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三维水凝胶中的FRET成像

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DOI：

10.3791/54135

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2016年8月1日

 ,  , 
1Department of Oral Biology, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Bioengineering, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 3Laerdal AS

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

荧光共振能量转移（FRET）成像是一种用于实时细胞生物学研究的有力工具。本文介绍了一种利用常规落射荧光显微镜在生理性的三维（3D）水凝胶微环境中进行FRET成像细胞的方法。同时描述了一种针对比率型FRET探针的分析方法，该方法在激活范围内可产生线性比率结果。

摘要

Förster共振能量转移（FRET） 成像是一种用于实时研究细胞生物学的有力工具。目前利用FRET的研究通常采用二维（2D）培养体系，但该体系无法模拟真实的三维（3D）细胞微环境。本文介绍了一种在3D水凝胶环境中，利用常规宽场落射荧光显微镜进行淬灭发射FRET成像的方法。文中描述了一种针对比率型FRET探针的分析方法，可在探针激活范围内获得线性比率结果。以软骨细胞为例，在佛司可林刺激下，使用EPAC1激活探针（ICUE1）检测细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平的变化，并展示了该方法能够检测因水凝胶材料类型不同而导致的cAMP信号差异，所用水凝胶包括光交联水凝胶（PC-gel，聚乙二醇二甲基丙烯酸酯）和温敏性水凝胶（TR-gel）。与传统的2D FRET方法相比，本方法无需额外复杂的操作。已具备2D FRET成像能力的实验室可轻松采用该技术，开展在3D微环境中的细胞研究。该方法还可进一步应用于工程化3D微组织的高通量药物筛选。此外，该方法兼容其他形式的FRET成像技术，如各向异性测量和荧光寿命成像（FLIM），并适用于共聚焦、脉冲或调制照明等先进显微镜平台。

引言

细胞信号转导在药理学、组织工程和再生医学等多个领域中既复杂又具有重要意义。为了加深对细胞生物学的理解，并开发用于组织再生的优化材料，需要有效的研究工具。 Förster 共振能量转移（FRET）成像是一种关键工具，可实现对受体激活、分子构象及超分子相互作用的分析。例如，活细胞中蛋白质/DNA 复合物的形成）中的应用。FRET 是一种发生在荧光基团之间的非辐射能量转移1其效率与供体荧光团和受体荧光团之间距离的六次方成反比。因此，它可提供在纳米尺度（通常为1 - 10 nm）上两种不同分子之间或同一分子不同区域之间的空间距离信息。2供体和受体荧光基团可以是不同类型的分子（异源FRET），其中供体具有较高能量的发射（较短波长），也可以是相同类型的分子（同源FRET）。FRET成像可在固定细胞或活细胞中进行，但通常在缺乏高速共聚焦系统时，使用固定细胞以高空间分辨率成像分子相互作用。活细胞则用于研究那些因固定处理而受到抑制或改变的相互作用和生物学过程，例如细胞内实时信号转导响应。3.

采用FRET成像的活细胞研究部分由于二维（2D）细胞培养具有操作简便和背景信号较低（无来自焦平面外细胞的发射光）的优点而广泛使用。然而，与生理微环境和三维（3D）培养相比，2D培养会显著改变多种细胞过程4,5。例如，在2D培养中，细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的天然相互作用发生显著改变，导致细胞形态和极性出现明显变化6。膜微区（例如，小窝和脂筏）及受体信号传导受到培养环境的强烈调控，部分原因是这些结构可与细胞骨架组分结合7,8，而细胞形态和细胞骨架结构又受到空间培养环境的显著调控9。机械转导不仅受3D基质的影响，还受到3D环境中比2D培养更复杂的次级载荷条件的影响10。最后，一般而言，3D基质的通透性低于培养基，与2D培养相比，信号分子的扩散减少且结合增加。通过3D培养，可以构建并观察到在黏附性、化学性和机械性信号方面更接近生理状态的微环境。细胞间的相互作用得以促进，而黏附特性则可通过3D材料的结构、组成和构型（图案化）加以控制11-13。材料的力学特性同样可通过其组成和结构进行定制14,15。因此，在水凝胶中培养细胞使得对原代细胞进行FRET研究成为可能，否则这些细胞在传统技术下会发生去分化或表型改变，例如关节软骨来源的细胞。因此，亟需一种能够在活体3D培养中开展FRET检测的方法。

水凝胶支架是进行基于三维FRET研究的理想材料，因为它们可以制成光学透明的，并且能够定制以调控微环境并提供细胞信号。由天然聚合物制成的水凝胶已被用于细胞培养数十年，包括明胶和纤维蛋白16。通过对这些聚合物进行化学修饰或使用合成聚合物，可实现对细胞微环境更精确的调控17,18。通过改变水凝胶的聚合物组成和网络孔径（聚合物浓度和交联密度），可以调控其机械刚度和通透性19,20。此外，通过引入生长因子和细胞配体，可使水凝胶具备生物活性。由于这些优势，开发用于生物传感、药物递送和组织工程的水凝胶已成为一个非常活跃的研究领域21。水凝胶的三维打印技术也正在发展，用于构建微组织和微器官15。因此，在水凝胶中进行细胞的FRET成像不仅有助于模拟生理条件下的细胞行为，还可作为研究和优化工程化组织生长的有力工具。

二元比率FRET探针在研究细胞信号传导方面非常有用，也可应用于水凝胶培养。有关已发表的荧光和FRET探针的部分列表，请参见细胞迁移联盟网站22。最常见的探针类型包含两个不同的荧光团，它们通过一个或多个识别元件（即对分析物敏感的区域）相连或关联。当检测到分析物时（例如，离子或分子的结合、该区域的酶切作用），这些区域会发生构象变化、结合或解离，从而改变荧光团之间的距离，进而改变FRET强度（增强或减弱）23。另一种较少见但同样有用的探针类型依赖于分析物引起两个荧光团光谱重叠的变化，从而改变FRET强度。"单链"比率探针是在单个分子上连接一对荧光团。"双链"探针则将荧光团对分别置于不同的分子上，但它们的表达可由同一表达盒共同调控24。与单荧光团表达研究（例如，荧光融合蛋白）不同，使用比率FRET探针的研究无需进行共转染以校正转染效率或细胞活力。只要表达水平超过最低阈值，比率FRET探针对转染效率相对不敏感（浓度不敏感）23,25。只要两个荧光团对环境变化的响应相似，它们对激发光源波动及其他细胞内环境因素（例如，pH、离子）也不敏感。此外，其响应不受转录延迟的影响，这一点不同于荧光和生物发光启动子-报告基因构建体26,27。

