生长在微重力人体肠道黏膜的多细胞三维器官模型的建立

Summary

细胞在三维（3-D）的环境中生长代表的2-D的环境中（ 例如 ，瓶或菜）在细胞培养的显着改进。这里，我们描述根据通过旋转壁上容器（RWV）生物反应器提供微重力培养人肠粘膜的多细胞三维器官模型的发展。

Abstract

因为在一个三维（3-D）的环境中生长的细胞具有弥合的2-D的环境中的细胞培养的许多间隙（ 例如 ，瓶或碗碟）的潜力。事实上，人们普遍认识到，在烧瓶或菜肴生长细胞倾向于去分化并失去其最初来源的组织的专门特征。目前，主要有两种类型的3-D培养系统的模拟天然细胞外基质（ECM），其中将细胞接种到支架:（一）静态模型和使用生物反应器（B）中的模型。第一个突破是静态的三维模型。使用生物反应器，如旋转壁上容器3-D模型（RWV）生物反应器是一个较新的发展。在RWV生物反应器的原始概念是美国宇航局约翰逊航天中心在90年代初开发的，被认为是克服静态模型的局限性，如缺氧，坏死核心的发展。该RWV生物反应器可以规避日是通过提供流体动力学，允许营养物和氧的高效的扩散问题。这些生物反应器组成，其用于支持和旋转培养容器的两个不同的格式，可以通过通气源类型而不同的转子碱:（1）缓慢车削外侧容器（STLVs）与在中心同轴氧合器，或（2通过一台，硅橡胶气体转移膜）高宽比容器（HARVs）与充氧。这些血管允许有效的气体传递，同时避免气泡形成和随之而来的湍流。这些条件导致在层流和最小的剪切力模型降低了培养容器内的重力（失重）。在这里，我们描述由RWV生物反应器提供了一种肠上皮细胞系和原代人淋巴细胞，微重​​力下培养的内皮细胞和成纤维细胞构成的人体肠道黏膜的多细胞三维器官模型的发展。</ P>

Introduction

在构建三维模型首次突破据报道，在80年代初，当科学家们开始研究不同类型的支架（ 例如 ，层粘连蛋白，胶原蛋白I型，Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白）和生长因子鸡尾酒改善细胞-细胞和的"静态"3-D模型^1-7的ECM相互作用。此后，随着这些模型的主要问题一直是在营养物质的传递和氧的介质和组织构建⁸内的限制。在对比中，其接收从周围的血管网络的营养素的稳定流量和氧的体内环境的细胞，这些模型的静态性质阻碍他们的向细胞的有效分配。例如，在体外静态模型生成大小超过几毫米细胞聚集体将总是开发缺氧，坏死芯件^9。该RWV生物反应器可以解决这个问题通过提供流体动力学，允许营养物和氧^10-12的有效扩散。然而，到目前为止，使用RWV生物反应器的工作已被限制为包含一种或两种的细胞类型^13-17。此外，代替类似于天然组织的空间取向，这些细胞形成细胞聚集体。这些限制的主要原因是缺乏能够把电池于一体的综合时尚支架。在RWV生物反应器迄今所使用的支架组成，除了少数例外^16-18，主要用于合成微珠，管状圆筒或小片^13-15,19-23的。这些是刚性的材料，其组成和灵活性不能被操纵，并且其中细胞附着到其表面上。因此，这是不可能的，这些模型将提供在其中评估系统，以综合的方式，（ 例如 ，成纤维细胞，免疫细胞和内皮细胞）的各种细胞成分如基质细胞那个SHOULD被支架内分散地模拟人体组织。

在这里，我们描述了一种肠上皮细胞系和原代人淋巴细胞，内皮细胞构成的人体肠道黏膜的多细胞三维器官模型的开发，和成纤维细胞^24。这些细胞培养微重力下的生物反应器RWV提供^13,25-30。在我们的3-D模型，则ECM具有许多不同的特性，例如类似培养基的重量摩尔渗透压浓度（ 例如 ，在培养过程中可以忽略的扩散限制），并掺入细胞和其它相关的细胞外基质蛋白的能力，以及在在生物反应器²⁴中使用适当的刚度。生物系统是非常复杂的，而且在过去的几年里，一直在研究黏膜对与周围环境细胞的相互作用的考试的重点的转变，而不是隔离和研究它们ñ。特别是，细胞-细胞相互作用的影响肠细胞的存活和分化的重要性是有据可查的^31-34。具体来说，上皮细胞和自己的优势之间的交流对上皮细胞扩增和分化³⁵深远的影响。事实上，它已被广泛接受，不仅细胞 - 细胞，而且细胞 - 细胞外基质相互作用是上皮细胞中的3-D培养模型的维持和分化至关重要。以前的研究已经表明，肠ECM蛋白如胶原蛋白I ^24,36,37，层粘连蛋白³⁸和纤连蛋白³⁹在影响肠上皮细胞获得类似于天然粘膜空间定向工具。因此，新技术的发展，象我们的3-D模型^24，可以模仿所需肠道的表型多样性如果研究人员打算重新创建复杂的细胞和结构建筑和肠道微环境的功能。这些模型表示在新的口服药物和疫苗候选的开发和评估的一个重要工具。

