方法文章

用于研究与人类衰老相关疾病基因的转基因小鼠表型分析方案

DOI：

10.3791/54136

⸱

2016年7月14日

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1Department of Environmental Health Sciences, Yale University School of Medicine, 2Department of Ophthalmology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种利用小鼠作为模型系统，通过反向遗传学方法研究与人类疾病相关的基因家族的策略，并描述了相应的小鼠表型分析流程。由于HtrA2基因缺陷的小鼠表现出帕金森样症状，因此该表型分析方案侧重于鉴定神经系统缺陷。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

与年龄相关的疾病正变得越来越普遍，随着人口老龄化，其带来的负担持续加重。尽管迫切需要有效的治疗方法来减轻这些致残性疾病的危害，但在许多情况下，有效的治疗手段仍然难以实现。只有深入理解与衰老相关疾病的病因和病理机制，科学家才能开始识别潜在的治疗靶点，并制定相应的干预策略。最常见的与年龄相关的疾病包括神经退行性疾病，如帕金森病和失明。年龄相关性黄斑变性（AMD）是老年人失明的首要原因。全基因组关联研究此前已鉴定出与该疾病易感性相关的基因位点，并确定了两个重点关注区域：补体因子H（CFH）基因以及位于10q26的位点，后者包含年龄相关性黄斑病变易感基因2（ARMS2）和高温需求因子A1（HtrA1）基因。CFH是补体系统旁路途径（AP）的负调控因子，而HtrA1是一种细胞外丝氨酸蛋白酶。ARMS2位于灵长类基因组中HtrA1的上游，但在小鼠基因组中该基因缺失。为了研究这些基因的作用，已建立了人源化敲入小鼠品系 Cfh 和 ARMS2，敲除 Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 和 HtrA4 以及条件性神经元基因敲除 HtrA2 生成了这些小鼠。在所有基因工程小鼠中，只有全身性或神经组织特异性缺失 HtrA2 的小鼠表现出明显的表型。为了对这些小鼠进行彻底而系统的分析，建立了一个初步的表型分析方案，该方案包含一系列与两种主要关注疾病相关的测试：年龄相关性黄斑变性（AMD）和帕金森病。可通过适当的实验对基因修饰小鼠进行检测，以鉴定可能与人类相关疾病有关的表型。本文介绍了一项以线粒体为重点的表型分析方案，并展示了相关测试的代表性结果。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

与年龄相关的疾病在现代社会中日益普遍。随着医学科学的进步和预期寿命的延长，人口持续老龄化，这些疾病的负担也随之加重。为了减轻致残性疾病带来的影响，亟需有效的治疗方法，但在许多情况下，此类疗法仍难以实现。只有深入理解与衰老相关疾病的病因和病理机制，科学家才能开始识别潜在的治疗靶点，并制定干预策略。常见的年龄相关疾病包括神经退行性疾病，例如帕金森病（PD）和年龄相关性黄斑变性（AMD）。帕金森病是人类因神经退行性变引起的最常见运动障碍。大多数帕金森病患者在50岁以后出现静止性震颤、运动迟缓和肌强直等症状。约10%的病例中也观察到早发性发病。

年龄相关性黄斑变性（AMD）是导致老年人失明的首要原因，会逐渐损害眼部的光感受器和视网膜色素上皮（RPE）。中心视力受损，但周边视力通常不受影响。AMD有两种类型。在"干性"类型中，RPE与布鲁赫膜（BM）之间会形成被称为玻璃膜疣的细胞外蛋白沉积物，导致地图样萎缩和中心视力模糊。更严重的"湿性"类型则是由于脉络膜通过BM向RPE和光感受器层发生新生血管化，可能引起视网膜下出血，造成视网膜组织的永久性损伤。全基因组关联研究此前已鉴定出与该疾病易感性相关的多个位点，并确定了两个重点关注区域：位于1号染色体上的补体因子H（CFH）基因，以及10q26位点，后者包含年龄相关性黄斑病变易感基因2（ARMS2）和高温需求因子A1（HtrA1）基因1-5。这些等位基因的组合以剂量依赖的方式增加患AMD的风险，而特定的单核苷酸多态性（SNP）可优先与湿性或干性AMD相关联3-6。

