从慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染小鼠中分离的活化调节性T细胞的表型与功能分析

摘要

本文介绍了一种分析从未经处理及慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染小鼠中分离的调节性T（T_reg）细胞表型的实验方案。此外，我们还提供了一种评估T_reg细胞抑制活性的方法。

摘要

调节性T（T_reg）细胞，这类细胞表达转录因子Foxp3，是CD4的亚群⁺ T细胞。T_reg 细胞通过调节免疫反应，在免疫耐受和维持稳态中发挥关键作用。T细胞的主要功能是_调节 细胞的作用是抑制效应T细胞（T_eff) 细胞以及干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-2（IL-2）等细胞因子的产生。已有研究表明，T_reg 细胞抑制T细胞功能的能力_eff 细胞在持续性病原体感染和癌症发展过程中其功能得到增强。为阐明T_调节 静息或炎症条件下细胞的多种 体外 使用小鼠或人T细胞的抑制实验_reg 已设计出多种方法来研究细胞。本研究的主要目的是建立一种方法，用于比较静息状态与活化状态的T细胞在表型及抑制功能上的差异_reg 细胞。为了分离活化的T细胞_reg 细胞，小鼠被感染了淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）克隆13（CL13），这是一种LCMV的慢性感染株。T_reg 来自LCMV CL13感染小鼠脾脏的分离细胞与静息T细胞相比，表现出活化表型及增强的抑制活性_{基因表达调控} 来自未处理小鼠的细胞。本文中，我们描述了基本实验方案 离体 表型分析以区分活化的T细胞_reg 静息T细胞_reg 细胞。此外，我们描述了一种用于检测完全活化的T细胞抑制活性的实验方案。_reg 细胞

引言

调节性T（T_reg）细胞表达叉头框P3（Foxp3）作为其发育和功能的转录因子¹。此外，T_reg细胞还在其表面或胞内区域表达多种其他分子，如CD25²、淋巴细胞活化基因3（LAG-3）³、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体⁴以及细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）⁵。在多种病原体（如病毒^6,7、细菌^8,9和寄生虫^10-12）的慢性感染过程中，或在肿瘤发生发展过程中^13,14，T_reg细胞会分化为活化状态，表现出对效应性CD4⁺和CD8⁺ T细胞更强的抑制功能。多篇研究指出，在Friend逆转录病毒（FV）感染期间，扩增并活化的T_reg细胞导致CD8⁺ T细胞应答受损^15-17。FV诱导产生的T_reg细胞可抑制CD8⁺ T细胞的干扰素-γ（IFN-γ）或颗粒酶B的表达及其细胞毒活性^15-17。此外，在单纯疱疹病毒（HSV）感染模型中，有研究报道，清除CD4⁺CD25⁺ T_reg细胞可导致病毒特异性CD8⁺ T....

方案

本研究中，小鼠饲养于延世大学延世实验动物研究中心的特定病原体阴性动物设施中。所有动物实验均按照韩国食品药品管理局的指南进行，并采用经延世大学实验动物研究中心国际动物护理与使用委员会批准的实验方案。

1. 溶液的配制

1. 通过将胎牛血清（FBS）稀释至2%以及青霉素-链霉素稀释至1%来配制2% RPMI培养基。
2. 配制完全RPMI培养基。向RPMI培养基中加入10% FBS、1%青霉素-链霉素、1% L-谷氨酰胺和50 μM 2-巯基乙醇。
3. 配制荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液。将磷酸盐缓冲液（PBS）中添加2% FBS即可。
4. 配制T细胞分离缓冲液。将PBS中添加2% FBS和2 mM乙二胺四乙酸即可。

2. 脾淋巴细胞的分离

1. 按照先前所述方法，取出未处理或感染LCMV CL13的小鼠脾脏¹⁹，并将其置于含有10 ml 2% RPMI培养基的60 mm × 15 mm培养皿中。
   注：本研究中，5至6周龄的C57B1L/6J雌性小鼠通过尾静脉注射接受2 × 10⁶斑块形成单位（p.f.u.）的LCMV CL13。于感染后第16天（16 d p.i.）²⁵处死小鼠。同日分析配对的未处理小鼠。
2. 将细胞筛置于50 m....