Protocol

伦理声明:从参与协议号HP-00040025-1志愿者收集的所有血液样本。马里兰机构审查委员会的批准大学的这个协议和授权的血液样本的收集从包括在这个手稿研究健康志愿者。这项研究的目的是解释志愿者，以及所有的志愿者给予知情，抽血前签署同意书。

注:请参阅表1为中补充的准备。 见表2为三维培养基的制备。

1.培养容器的制备

1. 旋50毫升容器的填充口的盖子，并用50毫升无菌培养基（ 例如 ，RPMI）填充。执行层流罩无菌条件下的所有程序。
2. 更换帽和擦拭溅出的培养基用70％乙醇在任何表面上。
3. 允许在容器到incub吃了至少15分钟，O / N在室温。
4. 使用填充端口丢弃培养基并加入30×3-D培养基。
5. 请用70％乙醇的任何表面上溅出的网上平台。

2.细胞的制备

1. 人类上皮细胞株^{（HCT-8）24,40。}
   1. 在RPMI培养细胞补充有100U / ml青霉素，100微克/ ml链霉素，50μg/ ml的庆大霉素，2mM的L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，10毫米的HEPES缓冲液和10％热灭活的小牛血清（FBS ）（ 补充1）。在70％汇合，分裂细胞以1:5的比例。
2. 人类结肠成纤维细胞（CCD-18Co细胞 ^）24,41。
   1. 培养的细胞在与补充1富集的基础的Eagle培养基在汇合，分裂细胞以1:1的比例:3。
3. 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞 24,42。
   1. 在内皮基础培养基（EBM）培养细胞培养基富含100微克/毫升肝素，3微克/毫升内皮细胞生长补充剂（ECGS），并补充1在70％汇合，分裂细胞以1:1的比例:2。
4. 淋巴细胞/单核细胞
   1. 通过使用标准技术⁴³密度梯度离心分离从血液的外周血单核细胞（PBMC）。
      1. 简要地说，用10毫升移液管，小心地加入30毫升稀释血（1:1血液:磷酸盐缓冲盐水（PBS）中）到含有10ml密度离心培养基的50ml圆锥形管中。离心步骤后，淋巴细胞和单核细胞将驻留在密度离心介质和等离子体层之间的"白"层。
      2. 收集用移液管白层。通过限制密度离心媒体的集合避免粒污染。洗完后^43，U本身作为PBMC或者是在_液态氮冷冻保存。
         注意:以突出的PBMC大体上是由淋巴细胞和单核细胞的，树突状细胞和其他细胞类型的一小部分是很重要的。
5. 成长标准培养条件下的所有细胞在37℃下在5％CO ₂的气氛中。