CFH 通过抑制 C3 的活化，作为补体系统旁路途径（AP）的负向调节因子。一个单核苷酸多态性（SNP）与年龄相关性黄斑变性（AMD）风险增加相关，该多态性由 T 到 C 的替换导致第 9 外显子中酪氨酸 402 被组氨酸取代。1在年龄相关性黄斑变性（AMD）中，人们认为补体因子H（CFH）功能丧失导致旁路途径（AP）调控失调，但该单核苷酸多态性（SNP）是否起因果作用尚不明确。一种假说是，带正电荷的组氨酸可能削弱CFH与相互作用蛋白C反应蛋白和硫酸乙酰肝素的结合能力。1,7. 体外 关于CFH Y402H的研究在不同变异体之间的功能差异方面提供了相互矛盾的结果，且 体内 工作于 Cfh-/- 表达人源化CFH的小鼠研究正在进行中8ARMS2 位于灵长类基因组中 HtrA1 的上游，但在小鼠基因组中该基因缺失。HtrA1 是一种丝氨酸蛋白酶，而 ARMS2 的特征尚不明确。由于年龄相关性黄斑变性（AMD）相关位点中的单核苷酸多态性（SNPs）存在连锁不平衡，使得难以确定该区域各个基因突变对疾病风险的独立贡献。但近期研究表明，导致脉络膜新生血管形成和视网膜下蛋白沉积的是 HtrA1 的过表达，而非 ARMS2。9-11然而，该位点内基因间的紧密相邻关系可能允许发生相互作用，而这些相互作用无法通过随机插入的转基因进行研究。

除了年龄相关性黄斑变性（AMD）外，丝氨酸蛋白酶HtrA家族还与多种人类疾病相关。所有HtrA蛋白均包含一个丝氨酸蛋白酶结构域，其后至少连接一个C端PDZ结构域。HtrA1、HtrA3和HtrA4具有最高的同源性，均由信号肽、类胰岛素生长因子结合结构域、Kazal蛋白酶抑制结构域、丝氨酸蛋白酶结构域和PDZ结构域组成。HtrA2的N端结构不同，包含线粒体定位序列、跨膜结构域和凋亡抑制因子结合结构域，其后为蛋白酶结构域和PDZ结构域12-16。哺乳动物HtrA1通过其蛋白酶结构域活性位点的底物诱导重塑进行调控17-20，而HtrA2则可通过丝氨酸蛋白酶结构域与PDZ结构域之间的相互作用进行调节，该相互作用可抑制蛋白酶活性21。有趣的是，PDZ结构域似乎并不对HtrA3产生类似的调控作用16。HtrA蛋白酶还可受外界因素调控：最近研究表明，HtrA1与原卟啉之间存在调控性相互作用22，而HtrA2可在PINK1依赖的方式下，通过p38 MAP激酶通路激活后的磷酸化进行调控23。在小鼠中敲除HtrA家族各个成员的现象已有报道，但由于缺乏明显的表型，其具体的分子机制大多尚不明确。

HtrA1 在蛋白质质量控制中发挥重要作用，其表达失调或突变与多种人类疾病相关，包括关节炎、癌症以及年龄相关性黄斑变性（AMD）风险增加3,4,24-32。HtrA2 在神经组织中的功能缺失与人类和小鼠的帕金森病（PD）表型相关，而在非神经组织中缺失则导致加速衰老33-37。HtrA3 的表达失调与子痫前期及某些类型的癌症有关38,39。在子痫前期患者的胎盘中观察到 HtrA4 的上调，但敲除该基因的小鼠并未表现出明显的表型40,41。部分敲除小鼠未出现明显表型的现象被推测可能是由于 HtrA 家族成员之间的功能代偿所致：据认为 HtrA4 和 HtrA1 均可与 TGF-β 蛋白家族相互作用，因此在 HtrA4 缺失时 HtrA1 可能发挥代偿作用41。类似地，由于 HtrA1 与 HtrA3 在结构域上具有高度同源性，推测二者可能具有互补功能42。然而，也有研究提出 HtrA 蛋白可能具有部分拮抗作用，通过竞争调控共同的靶标分子43。

