从慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染小鼠中分离的活化调节性T细胞的表型与功能分析

摘要

本文介绍了一种分析从未经处理及慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染小鼠中分离的调节性T（T_reg）细胞表型的实验方案。此外，我们还提供了一种评估T_reg细胞抑制活性的方法。

摘要

调节性T（T_reg）细胞，这类细胞表达转录因子Foxp3，是CD4的亚群⁺ T细胞。T_reg 细胞通过调节免疫反应，在免疫耐受和维持稳态中发挥关键作用。T细胞的主要功能是_调节 细胞的作用是抑制效应T细胞（T_eff) 细胞以及干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-2（IL-2）等细胞因子的产生。已有研究表明，T_reg 细胞抑制T细胞功能的能力_eff 细胞在持续性病原体感染和癌症发展过程中其功能得到增强。为阐明T_调节 静息或炎症条件下细胞的多种 体外 使用小鼠或人T细胞的抑制实验_reg 已设计出多种方法来研究细胞。本研究的主要目的是建立一种方法，用于比较静息状态与活化状态的T细胞在表型及抑制功能上的差异_reg 细胞。为了分离活化的T细胞_reg 细胞，小鼠被感染了淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）克隆13（CL13），这是一种LCMV的慢性感染株。T_reg 来自LCMV CL13感染小鼠脾脏的分离细胞与静息T细胞相比，表现出活化表型及增强的抑制活性_{基因表达调控} 来自未处理小鼠的细胞。本文中，我们描述了基本实验方案 离体 表型分析以区分活化的T细胞_reg 静息T细胞_reg 细胞。此外，我们描述了一种用于检测完全活化的T细胞抑制活性的实验方案。_reg 细胞

引言

调节性T（T_reg）细胞表达叉头框P3（Foxp3）作为其发育和功能的转录因子¹。此外，T_reg细胞还在其表面或胞内区域表达多种其他分子，如CD25²、淋巴细胞活化基因3（LAG-3）³、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体⁴以及细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）⁵。在多种病原体（如病毒^6,7、细菌^8,9和寄生虫^10-12）的慢性感染过程中，或在肿瘤发生发展过程中^13,14，T_reg细胞会分化为活化状态，表现出对效应性CD4⁺和CD8⁺ T细胞更强的抑制功能。多篇研究指出，在Friend逆转录病毒（FV）感染期间，扩增并活化的T_reg细胞导致CD8⁺ T细胞应答受损^15-17。FV诱导产生的T_reg细胞可抑制CD8⁺ T细胞的干扰素-γ（IFN-γ）或颗粒酶B的表达及其细胞毒活性^15-17。此外，在单纯疱疹病毒（HSV）感染模型中，有研究报道，清除CD4⁺CD25⁺ T_reg细胞可导致病毒特异性CD8⁺ T细胞扩增，并因致免疫病理的CD4⁺ T细胞浸润而引发严重的组织损伤^18-20。

持续感染淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒克隆13株（LCMV CL13）^21-24的小鼠已被广泛用于表征慢性病毒感染期间效应T细胞（T_eff）和T_reg细胞的表型与功能。在持续性LCMV感染过程中，病毒特异性T_eff细胞逐渐丧失其效应功能，并转变为耗竭性T细胞（T_exh）。另一方面，T_reg细胞则增强其抑制病毒特异性T细胞应答的能力²⁵。T_eff细胞功能下降可由多种因素解释，例如T_eff细胞上抑制性受体的上调、抗原呈递细胞功能的改变、免疫调节性细胞因子的产生，以及T_reg细胞频率的增加或功能的增强²⁶。在参与T细胞抑制的因素中，表达程序性死亡蛋白1（PD-1）的T_exh细胞和T_reg细胞被广泛视为抗原持续存在和免疫抑制微环境的标志性特征。最近有报道称，在LCMV慢性感染期间，阻断PD-1通路并清除T_reg细胞可增强T细胞功能并降低病毒载量²⁷。此外，T_reg细胞在小鼠慢性LCMV感染期间被激活^23,25，其抑制功能得到增强²⁵。PD-1在T_reg细胞和T_exh细胞上均高表达，且T_reg细胞表达PD-1的水平与其抑制T细胞增殖的抑制功能强度呈正相关²⁵。

在此，我们描述了一种用于比较活化T细胞特性的方法_reg 从感染LCMV CL13的小鼠中分离的细胞及静息T细胞_reg 来自未处理小鼠的细胞。此外，我们阐述了一系列分离活化T细胞的步骤_reg 细胞并检查它们的 离体 表型，并测量其抑制活性 体外.

