检测皮质片段在细菌孢子萌发

摘要

在本文中，我们描述了一种比色测定法，用于检测细菌孢子萌发过程中还原糖的存在。

摘要

艰难梭菌和其他梭菌的内生孢子萌发过程越来越多地被发现与模式孢子形成细菌枯草芽孢杆菌不同。发芽是由小分子发芽物触发的，并且无需大分子合成即可发生。尽管芽孢杆菌和梭菌物种的孢子萌发机制存在差异，但一个共同的要求是肽聚糖样皮层的水解，这使得孢子核膨胀和再水化。补液后，可以开始新陈代谢，最终导致营养细胞的生长。在孢子萌发过程中检测水解皮层片段可能很困难，并且对先前描述的测定的修改可能会令人困惑或难以重现。因此，根据我们最近使用该测定法的报告，我们详细介绍了在细菌孢子萌发过程中对皮层片段进行比色检测的分步方案。

引言

芽孢是细菌代谢，使细菌在不利的环境中坚持的休眠形式。在许多孢子形成细菌，孢子形成是通过营养剥夺诱导但此过程可通过改变pH值，暴露于氧或其它应力¹进行控制。而在其代谢休眠孢子形式，细菌抵抗紫外线辐射，干燥，更高的温度，和冷冻^2。最上的孢子形成过程的知识来自在模式生物的研究， 枯草芽孢杆菌 。在孢子形成过程开始于DNA复制和轴向灯丝^3,4的形成。非对称隔膜然后把细胞分成两个大小不等车厢。较大的隔间里，母细胞，吞噬较小的隔间里，forespore。无论是母细胞和forespore协调基因表达成熟的孢子母细胞裂解最终，释放多尔曼吨孢子到周围环境中^1。

孢子的结构和组合物在许多细菌物种保守的。孢子芯具有比营养细胞低水含量和有丰富的吡啶二羧酸^{（DPA）1,2。}期间形成孢子，DPA被泵入孢子芯换取水。围绕核心的是一种内在的孢子膜的地方，在多数孢子形成的细菌，其中认识到刺激发芽（germinants）的小分子的受体位于^2。刚好位于孢子的内膜外是细胞壁肽聚糖的层。一个专门的肽聚糖层（皮层）围绕细胞壁肽聚糖，并且由许多相同的部件，细胞壁肽聚糖[交替的N-乙酰葡糖胺酶（NAG）和N-乙酰胞壁酸（NAM）]的。但是，在皮质的NAM残基的约50％已被转化为胞壁-δ内酰胺^5,6- 。期间孢子萌发，这些胞壁-δ内酰胺残基被孢子....

方案

1.生成样本

1. 热激活C.难辨孢子在65℃下30分钟，并存储在冰上。
   注:C.如先前^7,9,10所述艰难梭菌芽孢可以产生并纯化。
2. 准备在X + 1毫升，其中X是在测定期间要采取的样本数萌发溶液。
   注意:萌发溶液是特定细菌的物种孢子正在研究中。用于测定C.难辨孢子萌发，我们使用的10mM Tris（pH值7.5），150毫摩尔NaCl，在去离子水中的100mM甘氨酸和10mM牛磺胆酸的溶液。
3. 在开始测定前，画出萌发溶液中的1.0 ml样品无孢子作为皮质片段检测空白。
4. 加入孢子的外径〜3.0发芽解决方案，并迅速涡旋_600。
   注意:如果您在B.萌发研究枯草芽孢杆菌 ，我们使用相同的外径₆00孢子为C.难辨 。
   注:孢子这一数额C.期间行之有效的监测皮质片段发布难辨孢子萌发。孢子在该试验中所使用的量应通过实验为每个细菌或应变来确定。
5. 在14000×g下加入孢子和离心机在室温下1分钟后，立即删除在1.2 ml样品。这是在零时间点。
6. 传送将1.0ml上清液从离心样品到新管用于随后皮质片段分析。
   注意:如果DPA需要监控，取出一个单独的100微升样品在使用....

结果

表1示出了使用NAG标准的典型结果。数据被用于产生标准曲线。 表2示出从发芽缓冲器萌发测定补充有100mM的甘氨酸和10mM TA（发芽促进条件）或100mM的甘氨酸只（非发芽条件）的典型结果。在不存在TA，C的艰难梭菌芽孢不发芽并且在皮质片段在溶液中存在的小的变化。然而，在这两个TA和甘氨酸，C的存在艰难梭菌芽孢发芽并释放皮质片段在溶液中。这被观察为在反应样品的时间的增加的OD _585。该测定过程中释放皮质片段（纳摩尔）的总量，使用类似于图1B的标准曲线来计算。在该试验中，大部分的皮质的水解（或释放）为15分钟后开端曝光，这表明大部分孢子在这个时间帧已发芽（ 图2;与先前出版物⁷一致）。

显影在彩色试.......

讨论

在刺激时，进行发芽的过程孢子丧失其抗损伤性，而无需大分子合成。当孢子萌发被触发时，孢子释放核心DPA，以换取水^2。由于休眠孢子的高DPA含量，孢子核心是在强烈渗透压和专门肽，皮质，有助于防止芯从通过作用，据推测，作为屏障，以扩张²肿胀。

上述的方法使用艾氏试剂（黄色溶液），以检测还原糖作为可测量的移位到紫色色调的存在。期间皮质水解，NAG和NAM糖解放（取决于水解酶的程度，糖类可以解放如二糖或多糖）。由盐酸（步骤2.1）的糖苷键的水解与自由还原端⁷产生单糖。 neutraliz后用等量的氢氧化钠（步骤2.5）ING酸，包围NAG醇类和NAM单糖是由乙酸酐酰化（步骤^2.6）13。接着，未反应的乙酸酐是通过加热样品（步骤2.8）转化为乙酸。由于假设由摩根和埃尔森^20，终端醛自发地转化为烯醇式。在碱性条件下（步骤2.10），此烯醇形式可以与相邻的乙酰反应以产生其中用Ehrlich试剂（步骤4.3），以产生紫色^15,20反应的恶唑衍生物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2.0 ml 螺帽管	USA scientific	1420-3700
p1000 Eppendorf pipet	Eppendorf
p200 Eppendorf pipet	Eppendorf
p20 Eppendorf pipet	Eppendorf
100 - 1,250 μl 移液器吸头	VWR	89079-486
1 - 200 μll 移液器吸头	VWR	89079-458
N-乙酰基-D-氨基葡萄糖	Sigma	A3286-25G
盐酸 - 10 N	BDH-Aristar	BDH3032-3.8LP
乙酸酐	Alfa Aesar	L04295
碳酸氢钠	BDH	BDH0280-500G
四硼酸钾 四水合	Alfa Aesar	39435
氢氧化钠	BDH	BDH8019-500G
4-（二甲氨基）苯甲醛	Sigma	156477-100G
饱和酚	Fisher	BP1750-400
2-巯基乙醇	Aldrich	M6250-100ML
SpectraMax M3	Molecular Devices
冰醋酸	BDH	BDH3098-3.8LP
加热循环水浴	VWR Scientific	Model 1136
Microtest 96	Falcon	353072	96 孔透明组织培养板
培养管	VWR	89000-506
冻干机
加热块
涡旋机