为了进一步研究这些风险因素，构建了三种人源化基因敲入小鼠品系。Cfhtm1(CFH*9)jhoh 和 Cfhtm2(CFH*9)jhoh 小鼠的 Cfh 基因第9外显子被替换为人类同源基因的第9外显子。Cfhtm1(CFH*9)jhoh 在第402位编码与疾病无关的酪氨酸残基，而 Cfhtm2(CFH*9)jhoh 则携带与风险相关的Y402H单核苷酸多态性（SNP）。在 ARMS2tm1jhoh 小鼠中，将人类 ARMS2 序列靶向插入至 HtrA1 基因上游区域。在该基因序列上游但位于所包含的 UbiC 启动子下游处放置了一个两侧带有 loxP 位点的 STOP 序列，通过与 OzCre 小鼠杂交将其切除；OzCre 小鼠在 Rosa26 启动子控制下表达 Cre 重组酶，如前所述34。除了这些敲入品系外，还构建了 Cfh 和 HtrA1 的条件性敲除等位基因（Cfhtm1jhoh 和 HtrA1tm1jhoh），以及 HtrA 家族其他已知成员的敲除模型：HtrA2（HtrA2tm1jhoh）、HtrA3（HtrA3tm1jhoh）和 HtrA4（HtrA4tm1jhoh）。全身性基因敲除小鼠的构建方法是将 OzCre 小鼠与特定外显子两侧带有 loxP 位点的工程小鼠杂交，从而使基因删除导致移码和/或活性结构域缺失（Cfh：第3外显子；HtrA1：第2-3外显子；HtrA2：第2-4外显子；HtrA3：第3外显子；HtrA4：第4-6外显子）34,41。此外，已有研究报道使用在 Nestin 启动子控制下表达 Cre 重组酶的小鼠（HtrA2flox；Tg(Nes-cre)1Kln/J）实现 HtrA2 的神经组织特异性删除34。只有缺失 HtrA2 的小鼠（无论是全身性缺失还是神经组织特异性缺失）表现出明确的表型，呈现帕金森病样表型。

由于部分这些目的基因被认为定位于线粒体11,44-47，且HtrA2基因的缺失可导致帕金森病样表型，本文描述了一种以线粒体和神经系统为重点的表型分析方案，并提供了相关检测的代表性结果。为了对用于研究人类年龄相关性疾病的基因工程小鼠进行充分而系统的表型分析，我们建立了一个初步的表型检测流程，该流程包含一系列与两种主要研究疾病（年龄相关性黄斑变性及帕金森病）相关的检测项目。

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方案

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伦理声明：涉及动物的研究均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的建议，并符合耶鲁大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定。