比率型FRET探针在常规的宽场落射荧光显微镜系统中易于且频繁地使用。在活细胞成像中，宽场显微镜相较于线扫描共聚焦系统更受青睐，原因在于系统成本、荧光团漂白以及能否以足够的时间分辨率捕捉信号变化。此外，结合电动载物台和多视野图像采集，可在大量细胞中实现单细胞分析。宽场显微镜需要基于强度对异源FRET探针信号进行分析。尽管强度分析不像其他FRET方法那样需要复杂的硬件设备，但在数据采集后需进行更多校正工作，以消除荧光团行为及显微镜/成像系统配置所带来的影响。28荧光团捕获的发射光强度是激发能量、荧光团量子产率以及滤光片与相机/探测器光谱灵敏度和线性的函数。2这些参数在供体和受体之间可能不同，因此定量分析需要进行校准。此外，受体发射的成像会受到荧光团光谱重叠的影响（供体激发光对受体的激发，以及供体发射信号渗漏至受体发射光谱中）。2. "单链" 探针在纳米尺度上因其荧光基团为等摩尔浓度而进行内部归一化，而其他荧光基团的 "双链" 探针在细胞内的不同区域可能以不同的化学计量比存在25,28. 如果荧光染料的 "单链" 探针的亮度相似（消光系数和量子产率的函数），非线性探测器灵敏度的影响较小，只需校正背景荧光以及耦合的量子产率与探测器灵敏度即可23因此 "单链" 比例型FRET探针在宽场显微镜中最为容易实现24.

本文介绍了一种使用常规宽场落射荧光显微镜对三维水凝胶培养中的活细胞进行FRET成像的简便技术。该方法可被已在二维条件下开展FRET实验的实验室，以及关注微组织中细胞间信号传导的研究团队轻松采用。本文以光交联水凝胶（PC-gel，聚乙二醇二甲基丙烯酸酯）和温敏性水凝胶（TR-gel，Matrigel）中活软骨细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平的FRET成像检测为例，展示了该方法的应用。实验采用基于EPAC1（ICUE1）的比率型FRET探针，检测在佛司可林（forskolin）刺激下cAMP水平的变化；佛司可林是一种腺苷酸环化酶的化学激动剂，可催化ATP转化为cAMP。cAMP是介导G蛋白偶联受体信号通路的主要第二信使之一，能够激活多种因子，包括由cAMP直接激活的下游交换蛋白（EPACs）。当cAMP结合至EPAC结构域时，荧光团之间的距离增大，导致FRET效率下降。本文详细描述了水凝胶材料的制备、使用ICUE1探针转染细胞，以及将细胞包埋于三维水凝胶中的过程。同时阐述了三维FRET实验的操作流程及用于评估单个细胞探针活性所需的图像分析方法。我们还讨论了利用宽场显微镜在二维和三维条件下进行FRET分析所固有的局限性。本文所述技术相较于现有的二维方法具有改进意义，因其可在更接近生理状态的环境中进行分析，且所需的图像校正与标定步骤更少。该方法具有广泛适用性，多种透明材料均可使用，同时可保持特定的细胞类型与转染偏好。

方案

1. 材料准备

  1. 根据 Lin-Gibson 描述的方法，通过甲基丙烯酸酯化聚乙二醇制备聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDM，4,000 mw） 等.29或者，可直接购买 PEGDM。
  2. 按照Majima等人的方法，通过两步法合成光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰次膦酸锂（LAP）：首先，二甲基苯基亚磷酸酯与2,4,6-三甲基苯甲酰氯通过Michaelis-Arbuzov反应生成中间产物，随后在甲基乙基酮中加入溴化锂生成相应的锂盐。30.
    注意：也可购买其他光引发剂，但 LAP 具有更优的生物相容性和交联效率31.
  3. 对玻璃盖玻片进行功能化处理，以实现水凝胶与玻璃之间的键合，从而防止成像过程中发生位移。
    1. 在配备适当个人防护装备的化学通风橱中，根据制造商方案，使用 3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯制备 PC 凝胶，使用环氧硅烷（3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷）制备 TR 凝胶31注意：也可购买预包被的载玻片。请注意，在步骤3.8中，盖玻片必须大于PDMS培养皿的孔径。

2. 细胞转染

  1. 在组织培养罩内，采用无菌技术将所需细胞解冻并以亚汇合度（50%）接种培养。 - 70%），此处为每平方厘米15,000个细胞的牛软骨细胞2 在6孔未经处理的培养皿中。注意：可使用任何相关细胞类型，包括非贴壁依赖性细胞。
    1. 在37 °C培养箱中孵育一天，使细胞恢复。在进行后续步骤前，移除培养基，用PBS洗涤，每孔加入2 ml不含酚红和血清的培养基。
  2. 次日，向每个孔中加入100 µl不含酚红和血清的培养基以及3 µl转染试剂至已灭菌的玻璃试管中。轻轻振荡试管以混匀，室温孵育5分钟，避免光照。
  3. 加入1 µg FRET探针DNA，轻轻振荡。将混合物在室温避光条件下孵育30分钟。
    注意：本实验中使用的 ICUE1 质粒（由 Jin Zhang 博士惠赠）33使用了ICUE1中的荧光团，即青色荧光蛋白（CFP，供体）和黄色荧光蛋白（YFP，受体）。转染试剂与质粒DNA的比例需根据不同的细胞类型进行调整，以实现最佳转染效果。
  4. 将制备好的混合液（约104 µl）逐滴加入含细胞和2 ml无酚、无血清培养基的6个孔中。不要反复吹打。轻轻摇晃培养板以混匀。
  5. 37 °C 培养 48 小时。注意：细胞汇合度过高会抑制转染效率，并改变受体的内源性表达。

3. 用于水凝胶成型与培养的PDMS模具制备

  1. 准备用于浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）的大尺寸玻璃载片时，先用肥皂清洗玻璃，用大量水冲洗，再用异丙醇干燥后用空气吹干。
    1. 按照制造商说明书，使用硅化试剂处理玻璃表面，以便在PDMS固化后能够轻松剥离。在收集容器上方用甲苯冲洗表面以去除残留试剂。让表面在室温下完全自然晾干，或在100 °C下加热以缩短等待时间。
  2. 选择水凝胶高度（例如，1 mm）并根据玻片尺寸和水凝胶高度计算覆盖该厚度PDMS所需的PDMS体积的1.2倍。注意：PDMS不会收缩。
    1. 将PDMS试剂盒组分按10:1的重量比在烧杯中混合。充分混合后，将烧杯置于常压真空环境中脱气。若气泡开始溢出容器，则释放真空，重复脱气过程。
      注意：也可使用其他厚度的水凝胶，但若不进行离心（步骤6.2），则可能导致背景信号增强和透明度降低。
  3. 用铝箔包裹玻璃片的底部和四周，以容纳PDMS。小心地将所需量的脱气PDMS倒入被铝箔围住的玻璃片上。测量PDMS的高度，需注意PDMS的高度即为水凝胶的最大高度。若倾倒过程中产生气泡，应再次脱气，或用刮刀或针头刺破气泡。
  4. 将未固化的PDMS置于水平表面，在100 °C的烘箱中加热2小时，或在室温下放置24小时。
  5. 待PDMS固化后，小心地将其从表面取下。打孔制备所需形状（例如，用于水凝胶的3 mm圆柱形冲头）
    注意：由于PDMS中的分子氧会淬灭反应，光交联得到的PC凝胶圆柱体直径会略小于模具直径。
  6. 对打孔的PDMS进行灭菌。对于短期实验，将PDMS浸入70%乙醇中1小时。
  7. 将灭菌后的PDMS基底与匹配显微镜物镜校正厚度的无菌玻璃盖玻片组装成模具，备用，用于步骤6。
  8. 使用上述方法制备一个更大的PDMS培养皿（其孔径和高度均大于水凝胶），用于容纳水凝胶和培养基。培养基体积应至少为水凝胶体积的10倍，以完全浸没水凝胶并尽量减少分析物的稀释。

