在微重力条件下培养的人类肠黏膜多细胞三维类器官模型的构建

摘要

在三维（3-D）环境中生长的细胞相较于在二维（2-D）环境中培养的细胞具有显著改进例如，培养瓶或培养皿）。本文描述了一种在旋转壁式生物反应器（RWV）提供的微重力条件下培养的人类肠黏膜多细胞三维类器官模型的建立方法。

摘要

由于在三维（3-D）环境中生长的细胞有可能弥补二维（2-D）环境（例如，培养瓶或培养皿）中细胞培养的诸多不足。事实上，人们普遍认为，在培养瓶或培养皿中生长的细胞倾向于去分化，并丧失其来源组织的特化特征。目前，主要有两种类型的三维培养系统，其中细胞被接种到模拟天然细胞外基质（ECM）的支架中：（a）静态模型和（b）使用生物反应器的模型。首个突破是静态三维模型。使用旋转壁式生物反应器（RWV）等生物反应器的三维模型则是较新的发展。RWV生物反应器的最初概念于20世纪90年代初由美国国家航空航天局（NASA）约翰逊航天中心开发，被认为能够克服静态模型的局限性，例如缺氧和坏死核心的形成。RWV生物反应器可能通过提供流体动力学环境，促进营养物质和氧气的有效扩散，从而规避这一问题。这些生物反应器由一个旋转底座组成，用于支撑并旋转两种不同类型的培养容器，二者区别在于供气源类型：（1）中心带有同轴氧合器的慢转横向容器（STLVs），或（2）通过扁平硅橡胶气体交换膜供氧的高宽比容器（HARVs）。这些容器可在避免气泡形成及由此引起的湍流的同时，实现高效的气体交换。这些条件导致层流和极低的剪切力，从而在培养容器内模拟出低重力（微重力）环境。本文描述了一种由肠上皮细胞系以及原代人淋巴细胞、内皮细胞和成纤维细胞共同构成的多细胞三维类器官模型，用于模拟人类肠黏膜，其在RWV生物反应器提供的微重力条件下进行培养。

引言

20世纪80年代初，科学家开始研究不同类型的支架，由此实现了构建三维模型的首次突破例如层粘连蛋白、I 型胶原、IV 型胶原和纤连蛋白）以及生长因子混合物，以增强细胞间及细胞外基质的相互作用 "静态" 3-D 模型^1-7此后，这些模型面临的主要问题在于培养基和组织构建物内部营养物质和氧气的传递受限⁸与……中的细胞相反 体内 环境从周围血管网络持续获得营养物质和氧气，但这些模型的静态特性阻碍了营养物质和氧气向细胞的有效输送。例如，在静态条件下生成的细胞聚集体 体外 尺寸超过几毫米的静态模型 invariably 会形成缺氧、坏死的核心⁹RWV 生物反应器可能通过提供有利于营养物质和氧气高效扩散的流体动力学条件来规避这一问题 ^10-12然而，迄今为止，使用RWV生物反应器的研究仅限于包含一种或两种细胞类型 ^13-17此外，这些细胞并未形成与天然组织相似的空间取向，而是聚集成团。造成这些局限性的主要原因在于缺乏能够以整合方式容纳细胞的支架。迄今为止，在RWV生物反应器中使用的支架大多如此，仅有少数例外 ^16-18，主要为合成微珠、管状圆柱体或小片状材料 ^13-15,19-23这些是刚性材料，其成分和柔韧性无法调节，细胞仅能附着在其表面。因此，这些模型不太可能提供一个能够以整合方式评估各种细胞组分（如基质细胞）的系统。<....

方案

伦理声明：所有血液样本均采集自参与编号为 HP-00040025-1 研究方案的志愿者。本研究方案已获得马里兰大学机构审查委员会批准，授权从健康志愿者中采集血液样本，用于本文所述的各项研究。在采血前，已向志愿者说明本研究的目的，所有志愿者均在知情同意后签署同意书。

注：培养基添加剂的配制方法见表1；3-D培养基的配制方法见表2。

1. 培养容器的准备

1. 拧开50 ml容器加液口的盖子，加入50 ml无菌培养基例如，RPMI）。所有操作均须在超净工作台中无菌条件下进行。
2. 盖上瓶盖，并用70%乙醇擦拭任何表面洒出的培养基。
3. 让容器在室温下孵育至少15分钟至过夜。
4. 使用灌注口弃去培养基，并加入30 ml 3-D培养基。
5. 用70%乙醇擦拭任何表面上洒出的培养基。

2. 细胞的制备

1. 人上皮细胞系（HCT-8)^24,40.
   1. 在添加了100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素、50 µg/ml庆大霉素、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、10 mM HEPES缓冲液和10%热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI培养基中培....