1. 转基因小鼠的行为学测试

注意：所有小鼠应接受相同的测试流程，以尽量减少因适应抓取操作而产生的差异。每次测试应在每天的同一时间进行。

  1. 新生小鼠后肢测试
    注意：后肢测试从出生后第（P）4天至P10每天进行一次，用于评估后肢近端肌肉的力量、无力情况及疲劳程度。
    1. 将小鼠转运至测试区域，并在测试前静置30分钟。
    2. 准备测试装置：用70%乙醇清洁一个50 ml锥形管，将两个（P4-P8）或一个（P9-P10）棉球推至管底，并将锥形管固定于垂直位置。
    3. 从笼中取出一只仔鼠并记录体重。在非测试期间，将仔鼠置于加热垫上的暂存托盘中。
    4. 轻轻将新生仔鼠的后肢悬挂在锥形管边缘上方，使其朝向管底的棉球方向向下。记录其拉拽尝试次数，并使用秒表测量其跌落潜伏期。
    5. 重复测试一次，然后用记号笔标记仔鼠。之后，通过脚趾剪切法识别P6日龄仔鼠。 测试结束后，用原笼垫料轻轻擦拭仔鼠，再放回原笼。
    6. 用70%乙醇擦拭锥形管。
    7. 依次对下一仔鼠进行测试，直至整窝仔鼠全部完成测试。
    8. 丢弃棉球和锥形管。所有设备均用70%乙醇清洁。
  2. 断奶期观察测试
    注意：断奶期观察测试从P19至P21每天进行一次，用于评分小鼠的运动行为和总体活动水平。
    1. 将小鼠转运至测试区域，并在测试前于原笼中静置30分钟。
    2. 准备底部标有6×6网格（每格2英寸见方）的有机玻璃测试箱，用70%乙醇清洁后，在侧面设置摄像设备，确保整个测试箱处于视野范围内。每日保持设备布置及周围环境一致，避免引入新奇刺激。
    3. 从笼中取出一只断奶仔鼠，放入洁净的暂存杯中，并记录体重。
    4. 开始录像，先拍摄包含小鼠编号、测试日龄和日期的测试标识卡。随后将小鼠从暂存杯转移至网格中心方格，计时三分钟，记录测试期间小鼠前爪跨越的网格线数量。
    5. 测试结束后将小鼠放回洁净笼具，并停止录像。
    6. 用70%乙醇清洁测试装置。
    7. 重复上述步骤，直至整窝小鼠均完成测试，然后将所有仔鼠放回原笼。
    8. 所有测试设备均用70%乙醇清洁。
    9. 通过回看录像，对直立行为次数进行定量统计：即小鼠以前肢完全离地支撑身体站立的行为；同时统计理毛行为次数：即小鼠使用双前肢进行清洁的动作。
  3. 金属网抓握力测试
    注意：抓握力测试在P22至P26期间每隔一天进行一次，用于评估神经肌肉力量。
    1. 将小鼠转运至测试区域，并在原笼中静置30分钟后再开始测试。
    2. 准备测试装置：用70%乙醇清洁有机玻璃箱和金属网格。在箱底铺上气泡膜，并覆盖一张纸。
    3. 将小鼠分为每组三只，分别放入独立的暂存杯中。
    4. 将第一只小鼠放置于金属网中心，缓慢翻转装置，使其位于有机玻璃箱底部软垫表面上方10-20 cm处。使用秒表测量其跌落潜伏期。若小鼠在60秒内未跌落，则终止测试。
    5. 将小鼠放回暂存杯，用70%乙醇擦拭金属网，并更换气泡膜上的覆盖纸。依次对组内其余两只小鼠进行测试，之后再次轮回到第一只小鼠。每只小鼠共测试三次。
    6. 完成一组测试后，将该组小鼠放回洁净笼具，并继续测试下一组。若某组小鼠少于三只，需确保每次测试之间有至少5分钟的恢复间隔。
    7. 所有小鼠测试完成后，将其全部放回原笼，丢弃使用过的纸张，并用70%乙醇清洁所有测试设备。

2. 视网膜结构的检查

  1. 在P30-35阶段，通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对动物进行麻醉。通过夹捏足垫评估麻醉深度，仅在无反应时继续操作，符合IACUC指南要求。用4% PFA/PBS进行灌注固定48。
  2. 为摘除眼球，先用70%乙醇清洁颅底切口处皮肤，然后切开皮肤。剥离皮肤以暴露颅骨，并用70%乙醇清洁。使用洁净器械小心切开颅骨以到达眼眶并暴露眼球。切断视神经，轻柔地将眼球从眼眶中取出，并用PBS冲洗。
  3. 在室温下用4% PFA/PBS固定眼球10分钟。
  4. 将眼球置于含有PBS的小培养皿中。使用拆线剪在角膜中央做一小切口。沿角膜与巩膜交界处剪下角膜。用镊子移除虹膜。最后剥离视网膜色素上皮（RPE）层，保留视网膜完整且晶状体原位不动。
    注意：4% PFA/PBS固定会导致RPE脱离，从而便于从视网膜外侧轻松剥离RPE。
  5. 在室温下用4% PFA/30%蔗糖/PBS重新固定15分钟，然后将眼球放回含PBS的培养皿中。用镊子取出晶状体，同时带出玻璃体。
  6. 在4 °C条件下用30%蔗糖溶液进行过夜冷冻保护。
  7. 将眼球包埋于最佳切削温度化合物（OCT）中，并转移至含有新鲜OCT的包埋模具内。调整眼球方向，使矢状面与切面平行，操作时动作尽量少，并避免引入气泡。将模具浸入干冰/乙醇浴中快速冷冻。将组织块储存于-80 °C。
  8. 使用冷冻切片机切割20 µm厚的矢状切片，并收集于预先清洁的载玻片上。
  9. 根据标准方案49对切片进行苏木精-伊红染色。使用配备明场显微镜的光学显微镜进行成像。