4. 水凝胶前体溶液的制备

  1. 在组织培养罩内，使用无菌技术，在接种细胞前立即配制适合本研究的水凝胶前体溶液。按以下步骤由聚合物前体制备 PC-gel。
    1. 将 PEGDM 粉末加入磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）中，配制成 10%（w/v）的溶液。
    2. 加入光引发剂（例如，LAP），终浓度为 0.005 - 0.01%（w/v），用移液器混匀。用铝箔包裹溶液或避光保存，因为 LAP 对光敏感。
      注意：本实验中使用的 TR-gel 为厂家提供的低生长因子含量的细胞外基质。

5. 水凝胶溶液中的细胞悬浮

  1. 在组织培养超净台中，采用无菌技术，吸去孔板中的培养基。
  2. 向孔板中加入 PBS，随后去除，以充分清洗贴壁的细胞单层。
  3. 使用每 25 cm2 加 2 至 3 ml 的细胞解离溶液将细胞从培养基质上解离。轻轻摇晃，然后在 37 °C 下孵育 10 至 20 分钟，或直至细胞完全解离。必要时可轻敲培养皿以帮助细胞脱落。
    注意：可选用其他细胞解离溶液，但应限于那些不会通过切割目标受体而影响待分析信号通路的溶液。
  4. 细胞解离后，加入 2 ml 无酚、无血清的培养基，重悬细胞，并使用血细胞计数板进行细胞计数。注意：也可使用化学成分明确的无血清培养基（例如，添加胰岛素、转铁蛋白和硒的培养基）。
  5. 根据细胞类型，将所需数量的细胞分装至无菌小管中并离心成细胞沉淀（例如，每管 2.0 × 106 个细胞）。
  6. 去除上清液，加入所需体积的水凝胶前体溶液，并通过移液重悬细胞。前体溶液的体积应确保在将水凝胶的 z 轴视为压缩状态时，其 xy 平面上的细胞密度为 2 × 105 个细胞/cm2（例如，对于含有 2 × 106 个细胞/ml、厚度为 1 mm 的水凝胶，每管加入 1.0 ml）。操作时注意避免产生气泡。
    1. 迅速进入下一步操作，以尽量减少对细胞活力的不利影响34。

6. 水凝胶制备

  1. 在组织培养罩内，采用无菌技术，将含有细胞的水凝胶前体加入第3步中制备好的铸造模具中（例如，每个直径3 mm、高1 mm的模具使用7.1 µl。按照上述相同方法制备一个额外的水凝胶，用于显微镜成像系统校准以及探针校准（如果探针的固有效率未知）。
  2. 在凝胶化/交联前，将含有细胞的预凝胶溶液进行离心，以使细胞局限于单一焦平面并最小化离焦信号，从而优化成像效果图1）根据细胞类型和前体液的黏度调整离心时间和离心力（400 g 离心 4 分钟）。
  3. 凝胶化或交联该溶液
    1. 对于PC-gel水凝胶，使用紫外A光源（λ = 365 nm）照射含细胞的前体，辐照剂量为3.2 J/cm²。2 每毫米厚度的光交联
      注意：计算时使用至少1 mm的厚度。照射时间应控制在1至5分钟范围内，并采用最短的照射时间。避免过度照射细胞，以免降低细胞活力并导致CFP供体荧光漂白。然而，不建议照射时间少于60秒，因为高强度照射会引起自由基自猝灭，并导致细胞活力下降。
    2. 对于TR-凝胶水凝胶，将装有材料的模具放入培养皿中，并转移至培养箱内进行热致凝胶化。在37 °C下孵育30分钟。
  4. 水凝胶凝胶化或交联后，移除PDMS水凝胶铸造模具，替换为已准备好的较大PDMS培养皿（来自步骤3.5）。使用无菌刮铲将PDMS压紧在玻璃表面，使其牢固粘附。
    1. 将此带有盖玻片的PDMS培养皿放入无菌容器（如培养皿）中。向PDMS培养皿与盖玻片形成的孔中加入无酚、无血清培养基或化学成分明确的培养基（在无血清培养基中添加胰岛素、转铁蛋白和硒，见步骤5.4），以保持水凝胶浸没状态。于37 °C孵育30分钟。
      注意：如果使用带有盖玻片的专用培养皿，则将盖玻片放入其中，并同样加入培养基。
    2. 或者，可在进行FRET成像的前一天执行此步骤，以使探针得以恢复，因为照射波长与CFP供体的激发光谱重叠。