方案

本研究中，小鼠饲养于延世大学延世实验动物研究中心的特定病原体阴性动物设施中。所有动物实验均按照韩国食品药品管理局的指南进行，并采用经延世大学实验动物研究中心国际动物护理与使用委员会批准的实验方案。

1. 溶液的配制

1. 通过将胎牛血清（FBS）稀释至2%以及青霉素-链霉素稀释至1%来配制2% RPMI培养基。
2. 配制完全RPMI培养基。向RPMI培养基中加入10% FBS、1%青霉素-链霉素、1% L-谷氨酰胺和50 μM 2-巯基乙醇。
3. 配制荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液。将磷酸盐缓冲液（PBS）中添加2% FBS即可。
4. 配制T细胞分离缓冲液。将PBS中添加2% FBS和2 mM乙二胺四乙酸即可。

2. 脾淋巴细胞的分离

1. 按照先前所述方法，取出未处理或感染LCMV CL13的小鼠脾脏¹⁹，并将其置于含有10 ml 2% RPMI培养基的60 mm × 15 mm培养皿中。
   注：本研究中，5至6周龄的C57B1L/6J雌性小鼠通过尾静脉注射接受2 × 10⁶斑块形成单位（p.f.u.）的LCMV CL13。于感染后第16天（16 d p.i.）²⁵处死小鼠。同日分析配对的未处理小鼠。
2. 将细胞筛置于50 ml离心管中，并用2 ml 2% RPMI培养基冲洗。将脾脏置于70 μm细胞筛上，使用注射器活塞研磨。再用2 ml 2% RPMI培养基冲洗细胞筛，随后将其从50 ml离心管中移除。
3. 用2% RPMI培养基加满离心管，在4 °C下以300 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml ACK裂解缓冲液中。室温（RT）孵育5分钟。
   注：上述ACK裂解缓冲液体积适用于单个脾脏。若为合并脾脏样本，应相应增加体积。
4. 用2% RPMI培养基加满离心管，在4 °C下以300 × g离心10分钟。弃去上清液，将细胞重悬于完全RPMI培养基中，密度为1 × 10⁷细胞/ml。
   注：进行活细胞计数时，使用台盼蓝染色细胞，仅计数未染色的活细胞，使用血细胞计数板进行计数。

