，而分解代谢则影响耐受性DC的功能46。本方案生成的DC可用于评估调控DC代谢状态是否是调节免疫与耐受治疗效果的关键。综上所述，我们提供了一种用于生成未成熟、耐受性和成熟moDCs的实验方案，这对于研究DC的免疫调节功能至关重要。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文的开放获取费用由安捷伦科技公司提供。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由科学技术研究局核心资助（资助编号：J.E.C）支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
FicollGE Healthcare17-1440-03PBMC 分离
注射器Becton, Dickinson302832PBMC 分离
1.5 ml 离心管AxygenMCT-150-CPBMC 分离
15 ml Falcon 管Falcon352096PBMC 分离
50 ml Falcon 管Falcon352070PBMC 分离
离心机Eppendorf5810RPBMC 分离
0.2 µm 滤膜Sartorius stedim biotech17597PBMC 分离
MACs 试剂盒Miltenyi biotec130-042-201单核细胞富集
MiniMACS 分离器Miltenyi biotec130-042-102单核细胞富集
细胞培养级水Invitrogen, Life Technologies细胞培养
RPMIGibco, Life Technologies11875-093细胞培养
FBSHycloneSH30070103细胞培养
青霉素-链霉素Gibco, Life Technologies15140细胞培养
磷酸盐
缓冲液		Gibco, Life Technologies10010-031细胞培养
NEAAGibco, Life Technologies11140-040细胞培养
EDTAGibco, Life Technologies15575细胞培养
HEPESGibco, Life Technologies15630-080细胞培养
丙酮酸钠Gibco, Life Technologies11360-070细胞培养
GM-CSFMiltenyi biotec130-093-868细胞培养
IL-4Miltenyi biotec130-093-924细胞培养
维生素 D3SigmaD1530细胞培养
地塞米松SigmaD2915细胞培养
LPSSigmal2755细胞培养
台盼蓝Gibco, Life Technologies15250-061细胞培养
PerCP 标记的 HLADR BioLegend307628流式细胞术
PE 标记的 CD80BD Biosciences557227流式细胞术
PE 标记的 CD83 BD Biosciences556855流式细胞术
PE 标记的 CD86 BD Biosciences555665流式细胞术
APC 标记的 CD11cBD Biosciences340544流式细胞术
PE 标记的 CD14 Miltenyi biotec130-091-242流式细胞术
PE 标记的 BDCA3 Miltenyi biotec130-090-514流式细胞术
APC 标记的 ILT3 eBioscience12-5139-73流式细胞术
同型对照
PerCP 标记的单克隆抗体		BioLegend400250流式细胞术
同型对照
PE 标记的单克隆抗体		Miltenyi biotec130-091-835流式细胞术
同型对照
APC 标记的单克隆抗体		Miltenyi biotec130-091-836流式细胞术
BD LSR II 流式细胞仪BD PharmingenBD LSR II 流式细胞术
cytofix/cytopermBD Biosciences554714流式细胞术
APC/CY7 标记的 CD25BD pharmingen557753流式细胞术
PE/CY7 标记的 CD4Biolegend300512流式细胞术
PerCP 标记的 CD3Biolegend300428流式细胞术
EasySep 人 CD4+ T 细胞富集试剂盒STEMCELL Technologies19052同种反应研究
EasySep 磁力架 STEMCELL Technologies18000同种反应研究
Cell Trace CFSE 细胞增殖试剂盒Molecular probesC34554同种反应研究
HBSSGibco, Life Technologies14025092同种反应研究
Alexa Fluor 647 标记的 FoxP3BD Biosciences560889
Milliplex MAP 人
细胞因子/趋化因子
磁珠检测面板		MilliporeHCYTOMAG-60K细胞因子分析
5 ml 聚苯乙烯管Falcon352058细胞因子分析
Luminex 鞘液 MilliporeSHEATHFLUID细胞因子分析
FLEXMAP 3D 系统配 xPONENT 软件Luminex CorporationFLEXMAP 3D细胞因子分析
MitoTracker Red CMXRosCell Signalling9082线粒体活性
DMSOSigma AldrichD2650线粒体活性
XF 检测缓冲液（OCR）Seahorse Bioscience102352-000代谢适应
葡萄糖 Sigma AldrichG8769代谢适应
XF 基础缓冲液（ECAR）Seahorse Bioscience102353-100代谢适应
L-谷氨酰胺Gibco, Life Technologies25030-081代谢适应
校准液Seahorse Bioscience100840-000 代谢适应
XF 线粒体应激检测试剂盒Seahorse Bioscience103015-100代谢适应
XF 糖酵解应激检测试剂盒Seahorse Bioscience103020-100代谢适应
Seahorse Seahorse BioscienceXFe96代谢适应

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jolles, S. Paul Langerhans. J Clin Pathol. 55 (4), 243-24 (2002).
  2. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  3. Steinman, R. M., Swanson, J. The endocytic activity of dendritic cells. J Exp Med. 182 (2), 283-288 (1995).
  4. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  5. Mueller, D. L. Mechanisms maintaining peripheral tolerance. Nat Immunol. 11 (1), 21-27 (2010).
  6. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  7. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  8. Paavonen, J., Lehtinen, M. Interactions between human papillomavirus and other sexually transmitted agents in the etiology of cervical cancer. Curr Opin Infect Dis. 12 (1), 67-71 (1999).
  9. Ohtani, M., et al. Mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 differentially regulate lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production in dendritic cells. Blood. 112 (3), 635-643 (2008).
  10. Wilde, B., et al. Dendritic cells in renal biopsies of patients with ANCA-associated vasculitis. Nephrol Dial Transplant. 24 (7), 2151-2156 (2009).
