本文介绍了一种比色法，用于检测细菌芽孢萌发过程中还原糖的存在。
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摘要
摘要
越来越多的研究发现，Clostridium difficile 及其他梭菌属（Clostridia）细菌的内生孢子萌发过程与模式产孢细菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）存在差异。孢子萌发由小分子萌发剂触发，且无需大分子合成。尽管芽孢杆菌属（Bacillus）和梭菌属（Clostridium）物种在孢子萌发机制上存在差异，但两者均需水解类似肽聚糖的皮层结构，从而使孢子核心膨胀并重新水合。重新水合后，代谢活动得以启动，并最终导致营养细胞的萌发生长。在孢子萌发过程中检测水解后的皮层片段可能较为困难，而对先前所描述检测方法的修改也可能令人困惑或难以重复。因此，基于我们近期使用该检测方法的研究报告，本文详细阐述了一种在细菌孢子萌发过程中通过比色法检测皮层片段的逐步操作方案。
引言
芽孢是细菌的一种代谢休眠形态，使细菌能够在不利环境中长期存活。在许多产孢细菌中，芽孢形成通常由营养缺乏诱导，但该过程也可能受到pH变化、氧气暴露或其他应激因素的调控1。处于代谢休眠状态的芽孢对紫外线辐射、干燥、高温和冷冻具有很强的抗性2。目前关于芽孢形成过程的大部分知识来源于模式生物Bacillus subtilis的研究。芽孢形成始于DNA复制和轴丝结构的形成3,4。随后形成不对称隔膜，将细胞分裂为两个大小不等的区室。较大的区室（母细胞）将较小的区室（前孢子）完全包裹。母细胞与前孢子协同调控基因表达，促使芽孢成熟，最终母细胞裂解，将休眠芽孢释放到周围环境中1。
孢子的结构和组成在多种细菌物种中是保守的。孢子核心的含水量低于营养细胞，并富含吡啶二羧酸（DPA）1,2。在孢子形成过程中，DPA被泵入孢子核心，同时置换出水分。核心外围为内层孢子膜，在大多数产孢细菌中，识别可触发萌发（萌发剂）的小分子的受体就位于此膜上2。紧邻孢子内膜外侧是一层细胞壁肽聚糖。在细胞壁肽聚糖外侧，包围着一层特化的肽聚糖结构（皮层），其组成成分与细胞壁肽聚糖大部分相同［交替的N-乙酰葡萄糖胺（NAG）和N-乙酰胞壁酸（NAM）］。然而，皮层中约50%的NAM残基已被转化为胞壁酸-δ-内酯5,6。在孢子萌发过程中，这些胞壁酸-δ-内酯残基可被孢子皮层裂解酶（SCLEs）识别，从而使得皮层被降解（此过程对完成萌发至关重要），而细胞壁则不受影响。皮层外侧依次为外膜和多层外壳蛋白2。
控制萌发过程对形成孢子的细菌至关重要。当萌发受体与其相应的萌发剂相互作用时，萌发过程即被启动。2在许多形成芽孢的细菌中，这些萌发剂是氨基酸、糖类、核苷酸、离子或它们的组合。2. C. difficile 孢子萌发由特定胆汁酸的组合启动，[例如，牛磺胆酸（TA）] 和氨基酸（例如，甘氨酸）7-10尽管存在差异 C. difficile 萌发途径以及其他产孢细菌中研究的途径，例如 枯草芽孢杆菌， 所有情况的共同之处在于必须降解芽孢皮层，以允许营养细胞从萌发的芽孢中生长出来2,8皮层降解可通过SCLEs CwlJ/SleB（如在 枯草芽孢杆菌（B. subtilis） 或 SleC（在许多梭菌中存在）。皮层的水解作用减轻了对细胞壁和孢子的限制，从而允许核心充分再水合，这是重新激活细胞代谢所需多种蛋白质的必要步骤。 2.
当孢子萌发时，休眠的孢子会从相位明亮状态转变为相位暗淡状态，这一过程可通过在600 nm处的光密度（OD）变化来测量11。先前有报道称，OD的大部分变化是由于孢子释放了吡啶二羧酸（DPA）所致12。在我们最近的研究中，旨在比较C. difficile孢子萌发的时间进程，并监测DPA和皮层片段的释放情况9。在本研究中，关键是要在萌发孢子刚开始释放皮层片段时就对其进行监测。
此处使用的比色测定法基于Ghuysen建立的检测具有还原末端糖类的方法 等.13. 由于已有其他研究者描述了还原糖的检测方案14 或已修改了这些方案15，关于这一主题的文献可能令人困惑。本文中，我们详细描述了一种比色法检测萌发过程中释放的还原糖的分步方法 C. difficile 孢子。尽管本研究使用 C. difficile 孢子，该方案可检测其他产孢细菌的孢子萌发过程中释放的还原糖9,16,17.