3. 脾脏常规T（T_conv）细胞和T_reg细胞的表型分析

注意：在调节性T细胞（T_reg）分离之前，通过使用多种抗体对来自未处理或感染小鼠的脾淋巴细胞进行染色，并通过流式细胞术分析，检测其表型。

1. 取50 μl细胞（5 × 10⁵个细胞）的总脾淋巴细胞，加入新的U型底96孔板的每个孔中，每孔加入150 μl FACS缓冲液。在4 °C下以300 × g离心2分钟。
2. 弃去上清液。轻轻振荡使细胞沉淀重悬，每孔加入200 μl FACS缓冲液。在4 °C下以300 × g离心2分钟（重复两次）。
3. 在每孔50 μl FACS缓冲液中配制用于细胞表面标志物染色的抗体混合液，所用抗体和试剂如下：抗CD4紫色荧光染料、抗CD25绿色荧光染料、抗PD-1紫色荧光染料、抗CD8 PerCP-Cy5.5荧光染料以及近红外（IR）荧光活性染料用于细胞活力检测。
   注意：如需进一步分析活化T_reg细胞的表型，可在细胞表面标志物染色时加入抗CD103^23,25抗体。
4. 每孔用50 μl抗体混合液重悬细胞沉淀，在4 °C避光孵育20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，每次在4 °C下以300 × g离心2分钟。
5. 最后一次洗涤后，弃去上清液，每孔加入100 μl按制造商说明书配制的固定缓冲液，在4 °C避光固定20分钟。
6. 用破膜洗涤缓冲液（按制造商说明书配制）洗涤细胞两次，每次在4 °C下以300 × g离心2分钟。
7. 配制用于细胞内Foxp3染色的抗体溶液，每孔用50 μl抗Foxp3抗体溶液重悬细胞沉淀。
   注意：如需进一步分析T_conv和T_reg细胞的表型，可在本步骤中加入抗CTLA-4抗体。
8. 在4 °C避光孵育20分钟，并重复步骤3.6。最后一次洗涤后，将细胞沉淀重悬于200 μl FACS缓冲液中，通过流式细胞仪分析细胞表型²⁵。
9. 圈选活细胞群体。为分析LCMV CL13感染期间T_conv细胞的表型，检测CD4⁺或CD8⁺ T细胞中Foxp3⁻PD-1⁺细胞的频率。
   注意：根据实验结果，在LCMV CL13感染后第16天，CD4⁺和CD8⁺ T细胞群体中Foxp3⁻PD-1⁺细胞的比例均超过50%。
   1. 为分析T_reg细胞的频率和表型，检测CD4⁺ T细胞中Foxp3⁺或Foxp3⁺PD-1⁺细胞的频率。
      注意：根据实验结果，CD4⁺ T细胞群体中Foxp3⁺或Foxp3⁺PD-1⁺细胞的比例分别超过20%。

4. CD4⁺CD25⁺ T_reg 细胞的分离

注意：以下所列所有试剂的体积均基于起始细胞数量为 1 × 10⁷ 个总脾细胞。

1. 按照第2节所述，使用未致敏小鼠和LCMV慢性感染小鼠制备细胞。加入10 ml T细胞分离缓冲液洗涤细胞。在300 × g下离心 4 °C 条件下，以 x g 离心 10 分钟。彻底弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 40 μl 缓冲液中。
2. 对于CD4⁺ 使用磁性细胞分选系统进行T细胞富集，加入10 μl生物素标记抗体混合物并充分混匀。在4 °C孵育10分钟。
3. 加入30 μl缓冲液，20 μl抗生物素微珠用于非CD4标记⁺ T细胞和10 μl CD25-PE抗体用于CD25的荧光标记⁺ 细胞。充分混匀，避光孵育15分钟。
4. 加入2 ml缓冲液，将细胞通过40 μm细胞滤网过滤至新的50 ml离心管中，以去除细胞碎片。在4 °C下以300 x g离心10 min洗涤细胞。彻底弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500 μl缓冲液中，细胞密度最高可达1.25 ×10⁸ 细胞
5. 将细胞加入柱中，收集流穿柱子的未标记细胞。用2 ml缓冲液洗涤柱子，在4 °C下以300 × g离心10分钟。彻底弃去上清液，重悬分离得到的CD4⁺ 缓冲液中的T细胞，体积为90 μl。
6. 用于CD25的磁性标记⁺ 细胞中加入10 μl抗PE微珠，充分混匀，在4 °C避光孵育15分钟。
7. 加入2 ml缓冲液，于4 °C、300 × g离心10 min洗涤细胞。彻底弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500 μl缓冲液中，细胞密度最高可达1 × 10⁸ 细胞
8. 为了富集 CD4⁺CD25⁺ T_{基因表达调控} 细胞，将细胞加入柱中进行阳性筛选，再加入2 ml缓冲液洗涤柱。重复洗涤三次。
9. 当完成最后的洗涤步骤且柱子排空后，向柱中加入1 ml缓冲液，洗脱磁标记的CD4⁺CD25⁺ 使用冲棒处理细胞。
10. 重复步骤 4.8–4.9 以提高分离的 CD4 纯度⁺CD25⁺ T_reg 细胞。用FACS缓冲液在4 °C下以300 × g离心10分钟洗涤细胞。弃去上清液，将分离的CD4⁺CD25⁺ T_reg 细胞浓度为 2 x 10⁶ 细胞/ml，置于完全RPMI培养基中。
11. 检测分离的CD4纯度⁺CD25⁺ T_基因 细胞，使用 2 x 10⁵ 总分离的CD4+细胞⁺CD25⁺ T_reg 细胞。用含有抗CD4 FITC和近红外荧光活性染料的50 μl FACS缓冲液对细胞进行染色。
    注意：CD25 在分离过程中已用 PE 标记。
12. 在 4 °C 避光孵育 20 分钟。用 FACS 缓冲液在 4 °C、300 × g 离心 2 分钟洗涤细胞。洗涤后，将细胞沉淀重悬于 100 μl FACS 缓冲液中，通过流式细胞术检测纯度。
13. 圈选活细胞群体。分析T细胞的纯度_reg 细胞，确认CD4阳性细胞的百分比⁺CD25⁺ 细胞
    注意：根据实验结果，CD4⁺CD25⁺ 纯化细胞中目标细胞的比例超过约80%。