7. 三维FRET成像

  1. 从第6.4步制备的培养皿中取出带有水凝胶的PDMS培养皿，并将其固定在显微镜XY载物台的可调节样品架上（图2）。将样品架放置在显微镜载物台上。如需要，在物镜上滴加镜油。使用至少40倍、高数值孔径（NA）的物镜（例如，1.3 NA），以捕获相对较弱的荧光团发射信号。
  2. 设置视野（FOVs）以进行图像采集：使用透射光成像选择待成像细胞，并通过荧光成像验证转染效果。选择至少15个不同的细胞。
    1. 选择亮度适中的细胞（避免过亮或过暗，否则可能导致探针信号饱和或灵敏度降低），且FRET比值在0.0至1.0之间（超出此范围可能表明二元探针受损或降解）。然后关闭照明以减少曝光。
    2. 选择靠近水凝胶中心区域的视野，并确保目标细胞位于相对平坦的照明区域内（见图3B及下文第9.2步）。
  3. 配置FRET图像通道的相机参数。在视野中心附近选取几个细胞，以优化"光学配置"（即，各图像通道的曝光时间和增益）。
    注意：以下术语根据所使用的显微镜和相机操作软件而有所不同。本文以NIS-Elements显微镜软件进行图像采集与分析。
    1. 对于单链探针的FRET分析，每个视野选择两个图像通道：淬灭发射（QE），即供体激发下的供体发射，以及受体激发下的受体发射（Aem）。
      注意：对于ICUE1 CFP-YFP探针，QE通道使用CFP激发和发射滤光片组合（418–442 ex，458–482 em），Aem通道使用YFP激发和发射滤光片组合（490–510 ex，520–550 em）。
    2. 设置QE和Aem通道的曝光参数，以在无信号饱和的前提下获得最大信号强度（若使用CCD相机，则尽可能使用最低增益），以最小化背景噪声。在整个实验过程中，以及不同实验组之间，保持两种荧光团的光学配置一致，以避免结果偏差（即，激发光强度、光圈大小、曝光时间和相机增益）（图3A）。
    3. 采集额外的图像通道，以便在采集后进行更多分析（例如，校正的敏化发射（cSE）成像（见讨论部分））。对于ICUE1 CFP-YFP探针，采集以下激发（Ex）和发射（Em）通道：Exdonor - Emdonor（QE，显微镜软件中选择CFP-CFP）、Exdonor - Emacceptor（SE，选择CFP-YFP）、Exacceptor - Emacceptor（Aem，选择YFP-YFP）以及Exacceptor - Emdonor（YFP-CFP）配置（见图3A）。
  4. 设置延时成像的采集速率。
    1. 若受硬件限制，可降低采集速率。对于短期检测（例如，30–60分钟），每个视野每分钟约采集12次（5秒 采样间隔），以捕捉信号动力学。使用满足实验需求的最低采样速率，以避免探针发生显著光漂白。
    2. 在显微镜软件中输入采集周期以设定采集速率。对于长期检测（例如，24小时），初始阶段采用高采集速率以捕捉初始脉冲响应，随后切换至低采集速率，例如每5至10分钟采集一次。
  5. 在显微镜软件中选择"立即运行"，启动图像采集，并持续成像5分钟，以在指定视野下建立探针响应的基线。
  6. 完成5分钟图像采集后，加入所需激动剂或拮抗剂分析物（例如，100 nM福斯科林），通过移液混匀，继续成像。

8. FRET 校准

  1. 系统校准：使用按步骤6所述制备的额外校准水凝胶，采用与上述FRET成像相同的视场标准、光学配置和相机设置（步骤7.1、7.2和7.3），获取至少6个代表性细胞的Aem图像。
    注意：需要对组合探针与显微成像系统的量子产率和光谱灵敏度（QS）进行定量测定 "绝对" FRET 分析，但不适用于 "相对的" FRET
    1. 通过选择在全强度激发光下照射5分钟（Aem通道激发）来对受体荧光团进行光漂白。使用窄孔径仅漂白目标细胞。通过比较信号强度直方图，确认Aem信号比原始信号至少降低10%"LUT" 在光漂白前后分别采集窗口图像。若信号损失低于90%，则继续进行光漂白。
      注意：使用不与供体荧光团激发光谱重叠的Aem激发滤光片，以确保在此过程中供体荧光团不被漂白。
    2. 在步骤7.3相同的光学配置下，对已漂白的受体荧光团进行激发，采集供体激发条件下的供体发射信号（Dem）。
    3. 根据下文第9节所述，经背景校正后，通过将 Dem 除以 Aem 计算每个像素的 QS。QS = Dem/Aem
    4. 根据细胞的平均值计算所有细胞间的平均QS。
  2. 使用校准样品估算探针的本征FRET效率（Ei）。诱导探针产生最大FRET，计算Ei = 1 - QE/(Aem × QS），或使用 Ei = cSE/Aem，或使用常规终点法 FRET 效率测定公式 Ei = 1 - (QE/Dem) 计算 Ei。
    注意：需要 Ei 来量化激活探针的绝对比例（FAP， 即探针结合分析物的比例，但并非必要 "相对的" FRET 分析
    1. 通过使用分析物生成/激活的激动剂刺激培养物，使探针响应达到饱和，适用于与分析物相互作用后FRET增加的探针。
    2. 使用信号传导拮抗剂抑制探针与分析物的相互作用，适用于结合分析物后FRET降低的探针。注意：对于ICUE1探针，可使用腺苷酸环化酶抑制剂（如2′,5′-Dideoxyadenosine（特异性）或3-异丁基-甲基-黄嘌呤（非特异性））来抑制cAMP水平。

9. FRET 比值计算

  1. 在每个视野（FOV）中靠近细胞的位置绘制并指定一个感兴趣区域（ROI），用于定义背景水平（图3B) 随时间变化在每个视野中，但将感兴趣区域（ROI）限制在图像中心照度相对均匀的区域图 4A）。有关背景校正选项的解释，请参见讨论部分。
    1. 使用显微镜软件：选择箭头按钮 "背景 ROI 图标" 并选择 "绘制椭圆形背景感兴趣区域" （其他形状也可使用）。确保 "持续更新背景偏移量" 选择后，单击“背景ROI”图标以激活背景ROI的显示。或者，使用 "ROI 图标" 并设置 ROI 的属性为 "用作背景参考区域" 和 "每个多点的 ROI 各不相同".
    2. 使用 ImageJ：利用工具栏选择圆形绘图工具，然后通过菜单将该图形添加到 ROI 管理器中 "分析→工具→ROI管理器". 如有需要，在 ROI 管理器中为背景 ROI 设置不同的颜色。
    3. 对于每个视野和图像通道（例如， QE 和 Aem），从每个时间点的背景 ROI 平均值中减去，以生成每个通道的校正图像， 例如， sQEt,p = QEt,p bQEt,p 其中 t 是采集时间， p 是视场（FOV）（即， xy 位置），以及 bQE 和 bAem 是背景感兴趣区域（ROI）内信号的标量值。使用软件中提供的图像算术功能。
      1. 使用显微镜软件，利用 "ROI 背景图标" 并选择 "使用 ROI 扣除背景"在弹出窗口中，选择 "每一张图像" 在……下方 "减去背景感兴趣区域开启" 并选择 "所有帧" 在……下方 "应用于".
        注意：为使此功能正常工作，必须在每个视野（FOV）中定义一个背景感兴趣区域（ROI）例如，如果某些视野（FOV）的背景感兴趣区域（ROI）未定义，则该功能无法正确减去具有背景ROI的视野的背景。
      2. 使用 ImageJ， "从感兴趣区域中减去背景信号" 由 Michael Cammer 编写的宏（http://microscopynotes.com/imagej/macros/）。
    4. 通过选择保存校正后的时间序列图像 "保存为" 用于后续分析步骤。
  2. 定义一个感兴趣区域 使用每个视野中每个待分析细胞的二值掩膜，在细胞周围图4B使用 Aem 通道在实验开始时对每个视野（FOV）的图像进行阈值分割，识别细胞边界，并定义感兴趣区域（ROIs）。保存这些感兴趣区域。
    1. 使用显微镜软件：对于每一帧（即，视野（FOV），首先使用菜单 "二值化→定义阈值" 并选择 "应用于当前帧"调整下限阈值以选择细胞，然后使用 "二进制→ 关闭" 如有必要，使用函数填充二值掩膜中的孔洞。接下来，使用 ROI 图标选择 "将二值图像复制到感兴趣区域"；二值层将被自动删除。
      1. 将后续帧的感兴趣区域（ROI）添加至现有的 ROI 池中。删除任何虚假的 ROI。接下来 "右键单击" 在 ROI 上并确保其属性为 "用作标准 ROI" 和 "每个多点的 ROI 均不相同".
      2. 使用 ImageJ：对于每个视野（FOV），首先使用菜单 "图像→调整→阈值"然后使用 "分析→ 分析颗粒" 勾选“显示大纲”和“添加到管理器”。使用 "二进制→ 关闭" 填补 "孔" 如有必要，在二值掩膜中删除虚假的 ROI。可使用免费插件自动完成此过程。
  3. 根据每个像素计算基于量子产率的FRET比率，sQE/sAem，用于相对分析（见步骤10）和EQE = sQE/(QS × sAem) 进行绝对定量分析（见步骤10），并与步骤8.1中获得的QS进行浮点除法运算。有关比值推导的解释，请参见讨论部分。
    1. 使用显微镜软件：通过菜单 "图像 → 图像操作" 并选择 "浮点数".
    2. 使用 ImageJ：可选择以下任一方法 "过程 → 图像计算器" 功能或 "Calculator_Plus.java" 插件。注意：或者，该宏 "pH_ratioMacro".txt" 可进行调整以计算FRET比率。该方法采用上述背景校正宏，可从以下网址获取
  4. 导出每个细胞的平均比值（即， 每个 ROI 的数据）输入电子表格和绘图软件。
    1. 使用显微镜软件：利用 ND 导出按钮中的任一选项 "ROI 统计分析" 分析对照或控制 "电子表格导出" 按钮在 "时间分析" 分析对照
    2. 使用 ImageJ：首先选择菜单 "分析 → 设置测量" 并确保 "平均值" 和 "标准差" 进行选择。然后使用 ROI 管理器并点击按钮 "测量"保存生成的结果窗口。