  11. Al-Hello, H., et al. An enterovirus strain isolated from diabetic child belongs to a genetic subcluster of echovirus 11, but is also neutralised with monotypic antisera to coxsackievirus A9. J Gen Virol. 89, 1949-1959 (2008).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), 74-80 (2010).
  13. Osugi, Y., Vuckovic, S., Hart, D. N. Myeloid blood CD11c(+) dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes. Blood. 100 (8), 2858-2866 (2002).
  14. Reynolds, G., Haniffa, M. Human and Mouse Mononuclear Phagocyte Networks: A Tale of Two Species. Front Immunol. 6, (2015).
  15. Jefford, M., et al. Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli. Blood. 102 (5), 1753-1763 (2003).
  16. Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags. J Vis Exp. (91), (2014).
  17. Zhou, L., et al. Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies. Clin Vaccine Immunol. 19 (7), 1065-1074 (2012).
  18. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  19. Faresjo, M. A useful guide for analysis of immune markers by fluorochrome (Luminex) technique. Methods Mol Biol. 1172, 87-96 (2014).
  20. Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. J Vis Exp. (65), (2012).
  21. Defawe, O. D., et al. Optimization and qualification of a multiplex bead array to assess cytokine and chemokine production by vaccine-specific cells. J Immunol Methods. 382 (1-2), 117-128 (2012).
  22. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), (2010).
  23. Chunharas, A., Pabunruang, W., Hongeng, S. Congenital self-healing Langerhans cell histiocytosis with pulmonary involvement: spontaneous regression. J Med Assoc Thai. 85, 1309-1313 (2002).
  24. Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. Int J Oncol. 20 (2), 247-253 (2002).
  25. Felzmann, T., et al. Monocyte enrichment from leukapharesis products for the generation of DCs by plastic adherence, or by positive or negative selection. Cytotherapy. 5 (5), 391-398 (2003).
  26. Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra) for clinical-scale generation of dendritic cells. J Immunol Methods. 298 (1-2), 1-2 (2005).
  27. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  28. Pace, S. T., Gelman, B. B., Wong, B. R. Primary Langerhans cell histiocytosis of the lacrimal gland in an adult. Can J Ophthalmol. 50 (3), 40-43 (2015).
  29. Ravanfar, P., Wallace, J. S., Pace, N. C. Diaper dermatitis: a review and update. Curr Opin Pediatr. 24 (4), 472-479 (2012).
  30. Gebhardt, C., et al. A case of cutaneous Rosai-Dorfman disease refractory to imatinib therapy. Arch Dermatol. 145 (5), 571-574 (2009).
  31. Vazquez, P., Robles, A. M., de Pablo, F., Hernandez-Sanchez, C. Non-neural tyrosine hydroxylase, via modulation of endocrine pancreatic precursors, is required for normal development of beta cells in the mouse pancreas. Diabetologia. 57 (11), 2339-2347 (2014).
  32. Pellacani, G., et al. Distinct melanoma types based on reflectance confocal microscopy. Exp Dermatol. 23 (6), 414-418 (2014).
  33. Shi, Y., et al. Hepatic involvement of Langerhans cell histiocytosis in children--imaging findings of computed tomography, magnetic resonance imaging and magnetic resonance cholangiopancreatography. Pediatr Radiol. 44 (6), 713-718 (2014).
  34. Haustein, M., Terai, N., Pablik, J., Pillunat, L. E., Sommer, F. Therapy-resistant swelling of the upper eyelid in childhood. Ophthalmologe. 111 (1), 53-57 (2014).
  35. Haidinger, M., et al. A versatile role of mammalian target of rapamycin in human dendritic cell function and differentiation. J Immunol. 185 (7), 3919-3931 (2010).
  36. Macedo, C., Turquist, H., Metes, D., Thomson, A. W. Immunoregulatory properties of rapamycin-conditioned monocyte-derived dendritic cells and their role in transplantation. Transplant Res. 1 (1), 16(2012).
  37. Fischer, R., Turnquist, H. R., Taner, T., Thomson, A. W. Use of rapamycin in the induction of tolerogenic dendritic cells. Handb Exp Pharmacol. 188 (188), 215-232 (2009).
  38. Nicolette, C. A., et al. Dendritic cells for active immunotherapy: optimizing design and manufacture in order to develop commercially and clinically viable products. Vaccine. 25, 47-60 (2007).
  39. Han, T. H., et al. Evaluation of 3 clinical dendritic cell maturation protocols containing lipopolysaccharide and interferon-gamma. J Immunother. 32 (4), 399-407 (2009).
  40. Paananen, A., et al. Molecular and biological analysis of echovirus 9 strain isolated from a diabetic child. J Med Virol. 69 (4), 529-537 (2003).
  41. HC, O. N., Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  42. Mest, H. J., et al. Glucose-induced insulin secretion is potentiated by a new imidazoline compound. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 364 (1), 47-52 (2001).
  43. Puc, J., et al. Mitochondrial activity after cold preservation of pancreatic islet cells treated with pefloxacin (PFX). Ann Transplant. 3 (1), 38-41 (1998).
  44. Alarcon, C., Serna, J., Perez-Villamil, B., de Pablo, F. Synthesis and differentially regulated processing of proinsulin in developing chick pancreas, liver and neuroretina. FEBS Letters. 436 (3), 361-366 (1998).
  45. Jekunen, A. P., Kairemo, K. J., Paavonen, T. Imaging of Hand-Schuller-Christian syndrome by a monoclonal antibody. Clin Nucl Med. 22 (11), 771-774 (1997).
  46. Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nat Rev Immunol. 15 (1), 18-29 (2015).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章