5. CD8的分离⁺ T细胞与CD8标记⁺ T细胞

注意：以下所有试剂的体积均基于起始细胞数量为 1 × 10⁷ 个总脾细胞。

1. 按照第2节所述方法使用未处理小鼠制备细胞。加入10 ml T细胞分离缓冲液洗涤细胞，于4 °C以300 x g离心10 min。彻底弃去上清液，将细胞沉淀重悬于40 μl缓冲液中。
2. 对于CD8⁺ 使用磁性细胞分离系统分离T细胞，加入10 μl非CD8生物素化抗体混合物⁺ T细胞标记并充分混匀，在4 °C孵育5分钟。
3. 加入30 μl缓冲液和20 μl抗生物素微珠，充分混匀，在4 °C孵育10分钟。
4. 将细胞上样至柱中，收集流穿的未标记细胞。用2 ml缓冲液洗涤柱子，重复三次。
5. 300 × g 离心 4 °C下以x g离心10分钟。彻底弃去上清液，重悬分离得到的CD8⁺ 2 ml 缓冲液中的 T 细胞
6. 为检测分离细胞的纯度，用FACS缓冲液配制50 μl抗体溶液。重悬细胞。 ×10⁵ CD8 分离细胞中的细胞⁺ 50 μl 抗体溶液中的T细胞
   注意：配制抗体溶液时，将抗 CD8 FITC 和细胞活力检测试剂（近红外荧光反应性染料）加入 FACS 缓冲液中。
7. 在 4 °C 避光孵育 20 分钟。用 FACS 缓冲液在 4 °C、300 × g 离心 2 分钟洗涤细胞。洗涤后，将细胞沉淀重悬于 100 μl FACS 缓冲液中，通过流式细胞术检测细胞纯度。
8. 圈选活细胞群体。检测CD8的纯度⁺ T细胞，确认CD8的百分比⁺ T细胞
   注意：根据实验结果，CD8阳性细胞的百分比⁺ 纯化细胞中目标细胞的比例超过约90%。
9. 向分离的CD8中加入PBS⁺ T细胞。在4 °C下以300 × g离心10分钟。弃去上清液。重悬分离的CD8⁺ 浓度为 1 x 10⁶ 的 T 细胞⁷ 细胞/ml（在PBS中）
10. 对CD8进行标记⁺ T细胞用于 体外 抑制实验，将细胞增殖示踪紫染料用 PBS 稀释，于室温下配制成 5 μM 的浓度。
    注意：本研究中使用的细胞增殖示踪紫染料的激发峰和发射峰波长分别约为 405 nm 和 450 nm。
11. 将细胞增殖示踪紫染料（5 μM）与细胞悬液（1 × 10⁶ 细胞/mL）等体积混合，充分混匀。⁷ 细胞/毫升的CD8⁺ T细胞）置于15 ml离心管中，在37 °C孵育20分钟，每10分钟涡旋振荡一次。
12. 用预冷的完全RPMI培养基充满离心管，室温静置10分钟。在室温下以300 × g离心10分钟。彻底弃去上清液，将细胞重悬于浓度为2 × 10⁶个/mL的培养基中。⁶ 细胞/ml，并加入预热的完全RPMI培养基。室温孵育15分钟。