10. FRET 比值分析

  1. 根据每个细胞的平均FRET比值（在步骤9.4中导出）计算随时间变化的平均细胞FRET比值。在计算中应考虑基线FRET比值（即加入分析物前的比值）。
    注意：此处使用电子表格和绘图软件，基于基线进行线性回归（如下文步骤10.1.2和10.1.3所示），绘制减去基线后的平均FRET比值及其均值标准误（SEM）（图5和图6）。
    1. 相对分析（响应幅度）：将每条曲线归一化至一个共同的参考样本（例如，未处理样本）。
    2. 绝对分析（响应的时间进程）：通过将每条曲线以其基线FRET比值进行归一化，使各曲线对齐到同一起点。
      1. 在电子表格和绘图软件中，将数据列（每个细胞的平均比值列）与新插入的列交替排列，使每个原始列都配对一个仅包含基线期比值数据（加入分析物前的比值）的新列。选择"插入列"，在每个数据列后插入一个空列，然后将基线数据复制到对应的空列中。
      2. 在电子表格和绘图软件中，选择"插入 → 新建分析 → 变换去除基线"，然后将"选定列"设置为"每隔一列"，勾选"假设基线为线性"，并在"计算"下选择"差值"。
      3. 计算平均细胞比值及描述性统计量。在电子表格和绘图软件中，选择"插入 → 新建分析 → XY分析 → 带标准差或标准误的行均值"，然后在弹出窗口中选择"带标准误的行均值"。

结果

所有水凝胶前体、细胞和浇铸模具均按上述方法制备。将含细胞的前体溶液浇注至PDMS模具中，在凝胶化/光交联前进行离心，以使细胞固定在盖玻片附近，便于进行FRET成像分析（图1将带有盖玻片的水凝胶置于预先制备的PDMS成像孔中进行显微成像（图2）。然后将光学配置和图像采集参数设置如下所示 图 3A展示了CFP-YFP荧光团对所有四个FRET相关图像通道的采集（参见下文 "光学共聚焦" 在 图3），这对于非二进制探针是必需的。然而，在本研究中，单链二进制 ICUE1 探针仅需两幅图像即可计算量子效率（QE = "CFP CFP" 和 Aem = "YFP YFP" （激发发射）。在多个视野（xy位置）中选择若干细胞，这些细胞位于均匀照明区域内。图3B）。延时成像结束后，导出探针的信号数据。使用实验开始时经阈值处理的Aem图像，划定用于通道信号背景校正和细胞分析的感兴趣区域（ROIs）。图4）。从细胞库中筛选出表达量适中（不过低也不过高，即非过亮）探针的细胞图4B). 每次采集时，通过背景扣除后图像通道的浮点除法计算每个像素的QE和SE FRET比率。每个细胞的平均FRET比率（即， 每个 ROI 的信号）被计算，并相对于刺激前的基线信号进行归一化处理（即， 从所有时间点中减去基线后的回归分析，并以均值标准误（SEM）作为误差线进行绘制。基于QE和cSE的FRET比率均能检测到软骨细胞在佛司可林（100 nM）刺激下cAMP活性的升高， 图5）。由于包埋在水凝胶中的软骨细胞内cAMP活性的基础水平较低，导致QE信号较弱，因此QE FRET比率对背景校正比cSE FRET比率更敏感。两种水凝胶类型（TR-gel和PC-gel）的FRET比率均随时间逐渐升高（图6)，表明加入Forskolin后cAMP信号响应增强。根据QE FRET比率所示，PC-凝胶水凝胶中的软骨细胞表现出更大的cAMP变化（图示）以及更高的基础cAMP水平（EQE = 0.19 在 PC-凝胶中 与 EQE = 0.09，在TR凝胶中，基线相减图中未显示）。

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图1： 光交联水凝胶（PC-凝胶）中的细胞分布
A：将含细胞的水凝胶前体进行离心，以使盖玻片附近焦平面上的细胞数量最大化。B：此方法可增加视野（FOV）中的细胞数量，并最大限度减少来自焦外细胞的背景信号。（比例尺 = 200 µm）请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：PDMS培养皿中的水凝胶
将水凝胶置于较高的PDMS小室（体积为水凝胶的10倍）内，底部为盖玻片，用于显微成像和分析物刺激。PC-gel水凝胶呈透明状，并与盖玻片牢固结合，确保在整个检测过程中保持位置不变。通过使用更宽的活检打孔器以及更厚的PDMS片，可制备更大的PDMS小室，使其容纳的培养基体积比水凝胶体积多10倍。（比例尺 = 2 mm）请点击此处查看该图的放大版本。