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方案
1. 样品制备
- 将 C. difficile 芽孢在 65 °C 下热激活 30 分钟，然后置于冰上保存。
注意：C. difficile 芽孢的制备与纯化可参照先前描述的方法7,9,10进行。 - 配制萌发溶液，体积为 X + 1 ml ，其中 X 为实验过程中需采集的样品数量。
注意：萌发溶液的组成取决于所研究的细菌芽孢种类。在检测 C. difficile 芽孢萌发时，我们使用含有 10 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、100 mM 甘氨酸和 10 mM 牛磺胆酸的去离子水溶液。 - 开始实验前，取 1.0 ml 不含芽孢的萌发溶液作为检测皮层片段的空白对照。
- 将芽孢加入萌发溶液中，使 OD600 达到约 3.0，并迅速涡旋混匀。
注意：在进行 B. subtilis 芽孢萌发研究时，我们使用的芽孢 OD600 值与 C. difficile 相同。
注意：该浓度的芽孢适用于监测 C. difficile 芽孢萌发过程中皮层片段的释放。本实验中芽孢的用量应根据不同的细菌或菌株通过实验确定。 - 加入芽孢后立即取 1.2 ml 样品，在室温下以 14,000 × g 离心 1 分钟。此为零时间点样品。
- 将离心后样品的 1.0 ml 上清液转移至新管中，用于后续皮层片段分析。
注意：若需监测 DPA，应另取 100 μl 样品，采用基于铽荧光的检测方法测定溶液中 DPA 的含量9,18,19。 - 将收集的样品在 -80 °C 下冷冻保存。
- 以固定时间间隔重复步骤 1.4 和 1.5，直至完成所有时间点的取样。
注意：由于离心和取样所需时间限制，实验过程中无法实现间隔小于 2 分钟的时间点采集，因此我们的取样间隔为每 2 分钟一次，持续 14 分钟。 - 作为还原糖检测与定量的阳性对照，设置以下浓度的 N-乙酰葡萄糖胺（nmol）：0、12.5、25、50、100、250、500 和 5,000。这些样品应与皮层片段样品同时制备，并一同检测，以确保标准曲线与萌发芽孢产生的数据具有相关性。
- 所有时间点样品收集完毕后，对样品进行冻干处理。
注意：我们使用 2 ml 螺口管对样品进行冻干。
2. 测量皮层片段
- 将冻干样品重悬于 120 µl 含 1% 苯酚和 0.5% β-巯基乙醇的 3 N HCl 溶液中。
- 将重悬后的样品转移至 2 ml 螺口管中。
注意：为确保实验可重复性，请确保所有冻干样品均完全重悬并转移。 - 在 95 °C 循环水浴中孵育样品 4 小时。
- 孵育结束后，将样品置于冰上冷却至低温。
- 用 120 µl 的 3 M NaOH 中和样品。
- 向每个样品中加入 80 µl 饱和碳酸氢钠溶液和 80 µl 5% 乙酸酐溶液，涡旋混匀。
- 在室温下孵育样品 10 分钟。
- 将样品重新放入 95 °C 水浴中，精确孵育 3 分钟。
注意：此步骤对时间敏感，孵育时间过长可能影响后续信号的生成。 - 从水浴中取出样品，立即置于冰上冷却。
- 向每支试管中加入 400 µl 6.54% K2B4O7·4H2O 溶液，涡旋混匀。
- 在 95 °C 循环水浴中孵育样品，精确持续 7 分钟。
注意：此步骤对时间敏感，孵育时间过长可能影响后续信号的生成。 - 取出样品，置于冰上放置 5 分钟。
3. 显色试剂
- 在样品置于冰上时（步骤 2.12），配制显色试剂。将 0.320 g 的 p-二甲基氨基苯甲醛（DMAB；Ehrlich 试剂）溶于 1.9 ml 冰醋酸中。
注意：该试剂对时间、温度和光敏感，不应提前配制。 - 待 DMAB 完全溶解后，加入 100 µl 10 N HCl 并涡旋混匀。
- 加入 5 ml 冰醋酸并涡旋混匀。
4. 比色反应
- 将每份冷却的大脑皮层样品各取 100 µl 转移至新的 1.5 ml 微量离心管中。
- 向每份样品中加入 700 µl 新鲜配制的显色液。
- 立即将样品放入 37 °C 水浴中，准确孵育 20 分钟。
- 将每份样品中的 200 µl 转移至透明的 96 孔板中。
- 使用酶标仪在 585 nm 波长下定量检测样品。样品初始颜色为黄色，阳性反应会变为紫色。皮层组织越多，紫色越深。
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结果