6. 设置 体外 使用CD4的抑制实验⁺CD25⁺ T_reg 和 CD8⁺ T细胞

1. 为制备抗CD3/CD28包被的磁珠，将适量磁珠转移至15 ml离心管中（每1 × 10⁵ 个细胞使用2.5 μl）。加入等体积的PBS并混匀。在4 °C下以300 x g离心2分钟，弃上清液。用完全培养基稀释磁珠（每孔50 μl）。
2. 将50 μl CD4⁺CD25⁺ T_reg 细胞分装至U型底96孔板的每孔中（每孔1 × 10⁵ 个细胞）。每孔加入50 μl作为效应T细胞（T_resp）的CD8⁺ T细胞（每孔1 × 10⁵ 个细胞）。每孔加入50 μl稀释后的抗CD3/CD28包被磁珠。
   注意：在此步骤中，按下述方式标记并设置对照孔："仅未刺激的CD8⁺ T细胞"，不加抗CD3/CD28包被磁珠；"仅CD8⁺ T细胞"，加入抗CD3/CD28包被磁珠；"仅CD8⁺ T细胞"，加入抗CD3/CD28包被磁珠；"仅T_reg 细胞"，加入抗CD3/CD28包被磁珠。T_reg 细胞可用完全培养基稀释，并以不同的T_resp 细胞:T_reg 细胞比例（1:0.25–1:1）与T_resp 细胞共培养。
3. 向所有孔中加入50 μl或适量培养基，使总体积达到200 μl。用铝箔覆盖培养板，在37 °C的CO₂ 培养箱中孵育72小时。

7. CD8 分析⁺ T细胞增殖 & CD8 细胞因子的产生⁺ T细胞

1. 进行细胞因子产生分析时，培养3天后，将每孔的上清液转移至另一块板中，并进行酶联免疫吸附测定（ELISA）。
   注意：上清液可分装后于-70 °C保存。本实验中，使用抗小鼠IFN-γ抗体包被的板，按照制造商的说明书检测IFN-γ的产生。若需在单细胞水平上测定增殖性CD8⁺ T细胞的IFN-γ产生，可进行细胞内细胞因子染色。
2. 分离各孔上清液后，用FACS缓冲液洗涤含细胞的培养板，并在4 °C条件下以300 × g离心2分钟（共3次）。
3. 洗涤后弃去上清液。用50 μl抗体混合液重悬细胞沉淀，用于染色增殖的CD8⁺ T细胞，在4 °C避光孵育20分钟。
   注意：配制抗体混合液时，将抗CD4 FITC、抗CD8 PerCP-Cy5.5及细胞活力检测试剂（近红外荧光反应性染料）加入FACS缓冲液中。
   注意：可将针对CD44或CD69等不同标志物的抗体与其他抗体联合使用，以确认CD8⁺ T细胞的活化状态。请注意，CD8⁺ T细胞已在步骤5.10中标记了细胞增殖追踪紫染料。
4. 在4 °C条件下以300 × g离心2分钟，洗涤两次。最后一次洗涤后弃去上清液，加入100 μl固定缓冲液，在4 °C避光固定20分钟。
5. 在4 °C条件下以300 × g离心2分钟，洗涤两次。用200 μl FACS缓冲液重悬细胞，通过流式细胞术检测标记了细胞增殖追踪紫染料的CD8⁺ T细胞的增殖情况。
   1. 在活细胞中圈选CD8⁺ T细胞群体。根据细胞增殖追踪紫染料的稀释程度，测定已分裂与未分裂细胞的比例，并依据以下公式计算CD8⁺ T细胞的增殖抑制率：% 抑制率 = [（无T_reg细胞时增殖的CD8⁺ T细胞百分比 - 有T_reg细胞时增殖的CD8⁺ T细胞百分比）/ 无T_reg细胞时增殖的CD8⁺ T细胞百分比] × 100。进一步使用流式细胞术分析软件²⁵对数据进行分析。