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图3： FRET成像的采集配置
A：采集设置为每7秒在多个位置进行一次图像捕获。对于此处使用的ICUE1探针（二元单链探针）的QE FRET比率计算，仅需两个图像通道，QE = "CFP CFP" 和 Aem = "YFP YFP" （激发发射）下 "光学显微镜" 列中的 λ 显微镜软件的标签。B：视野（FOVs）"XY" 选择多个细胞位于均匀照明区域内的位置。图像下方的图表显示了沿穿过视场中心的蓝色箭头线的照明强度。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图4：FRET成像分析中感兴趣区域（ROI）的选择
A：选择无细胞区域作为感兴趣区域（ROI），用于校正每个通道的背景信号。如果细胞密度较高或细胞迁移明显，或者当细胞未处于均匀照明场中且未使用阴影校正掩模时，也可使用无细胞水凝胶的图像进行背景扣除。B：通过Aem通道的图像阈值分割和二值化掩模方法选择细胞的感兴趣区域。若所选ROI大于细胞实际范围，会因包含由背景噪声产生的胞外比值，从而对单个细胞的平均FRET比值计算产生不利影响。不推荐使用每个通道在单个细胞内的平均值来计算细胞FRET比值，因为该方法会低估实际比值。（比例尺 = 50 µm）请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：温敏性水凝胶（TR-gel）中FRET比率的比较
基于QE和SE的FRET比率均可检测到在佛司可林刺激下软骨细胞内cAMP活性的升高。佛司可林是一种腺苷酸环化酶激动剂，可诱导cAMP的生成。当ICUE1探针结合cAMP时，FRET信号降低，因此QE FRET比率（EQE  = sQE/(sAem × QS)）升高；相反，SE FRET比率下降，因此以ESE  = 1 - cSE/sAem表示。在水凝胶包埋的软骨细胞中，由于基础cAMP活性较低导致QE信号较弱，QE FRET比率对背景校正的敏感性高于SE FRET比率。误差线表示标准误（SEM），n = 25。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6： 不同水凝胶中FRET比率的比较
两种水凝胶中的软骨细胞在佛司可林刺激下均表现出cAMP活性增加，这通过随时间推移升高的QE FRET比率得以证实。水凝胶类型通过多种效应影响细胞反应，包括对佛司可林的通透性差异以及基础细胞cAMP活性的不同（EQE = 0.19 在 PC-凝胶中 与 EQE = 0.09（TR-凝胶，未显示）。误差线 = 标准误（SEM），TR-凝胶的n = 25，PC-凝胶的n = 15。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

本研究展示了如何利用FRET成像技术在三维水凝胶中分析细胞信号传导。尽管先前的研究已报道了在水凝胶基底上接种细胞的FRET成像35-37、细胞外与水凝胶相互作用的FRET成像38，以及被困在水凝胶中分子的FRET成像39-41，但本文是首次描述基于FRET成像对嵌入三维水凝胶中的细胞进行细胞内分析的研究。该工作解决了将FRET成像从二维体系转移到三维体系时面临的若干实施问题。第一，FRET成像需要高数值孔径物镜以收集足够的发射信号，但这会限制景深。本研究通过离心使细胞轻微沉降，从而增加靠近玻璃表面焦平面内的细胞数量，以补偿这一限制。第二，三维水凝胶支架在成像过程中可能发生漂移，导致视野移动，增加分析难度。本研究中水凝胶被牢固结合在盖玻片上，确保其在整个实验过程中保持固定。第三，选择适合三维FRET成像的水凝胶组成至关重要，因为水凝胶可能阻碍细胞的可视化。本研究采用了透明性良好的PC-gel和TR-gel水凝胶。然而，通过离心将细胞聚集到靠近盖玻片的焦平面，也可用于对衍射更强的水凝胶中的细胞进行成像。水凝胶的选择取决于需要模拟的微环境条件，相关综述可参见文献42。第四，本研究采用了一种替代计算方法来计算单链ICUE1探针的FRET比值（即，EQE  = QE/cAem），以减少分析所需的图像通道数量，从而最大限度地减少光漂白。每个细胞的平均FRET比值是通过计算细胞内各像素比值的平均值得出的，以避免低估真实的FRET比值。最后，本文还描述了线性比值分析方法以及计算单链二元探针激活比例的方法。

使用宽场显微镜进行成功的FRET实验有几个关键方面。在硬件方面，相机必须具有足够的灵敏度以分辨微小的信号变化，因此新型科学级CMOS相机和电子倍增CCD比传统CCD更适用。为了最佳地分析FRET比率的空间分布，相机的空间分辨率至少应达到物镜点扩散函数的两倍（奈奎斯特准则），这使得双视图系统在此任务中不太适用。更为关键的是为特定的FRET荧光对选择合适的曝光时间和图像采集速率，以最大程度减少荧光染料的光漂白。随着实验持续时间的增加，建议降低采集速率。使用快速滤光轮可提高采集速率和可用于分析的视野数量，同时避免双视图系统和转塔式滤光块带来的图像配准问题。非均匀的照明场会增加对来自样品自发荧光和相机系统噪声的背景荧光进行校正的复杂性。某些水凝胶，特别是含有胶原蛋白的水凝胶，具有强烈的自发荧光43,44。若不进行背景校正，FRET比率将被低估。本文采用一种简单的背景校正方法，依赖于相对平坦的照明场，该照明场通常可通过落射荧光照明在图像中心区域实现（图3B，步骤7.2）。因此，本方法将感兴趣细胞限制在该照明场范围内。此处描述的背景校正未考虑在二元探针检测波长下的细胞自发荧光。在这种情况下，应使用未标记细胞（无探针转染）在相同条件下成像，并进行背景扣除。也可使用标记与未标记细胞的混合样本，并选择其中的未标记细胞作为背景感兴趣区域（ROI）。其他可实现全图像视野细胞分析的方法包括使用阴影掩模、多个背景ROI，或不含细胞的相同样品，相关方案可应要求提供。