结果

此前，我们构建了一种由肠上皮细胞系与原代人淋巴细胞、内皮细胞和成纤维细胞组成的多细胞三维类器官模型，用于模拟人肠黏膜结构，该模型在微重力条件下进行培养²⁴（图 1）。成纤维细胞和内皮细胞被包埋于富含其他肠道基底膜蛋白的I型胶原基质中⁴⁵（即层粘连蛋白、IV型胶原、纤连蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖），并接种于RWV生物反应器中。培养10至15天后，组织学染色分析显示，构建物中形成了类似绒毛的结构。其中约60%至80%的上皮细胞排列为单层极化细胞，细胞核位于靠近细胞外基质（ECM）的基底部，这是高度分化细胞的主要特征之一（图 2）。

讨论

在本研究中，我们描述了一种由多种细胞类型构成的人类肠黏膜生物工程模型的构建，这些细胞类型包括原代人类淋巴细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及肠上皮细胞系²⁴。在该三维模型中，细胞在富含胶原蛋白的细胞外基质中培养，并处于微重力条件下²⁴。

如前所述，该模型的主要特征包括：（i） 能够模拟上皮组织单层结构的排列，（ii） 诱导上皮细胞形成适当的极性，并形成紧密连接、桥粒和微绒毛，（iii） 长期培养（长达20天）并保持原代细胞（即，成纤维细胞和内皮细胞）的高存活率，（iv） 表达类似组织的分化标志物，包括绒毛蛋白（villin）、细胞角蛋白（cytokeratin）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）和黏蛋白（mucin），（v） 在抗原刺激下能够产生大量细胞因子（例如，IL-8）和碱性磷酸酶，（vi） 营养物.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
四轴旋转/独立旋转壁式生物反应器（RWV）	Synthecon	RCCs-4DQ	适用于最多4个容器。也可提供容器数量更多或更少的型号。
一次性50 ml容器	Synthecon	D-405	含4个容器的盒子
HCT-8 上皮细胞	ATCC	CCL-244
CCD-18Co 成纤维细胞	ATCC	CRL-1459
人脐静脉内皮细胞	ATCC	CRL-1730	HUVEC
碱性成纤维细胞生长因子	Sigma	F0291	bFGF
干细胞因子	Sigma	S7901	SCF
肝细胞生长因子	Sigma	H1404	HGF
内皮素3	Sigma	E9137
层粘连蛋白	Sigma	L2020	从小鼠Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤中分离
血管内皮生长因子	Sigma	V7259	VEGF
白血病抑制因子	Santa Cruz	sc-4377	白血病抑制因子（LIF）
腺嘌呤	Sigma	A2786
胰岛素	Sigma	I-6634
3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸	Sigma	T-6397	T3
霍乱毒素	Sigma	C-8052
纤连蛋白	BD	354008	从人血浆中分离
脱铁转铁蛋白	Sigma	T-1147
肝素	Sigma	H3149
硫酸乙酰肝素  蛋白聚糖	Sigma	H4777	从小鼠基底膜中分离  Engelbreth-Holm-Swarm 肿瘤
IV型胶原蛋白	Sigma	C5533	从人胎盘中分离
热灭活胎牛血清	Invitrogen	10437-028
D-MEM，粉末	Invitrogen	12800-017
10% 甲醛–PBS	Fisher Scientific	SF100-4
牛I型胶原蛋白	Invitrogen	A1064401
胰蛋白酶-EDTA	Fisher Scientific	MT25-052-CI
丙酮酸钠	Invitrogen	11360-070
庆大霉素	Invitrogen	15750-060
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140-122
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-081
Hepes	Invitrogen	15630-080
Ham's F-12	Invitrogen	11765-054
基础伊格尔培养基	Invitrogen	21010-046	生物医学工程
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
内皮细胞基础培养基	Lonza	CC-3156	EBM-2
内皮细胞生长补充剂	Millipore	02-102	心电图系统