结果

我们通过静脉注射 2 × 10⁶ p.f.u. 的 LCMV CL13，建立了持续性病毒感染的小鼠模型。为了研究慢性病毒感染期间 T_reg 细胞和 T_conv 细胞的表型变化，我们对来自未感染小鼠和感染小鼠的脾淋巴细胞进行了多种抗体染色，并通过流式细胞术进行分析。感染后第16天（16 d p.i.），Foxp3^-CD4⁺ T_conv（图1A，上图）和 Foxp3^-CD8⁺ T_conv（图1B，上图）细胞中 PD-1 的表达均上调。LCMV CL13 感染小鼠中 Foxp3⁺CD4⁺ T_reg 细胞的频率是未感染小鼠的两倍（图1A）。特别是，大多数 Foxp3⁺CD4⁺ .......

讨论

尽管小鼠和人体内的调节性T细胞（T_reg）数量较少，但了解其功能至关重要，因为它们在调控免疫应答和维持免疫耐受中发挥关键作用。在慢性病毒感染^15-20以及癌症进展过程中^13,14，T_reg细胞的数量及其抑制功能均会增加。这可能是由于持续的抗原刺激所致。为了评估在抗原持续存在和疾病发展条件下的T_reg细胞功能，需要检测其抑制活性。

在此，我们描述了一种用于分析的实验方案 离体 T细胞表型_reg 细胞并使用抑制活性检测方法来测定其抑制功能 体外 CD8共培养系统⁺ T细胞和T_调节 细胞。本方案中的关键步骤是T细胞的分析与分离_reg 细胞。活的和 freshly isolated T_reg 细胞表现出明显的抑制活性 体外我们还检测了T细胞的表型_卷积 和 T_reg 慢性病毒感染.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异硫氰酸荧光素标记的大鼠抗小鼠 CD4 抗体	RM4-5	BD Biosciences	553047
Cytofix/Cytoperm 固定与透化试剂		BD Biosciences	554714
U 型底组织培养板		BD Biosciences	353077
固定缓冲液		BD Biosciences	554655
异硫氰酸荧光素标记的大鼠抗小鼠 CD25 抗体	7D4	BD Biosciences	553072
细胞筛网，70 mm		BD Biosciences	352350
细胞筛网，40 mm		BD Biosciences	352340
Brilliant Violet 421 标记的抗小鼠 CD279（PD-1）抗体	29F.1A12	BioLegend	135217
Brilliant Violet 605 标记的抗小鼠 CD4 抗体	RM4-5	Biolegend	100547
APC 标记的抗小鼠/大鼠 Foxp3	FJK-16s	eBioscience	17-5773
Foxp3/转录因子染色缓冲液试剂盒		eBioscience	00-5223
PerCP-Cyanine5.5 标记的抗小鼠 CD8a 抗体	53-6.7	eBiosicence	45-0081
小鼠 IFN-γ Platinum ELISA 试剂盒		eBiosicence	BMS606
RPMI 1640 培养基		GE Life Sciences	SH30027
PBS（1×）		GE Life Sciences	SH30256
ACK 裂解缓冲液		Gibco	A10492-01
L-谷氨酰胺，200 mM 溶液		Gibco	25030
青霉素-链霉素，10,000 U/ml		Gibco	10378-016
LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒		Life technologies	L-34975
CD8a+ T 细胞分离试剂盒，小鼠		Miltenyibiotec	130-104-075
CD4+ CD25+ 调节性 T 细胞分离试剂盒，小鼠		Miltenyibiotec	130-091-041
MACS 分离柱，LD 型		Miltenyibiotec	130-042-901
MACS 分离柱，LS 型		Miltenyibiotec	130-042-401
EDTA，0.5 M（pH 8.0）		Promega	V4231
2-巯基乙醇		Sigma Life Science	M7522
胎牛血清		Thermo Fisher Scientific	SH30919.03
CellTrace Violet 细胞增殖试剂盒		Thermo Fisher Scientific	C34557
BD Canto II 流式细胞仪		BD Biosciences
Flowjo		TreeStar
血细胞计数板		Marienfeld superior