针对3D FRET成像，探针响应对水凝胶对分析物的通透性高度敏感（图6）。因此，应在不同实验处理之间比较相同的水凝胶区域，最好选择几何对称的位置，例如本文所用的支架中心附近。或者，可采用微流控腔室/生物反应器，以快速且均匀地将分析物溶液灌注到水凝胶中45。当水凝胶的自发荧光过高时，可能无法检测到FRET信号（信噪比过低）；此时应使用更薄的水凝胶或更换探针（采用不同的荧光团）。在光交联水凝胶中进行3D FRET成像时，建议使用最低限度的辐照剂量，并选择探针荧光团激发光谱范围之外的波长。可使用405 nm的可见光源配合LAP，以进一步减少潜在的细胞损伤31,46。然而，建议使用365 nm辐照配合LAP，因为这能最大程度减少探针漂白。365 nm位于CFP供体激发光谱的尾端，而405 nm则处于其激发峰顶。或者，也可允许探针表达恢复一天时间。使用双元探针可最大程度减少因供体与受体荧光团表达水平差异及分子扩散差异所引起的敏感性问题。非双元探针也可使用，但需采用SE而非QE成像，并额外校正激发与发射光谱的光谱串扰（见下文）。此外，FRET探针商业可及性低且设计复杂，可能构成技术障碍。成功实验最关键的要素仍然是对荧光信号进行恰当的校正与分析。

FRET比率的另一种计算方法被采用，除了减少光漂白外，还有其他几个原因。对于二元单链探针，通常报道的比率是供体激发下的受体发射（敏化发射，SE）与供体激发下的供体发射（淬灭发射，QE）之比。 即， FRET 比值 = SE/QE25,47,48. SE/QE相对于FRET效率的变化呈非线性关系21,22,47即，该比值与探针的内在FRET效率（Ei）呈指数型非线性关系(Donius, A. E., Taboas, J. M. 未发表的工作 (2015))，其中当Ei小于约15%时，该比值的线性关系最佳。SE/QE还会低估激活探针的比例（FAP， 即， 探针结合分析物的比例）。因此，对SE/QE的分析需要繁琐的平衡剂量反应研究及曲线拟合。幸运的是，SE或QE与在受体激发下受体发射（Aem）的比值相对于Ei和FAP呈线性关系。 即FRET 比值 SE/Aem 和 QE/Aem。SE/Aem 常用于二元探针，仅需终点校准（在探针无活性和完全活性状态下），但细胞基础信号的存在使得终点校准难以实现。为消除对终点校准的需求，可对 SE 进行校正（cSE），以校正供体与受体激发和发射光谱之间的光谱重叠（光谱渗漏），以及复合探针荧光团与显微成像系统的量子产率和光谱敏感性（QS）。基于 cSE 的校正后 SE FRET 比值定义了图像中每个像素内探针的观测 FRET 效率。 即， E东南 = cSE/Aem。已有商用及免费软件可用于校正这些因素对SE的影响，建议读者参考Chen和Periasamy 2006年的研究，以获取相关方法的详细解释。50。然而，计算 E东南 每个时间点需要捕获三个图像通道（SE、QE、Aem）。因此，在本研究中，我们还采用了另一种FRET比率EQE = 1 - QE/cAem，该计算仅需采集两个图像通道（QE 和 Aem）。计算 EQE 仅需通过QS校正Aem即可（cAem = Aem × QS）。QS = Dem/Aem 可通过校准样品的两张图像轻松估算，其中 Dem 是在受体漂白条件下对供体进行激发时的供体发射信号。任意时刻的 FAP 值均可通过比较 E 计算得出东南 或 EQE 探针的Ei值。

最终，FRET比率筛选（E东南 = cSE/Aem 与 EQE = QE/cAem）的计算应基于探针类型以及信号最佳的通道进行选择。上述两种方法均包含每帧图像的背景噪声校正，以校正随时间变化的自发荧光。这些方法假设Aem激发光不会重叠进入Dem激发光谱，这通常得益于探针设计和显微镜滤光片配置。单链探针可任选一种方法，选择依据为探针信号（亮度）相对于相机噪声以及SE和QE通道背景信号的最佳表现。对于本研究中使用的ICUE1探针及实验条件（细胞和水凝胶类型），SE通道的信号强于QE通道。双链探针则必须使用E方法。东南 由于供体和受体荧光团的非等摩尔分布。对于在结合分析物时FRET降低的探针（如ICUE1），FRET效率可被 "倒置" 在结合分析物时呈现出阳性信号变化，正如我们在本研究中通过 E 所示东南 = 1 - cSE/Aem 或 EQE = QE/(Aem × QS)。

FAP 分析对 FRET 比值的正确校正以及 Ei 的估算较为敏感。Ei 可通过与 QS 相同的校准样品以及传统的终点法 FRET 效率检测进行估算，公式为 Ei = 1 - (QE/Dem)（先获取 QE 图像，随后对受体进行光漂白，再获取 Dem 图像）28，但必须注意尽量减少供体的意外漂白。我们描述了一种改进方法，其中基于经量子产率校正的Aem来估算Dem。 即，Ei = 1 - (QE/(Aem × QS))。或者可使用 Ei = cSE/Aem。在活细胞中估算 Ei 需要使所有探针均达到完全的 FRET。在实际操作中，探针很难实现完全的 FRET。 例如 ICUE1，其在结合分析物后 FRET 信号降低。一种 体外 使用细胞裂解物和纯化分析物进行Ei的计算最为理想，但超出了本研究的范围。本文建议使用2′,5′-二脱氧腺苷以降低细胞内的cAMP水平。然而，也可基于信号基础水平推导出的Ei估计值来计算相对FAP。由于上述原因，多数研究通常报告FRET比值（如本研究所示），或基于终点校准的相对FAP，其中添加激动剂前的信号基础水平作为下限，而加入第二种可饱和信号的激动剂后的信号作为上限。福司柯林常被用作对照激动剂以达到cAMP信号的饱和。 alternatively，也可使用cAMP类似物，如8-溴代腺苷3',5'-环磷酸单酯。建议在实验结束时使用阳性对照，以识别不同实验处理之间信号通路可能发生的改变。