3. 组织化学染色

  1. 样品制备
    1. 使用异氟烷过量（30%溶于丙二醇）通过开放滴入法吸入处死P30-35的小鼠。通过呼吸停止、心跳停止以及对足垫夹捏无反应来评估动物是否死亡。根据IACUC指南，通过颈椎脱位和器官摘除确认死亡。
    2. 为取出大脑，先用70%乙醇清洁颅骨切口处的皮肤，然后在颅底切开皮肤。将皮肤向后剥离以暴露颅骨，并用70%乙醇清洁。使用洁净器械小心切开颅骨并移除，以暴露大脑。去除脑膜后，轻柔地将大脑从颅腔中取出，并用PBS冲洗。
    3. 将大脑表面涂布OCT包埋剂，转移至含有新鲜OCT的包埋模具中。尽可能减少操作，将大脑定向使其矢状面与切面平行，避免引入气泡。将模具浸入干冰/乙醇浴中快速冷冻，并在-80 °C下保存。
    4. 使用冷冻切片机切割10 µm厚的矢状切片，并收集到预先清洁的载玻片上。
  2. NADH脱氢酶染色
    1. 通过将5.72 g Tris-HCl和1.66 g Tris碱溶于1 L去离子水中，配制0.05 M Tris缓冲液（pH 7.6）。4 °C下可保存长达六周。
    2. 配制NADH溶液（2.25 mM NADH溶于0.05 M Tris缓冲液）。分装后于-20 °C保存。
    3. 配制NBT溶液（2.5 mM硝基蓝四氮唑溶于0.05 M Tris缓冲液）。置于玻璃瓶中，4 °C下可保存长达六周。
    4. 将NADH溶液与NBT溶液等体积混合，制成染色液，每张载玻片加入1 ml。在37 °C湿润环境中孵育30分钟。
    5. 吸除染色液，并用dH2O洗涤三次。
    6. 在丙酮/dH2O梯度溶液（30%、60%、90%、60%、30%）中依次各洗涤三次，每次2分钟，室温进行。
    7. 用dH2O冲洗三次，使用水性封片剂封片。采用配备明场显微镜的光学显微镜成像。蓝色染色代表酶活性。
  3. 琥珀酸脱氢酶组织化学染色
    1. 配制0.2 M磷酸二氢钠/dH2O溶液和0.2 M磷酸氢二钠/dH2O溶液。
    2. 将1份磷酸二氢钠溶液与20份磷酸氢二钠溶液混合，配制0.2 M磷酸盐缓冲液（pH 7.6）。
    3. 配制染色液（0.1 M琥珀酸钠，1.25 M NBT溶于0.2 M磷酸盐缓冲液），每张载玻片加入1 ml。在37 °C湿润环境中孵育60分钟。
    4. 吸除染色液，并用dH2O洗涤三次。
    5. 在丙酮/dH2O梯度溶液（30%、60%、90%、60%、30%）中依次各洗涤三次，每次2分钟，室温进行。
    6. 用dH2O冲洗三次，使用水性封片剂封片。采用配备明场显微镜的光学显微镜成像。蓝色染色代表酶活性。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本部分描述了使用这些方法可获得结果的示例。在后肢测试中，每天连续进行两次测试，并将两次测试中的拉拽尝试次数和跌落潜伏期相加。该测试可用于比较遗传背景不同的组别，以区分神经肌肉力量减弱的小鼠。HtrA2tm1jhoh（HTRA2 基因敲除，HTRA2 KO）小鼠在图1A-B中显示，在出生后第4至6天（P4-6）拉拽次数和跌落潜伏期无变化，但在出生后第7至10天（P7-10）出现神经肌肉力量下降，与同窝野生型小鼠（HTRA2 WT）相比存在差异。在野生型动物中也可观察到随年龄增长而力量增强的预期趋势。在断奶期观察测试中，可通过将测试连续三天内所有行为事件（穿越格线、直立和理毛行为）的总数相加并取平均值来评估总体活动水平。或者，也可对每种特定类型的行为事件进行单独分析。此处展示了代表性结果，表明HTRA2基因敲除小鼠的活动水平低于野生型同窝小鼠。这些数据表明，总体活动水平可在不同组间进行定量测量和比较（图1C）。通过计算每天三次重复测试的...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了减轻与人类衰老相关疾病的致残性影响，迫切需要建立有效的治疗手段，但目前许多疾病仍缺乏有效的疗法。要确定潜在的治疗靶点并制定干预策略，首先必须了解与衰老相关疾病的病因和病理机制。即使某些基因在人类研究中已被证实与特定疾病相关，但并非所有经过基因修饰的小鼠都会立即表现出与目标疾病相关的明显表型。因此，需要开展更为系统的研究，并对基因修饰小鼠进行适当的实验，以识别可能与人类相关疾病有关的表型特征。