表1展示了使用NAG标准品的典型结果。这些数据用于生成标准曲线。表2展示了在添加了100 mM甘氨酸和10 mM TA（促进萌发条件）或仅添加100 mM甘氨酸（非萌发条件）的萌发缓冲液中进行萌发实验的典型结果。在无TA存在时，C. difficile芽孢不萌发，溶液中皮层片段的含量几乎无变化。然而，在同时存在TA和甘氨酸的情况下，C. difficile芽孢发生萌发，并将皮层片段释放到溶液中。这一过程表现为反应样品在585 nm处的光密度（OD585）随时间逐渐升高。本实验中释放的皮层片段总量（nmol）通过类似于图1B的标准曲线计算得出。在该实验中，大多数皮层在萌发剂处理后15分钟内已被水解（或释放），表明在此时间范围内大多数芽孢已完成萌发（图2；与先前发表的研究结果一致7）。
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讨论
在受到刺激后，处于萌发过程中的孢子会失去其抗性特性，且此过程无需大分子合成。当孢子萌发被触发时，孢子核心会释放吡啶二羧酸（DPA），并吸收水分以进行交换2。由于休眠孢子含有大量的DPA，孢子核心处于强烈的渗透压之下，而特化的肽聚糖结构——皮层——则通过充当限制膨胀的屏障，帮助防止核心吸水膨胀2。
上述方法利用 Ehrlich 试剂（一种黄色溶液）检测还原糖的存在，通过可测量的紫红色变化进行判断。在皮质水解过程中，N-乙酰葡糖胺（NAG）和 N-乙酰胞壁酸（NAM）糖被释放出来（释放形式取决于水解酶的作用程度，可能以二糖或多糖形式存在）。盐酸（步骤 2.1）水解糖苷键后，生成具有游离还原端的单糖7。用等量氢氧化钠中和酸（步骤 2.5）后，NAG 和 NAM 单糖周围的羟基被乙酸酐酰化（步骤 2.6）13。随后，通过加热样品使未反应的乙酸酐转化为乙酸（步骤 2.8）。根据 Morgan 和 Elson 的假设20，末端醛基可自发转化为烯醇式结构。在碱性条件下（步骤 2.10），...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目由美国国家过敏与传染病研究所资助，资助编号为5R01AI116895。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国家过敏与传染病研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2.0 ml 螺口管 | USA scientific | 1420-3700 | |
| p1000 Eppendorf 移液器 | Eppendorf | ||
| p200 Eppendorf 移液器 | Eppendorf | ||
| p20 Eppendorf 移液器 | Eppendorf | ||
| 100 - 1,250 μl 移液器吸头 | VWR | 89079-486 | |
| 1 - 200 μl 移液器吸头 | VWR | 89079-458 | |
| N-乙酰-D-葡萄糖胺 | Sigma | A3286-25G | |
| 盐酸 - 10 N | BDH-Aristar | BDH3032-3.8LP | |
| 乙酸酐 | Alfa Aesar | L04295 | |
| 碳酸氢钠 | BDH | BDH0280-500G | |
| 四硼酸钾四水合物 | Alfa Aesar | 39435 | |
| 氢氧化钠 | BDH | BDH8019-500G | |
| 4-(二甲氨基)苯甲醛 | Sigma | 156477-100G | |
| 饱和酚 | Fisher | BP1750-400 | |
| 2-巯基乙醇 | Aldrich | M6250-100ML | |
| SpectraMax M3 | Molecular Devices | ||
| 冰乙酸 | BDH | BDH3098-3.8LP | |
| 加热循环水浴锅 | VWR Scientific | Model 1136 | |
| Microtest 96 | Falcon | 353072 | 96 孔透明组织培养板 |
| 培养管 | VWR | 89000-506 | |
| 冷冻干燥机 | |||
| 加热金属块 | |||
| 涡旋振荡器 |
参考文献
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