计算每个细胞的平均信号响应需要考虑多个因素。首先，应通过计算细胞内每个像素的FRET比率的平均值来获得平均FRET比率， 即，(∑(QE⁄cAem))／像素数量，而非细胞中平均QE与Aem的比值 即，(∑QE)⁄(∑cAem)。尽管后一种方法由于背景噪声较低而无需精细遮蔽，但它会显著低估真实的平均FRET比率。然而，基于像素的比率计算需要浮点运算，并对细胞区域进行精确的二值化遮蔽，以定义感兴趣区域（ROI），并避免将细胞外背景噪声产生的伪影比率纳入分析。为避免细胞形态带来的结果偏差，必须对整个细胞区域进行定量。根据细胞形态变化和迁移情况，遮蔽区域可能需要随时间重新定义。或者，也可使用大于细胞的ROI，但需设定排除标准，以剔除QE和Aem信号中远低于细胞水平且接近背景水平的像素比率。本文所述分析方法详述了本研究中用于FRET分析的基本步骤，无需依赖专用软件或插件。显微镜制造商及其他供应商为其显微镜软件提供附加模块，支持自动化的比率及FRET分析。同样，公共领域的ImageJ软件也提供多种用于颗粒和FRET分析的插件，例如RiFRET。其次，由于采用二维图像，基于像素的平均FRET比率会低估三维细胞结构的真实平均比率。二维信号代表了沿z轴方向的投影与平均。若无高速三维成像技术，无法实现活细胞中FRET比率三维空间分布的计算。例如，使用转盘共聚焦显微镜）。这一问题在二维和三维培养体系中均存在，但在三维培养中影响更为显著，因为更多的细胞结构位于焦平面之外。这对于定位于特定细胞结构的探针尤为关键，例如定位于质膜的EPAC1探针PM-ICUE。有关校正细胞厚度对比率计算影响的建议，请参见Spiering et al. 201324Aem 分布的分析可用于检测探针是否在细胞的某些区域积聚，并据此调整成像平面。这将有助于解释FRET比率的空间分布，并排除伪阳性结果。 例如，识别探针饱和（即， Aem 值较低的区域探针浓度也较低，可能出现探针饱和并导致较高的 FRET 比值。第三，不同实验组之间 FRET 基线水平的差异可能反映了转染效率、探针表达水平或基础信号活性的差异。 "相对分析" （步骤10.1.1）有助于消除FRET比率随时间可能存在的漂移。该步骤便于比较不同样本间反应相对幅度的差异，但会阻碍与参照样本（对照组曲线为一条水平直线）反应时间进程的比较。 "绝对分析" （步骤 10.1.2）有助于比较不同样本间的反应速率，但由于每条曲线被不同的常数缩放，因而不利于比较反应幅度。研究中常采用对基线进行线性回归的方法，以校正随时间变化的 FRET 比值漂移。

所述的三维FRET方法是一种有用且实用的技术，可用于制备负载细胞的三维水凝胶并进行延时成像，该方法也可适用于其他探针和成像模式。除单链二元探针外，其他FRET系统需要对基于强度的信号进行更复杂的校正，如上所述。或者，可采用FRET荧光寿命成像（FLIM-FRET）技术，通过检测探针供体荧光发射寿命的变化来计算FRET效率。与基于强度的FRET不同，FLIM-FRET对背景噪声、光谱串扰、量子效率以及探测器的光谱敏感性不敏感2。然而，FLIM系统价格昂贵、结构复杂且不常见，并且在使用具有单指数衰减且无FLIM跑偏现象的荧光团时效果最佳49。所述方法也可与更先进的显微镜平台结合使用（例如，FRET-TIRF、荧光各向异性以及光谱相关FRET）。将该方法应用于高速共聚焦显微镜和多光子显微镜的三维成像，将有助于分析信号响应的亚细胞分布，并提高信号分析的准确性。这种三维FRET方法将推动在模拟的三维细胞微环境中开展更深入的细胞生物学研究。因此，该方法可直接应用于药理学和再生医学领域的需求，包括研究细胞间信号传导以及在工程化水凝胶微组织中筛选药物反应。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢匹兹堡大学牙医学院提供的经费支持、美国国立卫生研究院资助项目K01 AR062598以及资助号P30 DE030740。作者还感谢Jin Zhang博士提供ICUE1质粒，Wayne Rasband开发ImageJ软件，以及Michael Cammer提供ImageJ宏程序。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚二甲基硅氧烷（PDMS）[Sylgard 184 弹性体试剂盒]Fisher Scientific（埃尔斯沃思胶粘剂）NC0162601试剂
聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDM）根据 Lin-Gibson 方法，使用 Sigma Aldrich 的 PEG 制备95904试剂
3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯Sigma AldrichM6514试剂
3-缩水甘油醚基丙基三甲氧基硅烷Sigma Aldrich440167试剂
二甲基苯基亚磷酸酯Sigma Aldrich149470-5g试剂
2,4,6-三甲基苯甲酰氯Fisher ScientificAC244280100试剂
2-丁酮Fisher ScientificAC149670010试剂
溴化锂Fisher ScientificAC199871000试剂
异丙醇Sigma Aldrich190764试剂
Sigmacote（硅化试剂）Sigma AldrichSL2试剂
甲苯 Fisher ScientificAC36441-0010试剂
磷酸盐缓冲液（PBS）HycloneSH3025601试剂
Opti-MEM 低血清培养基，无酚红（无酚红且无血清培养基）Life Technologies11058-021试剂
FuGENE HD 转染试剂（转染试剂）PromegaE2311试剂
Cellstripper（细胞解离溶液）康宁25-056-CI试剂
生长因子减少型基质胶，无酚Corning356231试剂
ForskolinSigma AldrichF6886试剂
移液器吸头（10,200,1,000） μl) Fisher Scientific02-707-474, 02-707-478, 02-707-480一次性实验器材
无粉检查手套Fisher Scientific19-149-863B一次性实验器材
铝箔Fisher Scientific01-213-100一次性实验器材
3 mm 活检打孔器Miltex3332一次性实验器材
玻璃盖玻片Fisher Scientific12-544C一次性实验器材
预包被玻璃盖玻片（环氧硅烷）ArrayitCCSL一次性实验器材
载玻片Fisher Scientific12550D一次性实验器材
无菌离心管（15 ml，50 ml 锥形）Fisher Scientific14-959-70C, 14-959-49A一次性实验器材
细胞培养皿（6孔）Falcon351146一次性实验器材
带电动载物台的落射荧光显微镜尼康MEA53100（Eclipse TiE 倒置）大型/非一次性实验设备
可调式XY载物台样品夹尼康77011393非一次性实验设备
60倍（1.3 数值孔径）物镜（CFI Plan Apochromat 60XH Lamda）尼康MRD01605非一次性实验设备
CFP/YFP 光源及激发/发射滤光片支架（Lambda 光源） && 轮，Lambda 发射滤光片系统)尼康（Sutter Instrument 代理商）77016231, 77016088非一次性实验设备
CYF/YFP滤光片组尼康（Chroma技术公司）77014928非一次性实验器材
相机（ORCA Flash 4.0 v1）尼康（滨松经销商）77054076非一次性实验设备
NIS-Elements 40.20.02 显微镜软件尼康MQS31100 非一次性实验设备
Prism（电子表格与绘图软件）GraphPad Software, Inc版本 6非一次性实验设备
OmniCure S1000 紫外点固化灯系统（配备 365 nm 滤光片）或其他光源λ = 365 或 405OmniCureS1000大型/非一次性实验设备
移液器辅助器 Drummond Scientific Co. DP-100非一次性实验器材
血细胞计数板豪泽科学Reichert Bright-Line 1475非一次性实验设备
真空干燥器/脱气装置 任何大型/非一次性实验设备
组织培养罩 任何大型/非一次性实验设备
化学通风橱 任何大型/非一次性实验设备
烘箱任何大型/非一次性实验设备
刮勺任何非一次性实验设备
烧杯任何非一次性实验设备
培养箱 任何大型/非一次性实验设备

参考文献

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