存在多种行为学测试方法，可用于检测小鼠的神经功能50,51。本文所述的行为学测试方法适用于基于人类研究结果所推测的小鼠表型，以及实际观察到的小鼠表型。此外，这些测试方法操作简便，即使缺乏或仅有少量行为学实验经验的实验室也能顺利开展。这些测试无需复杂的仪器设备，只要规范操作，即可获得有意义且具有信息量的结果，因此可作为初步评估预期存在神经肌肉缺陷的基因修饰小鼠表型的第一步。所得数据可用于指导后续更深入测试的方向，必要时可采用更为复杂的测试装置进行进一步分析。

同样，目前存在多种用于评估组织呼吸功能的技术5...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何竞争利益需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究的资金来自Rosebay医学基金会和耶鲁医学院院长研究基金（JH）。我们感谢Claire Koenig博士在行为实验方面提供的帮助。基因工程小鼠品系由Ozgene公司（澳大利亚珀斯）构建。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙醇Decon（Fisher Scientific）435541
50 ml 离心管Fisher Scientific1443222
棉球沃尔玛
加热垫太阳光束0000756-500-000
持物盘（冰格）沃尔玛
电子秒表GOGOPC396
有机玻璃箱在车间建造12" 12" 
Vixia HF R400 摄像机佳能8155B004
9 盎司透明杯沃尔玛
1/4英寸金属网家得宝204331884（在线）/ 554219（店内）12" 12" 
气泡膜VWR470092-416
直型标本钳VWR82027-438
精细尖头解剖镊VWR82027-408
精细剪刀VWR82027-578
16% 多聚甲醛溶液电子显微镜科学公司15710
10x 磷酸盐缓冲液 pH 7.4American BioanalyticalAB11072-04000
蔗糖JT Baker4072-01
超白载玻片Fisher Scientific12-550-15
苏木精染色液Fisher Scientific（Ricca）353016
伊红Y染色液Fisher Scientific（Ricca）2845-32
Tris 盐酸盐SigmaT3253
TrisAmerican BioanalyticalAB02000-01000
还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸二钠盐水合物SigmaN8129
氯化硝基四氮唑蓝SigmaN6876
丙酮JT Baker9006-05
磷酸二氢钠一水合物SigmaS9638
七水合磷酸氢二钠SigmaS9390
六水合琥珀酸钠二碱SigmaS2378
VectaMount 水性封片介质Vector LaboratoriesH-5501-60
盖玻片Fisher Scientific12-545-M60 mm × 24 mm
AxioImager A1 显微镜Zeiss
摄像机三脚架亚马逊
最佳切割温度（OCT）Fischer Scientific23730571
冷冻切片  机器Leica CM1900已停用，但已被 CM1950 取代

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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