结果

我们通过静脉注射 2 × 10⁶ p.f.u. 的 LCMV CL13，建立了持续性病毒感染的小鼠模型。为了研究慢性病毒感染期间 T_reg 细胞和 T_conv 细胞的表型变化，我们对来自未感染小鼠和感染小鼠的脾淋巴细胞进行了多种抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。感染后第16天（16 d p.i.），Foxp3^-CD4⁺ T_conv（图1A，上图）和 Foxp3^-CD8⁺ T_conv（图1B，上图）细胞中 PD-1 的表达均上调。LCMV CL13 感染小鼠中 Foxp3⁺CD4⁺ T_reg 细胞的频率是未感染小鼠的两倍（图1A）。特别是，大多数 Foxp3⁺CD4⁺ ...

讨论

尽管小鼠和人体内的调节性T细胞（T_reg）数量较少，但了解其功能至关重要，因为它们在调控免疫应答和维持免疫耐受中发挥关键作用。在慢性病毒感染^15-20以及癌症进展过程中^13,14，T_reg细胞的数量及其抑制功能均会增加。这可能是由于持续的抗原刺激所致。为了评估在抗原持续存在和疾病发展条件下的T_reg细胞功能，需要检测其抑制活性。

在此，我们描述了一种用于分析的实验方案 离体 T细胞表型_reg 细胞并使用抑制活性检测方法来测定其抑制功能 体外 CD8共培养系统⁺ T细胞和T_调节 细胞。本方案中的关键步骤是T细胞的分析与分离_reg 细胞。活的和 freshly isolated T_reg 细胞表现出明显的抑制活性 体外我们还检测了T细胞的表型_卷积 和 T_reg 慢性病毒感染...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异硫氰酸荧光素标记的大鼠抗小鼠 CD4 抗体	RM4-5	BD Biosciences	553047
Cytofix/Cytoperm 固定与透化试剂		BD Biosciences	554714
U 型底组织培养板		BD Biosciences	353077
固定缓冲液		BD Biosciences	554655
异硫氰酸荧光素标记的大鼠抗小鼠 CD25 抗体	7D4	BD Biosciences	553072
细胞筛网，70 mm		BD Biosciences	352350
细胞筛网，40 mm		BD Biosciences	352340
Brilliant Violet 421 标记的抗小鼠 CD279（PD-1）抗体	29F.1A12	BioLegend	135217
Brilliant Violet 605 标记的抗小鼠 CD4 抗体	RM4-5	Biolegend	100547
APC 标记的抗小鼠/大鼠 Foxp3	FJK-16s	eBioscience	17-5773
Foxp3/转录因子染色缓冲液试剂盒		eBioscience	00-5223
PerCP-Cyanine5.5 标记的抗小鼠 CD8a 抗体	53-6.7	eBiosicence	45-0081
小鼠 IFN-γ Platinum ELISA 试剂盒		eBiosicence	BMS606
RPMI 1640 培养基		GE Life Sciences	SH30027
PBS（1×）		GE Life Sciences	SH30256
ACK 裂解缓冲液		Gibco	A10492-01
L-谷氨酰胺，200 mM 溶液		Gibco	25030
青霉素-链霉素，10,000 U/ml		Gibco	10378-016
LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒		Life technologies	L-34975
CD8a+ T 细胞分离试剂盒，小鼠		Miltenyibiotec	130-104-075
CD4+ CD25+ 调节性 T 细胞分离试剂盒，小鼠		Miltenyibiotec	130-091-041
MACS 分离柱，LD 型		Miltenyibiotec	130-042-901
MACS 分离柱，LS 型		Miltenyibiotec	130-042-401
EDTA，0.5 M（pH 8.0）		Promega	V4231
2-巯基乙醇		Sigma Life Science	M7522
胎牛血清		Thermo Fisher Scientific	SH30919.03
CellTrace Violet 细胞增殖试剂盒		Thermo Fisher Scientific	C34557
BD Canto II 流式细胞仪		BD Biosciences
Flowjo		TreeStar
血细胞计数板		Marienfeld superior