3.胶原包埋细胞的制备

1. 确定插入物的数量根据实验条件的号码需要加以设定。放置插入适当数量的成6孔板的孔中。
2. 制成悬浮液HUVEC和成纤维细胞的:
   1. 在PBS中洗烧瓶两次，并使用胰蛋白酶，0.25％（1×）用0.05％胰蛋白酶乙二胺四乙酸四（胰蛋白酶-EDTA）分离细胞。添加足够的胰蛋白酶溶液，以覆盖细胞培养表面面积的全部。支队通常在5发生15分钟
   2. 搜集分离的细胞在装有30ml Dulbecco改良的Eagle氏培养基（DMEM）30％FBS培养基的50毫升管。
   3. 离心管中，在500×g离心10分钟。
   4. 悬浮细胞在30ml的DMEM-30％FBS的培养基中。
   5. 通过稀释20微升悬浮细胞与20微升台盼蓝染料的计数存活细胞的总数。负载细胞混合物的血细胞计数器。可行的外周血单个核细胞将白清晰;没有自生能力PBMC将收购染料变成蓝色。
      1. 8×10 ⁷个细胞毫升^- -以5的浓度悬浮在DMEM-30％FBS培养基中的细胞类型^1。
3. 制备含细胞胶原凝胶
   注意:每个容器将需要约5毫升含细胞的胶原凝胶的制备。
   1. 在一个50毫升锥形管中加入1×DMEM培养基，补充有50微克/ ml庆大霉素，2mM的L-谷氨酰胺和10％热inactivat制备胶原混合物编FBS加3毫克/毫升的牛Ⅰ型胶原，10μg/ ml的层粘连蛋白，40微克/毫升IV型胶原，10μg/ ml的纤连蛋白，2微克/毫升硫酸肝素蛋白聚糖和15mM的NaOH（达到生理pH）。
   2. 关闭该管并且颠倒几次，直至混合物完全均匀混合。避免泡沫形成。
      重要提示:保持冰混合物，以防止凝胶化。
      1. 关键的步骤:如果混合物开发的酸性外观（淡黄色），添加无菌的1N NaOH几滴以中和该混合物。
   3. 加浓的HUVEC和成纤维细胞以1.0的密度- 1.2和1.5 - 2.0×10 ^6个细胞/ ml，分别向富含胶原混合物（如上所述）。关闭管和颠倒几次，直至混合物完全均匀混合。避免泡沫形成。重要提示:保持冰混合物，以防止凝胶化。
   4. 添加4 - 所述含细胞胶原5毫升凝胶每个插入，预先装入6孔板，并使其在通风橱中，很少或没有运动，以凝胶化1小时。
   5. 1小时后，在6孔板转移到37℃，5％CO ₂培养箱1 - 2小时。
   6. 返回6孔板的罩，并且用无菌镊子的帮助下，并从插入件分离从膜的含细胞​​凝胶手术刀无菌地切断该膜。切胶脱落成小方块（约5×5毫米）。
   7. 添加小含细胞平方到使用填充口的50ml HARV。
4. 制备悬浮液HCT-8的上皮细胞:
   1. 在PBS中洗烧瓶两次，并使用胰蛋白酶，0.25％（1×）用胰蛋白酶-EDTA处理分离细胞。添加足够的胰蛋白酶溶液，以覆盖细胞培养表面面积的全部。脱离通常为10至15分钟内发生。
   2. 收集分离的细胞在30毫升的DMEM-30％FBS的培养基中。
   3. CentrifUGE DMEM-30％FBS含管在500 XG 10分钟网上平台。
   4. 悬浮细胞在30ml的DMEM-30％FBS的培养基中。
   5. 如3.2.5所述计数存活细胞的总数。
   6. 重悬在DMEM-30％FBS的培养基中的HCT-8的上皮细胞以10 ⁷个细胞ml的浓度^{- 1。}
   7. 加入1毫升浓HCT-8上皮细胞进50毫升HARV使用填充口。
5. 通过使用填充口，添加额外的3-D培养基直到容器几乎满（约20毫升）中。
6. 更换盖和擦拭用70％乙醇的填充口的唇缘。
7. 放置一个注射器中的RWV的每个注射器端口:地方含有3 5ml的注射器 - 在一个端口4×3-D培养基，并在另一端口5ml的空注射器。
8. 通过拉入空注射器而大致介质的相同体积通过其它注射器口喷射除去任何可见的气泡。
9. 放置VESSELS在生物反应器中，打开电源，速度设定为每分钟约13至14转。
   注:关键步骤:旋转速率可能需要在实验期间进行调整几次，以保持在容器内旋转，从而避免了与该容器壁接触的细胞。
10. 培养细胞在37℃，微重力下，5％CO _2，由RWV生物反应器提供。
11. 改变培养基，每3 - 第4天用新鲜的3-D培养基更换约30毫升
12. 经过4天（±1天），请从生物反应器的船只，并添加淋巴细胞/单核细胞向血管（2×10 ⁷ /船）。
13. 放置血管回生物反应器中，在37℃，5％CO ₂的额外5天（±1天）。
14. （培养第9天）的另外5天后，添加淋巴细胞/单核细胞的容器（2×10 ⁷ /容器），并继续额外长达12天的培养物。
15. 改变培养基，每3 - 第4天用新鲜的3-D培养基更换约30毫升

为组织学4.收获3-D培养

1. 用移液管收获的援助每个小凝胶片段，现在称为"构建体，"到含有10ml的10％福尔马林缓冲液中的六孔板中。在RT留3小时或12 - 在4℃下16小时。
2. 用标签和加入活检泡沫垫两块到每个磁带准备组织处理和嵌入录像带。
3. 沉浸在10％福尔马林缓冲液卡匣。
4. 用钳子的帮助放置两个泡沫垫之间的固定结构。
5. 沉浸在10％福尔马林缓冲液卡匣。
6. 与嵌入，切片，染色和⁴⁴标准程序进行。

Results

先前我们已经设计了人肠黏膜包括肠上皮细胞系和原代人淋巴细胞，微重力条件下^24（ 图1）下培养的内皮细胞和成纤维细胞的多细胞三维器官模型。成纤维细胞和内皮细胞包埋在我矩阵附加肠基底膜蛋白^45（ 即 ，层粘连蛋白，胶原蛋白IV，纤连蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖）富含胶原，并加入到RWV生物反应器。经过10 - 15天，组织染色分析表明绒毛样结构中的构建体的存在。约60 -这些上皮细胞的80％被组织成极化的细胞与位于在ECM，它是分化良好的细胞（ 图2）的一大特征附近的基底位置的核的一个单层。

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图1:3-D模型的构建图 。四个步骤是需要建立的3-D系统。首先，为了得到所需数量的...

Discussion

在这个手稿，我们描述了人肠黏膜由倍数细胞类型，包括原代人淋巴细胞，成纤维细胞和内皮细胞，以及肠上皮细胞系²⁴的生物工程化的模型的开发。在这个3-D模型，细胞在富含胶原蛋白的细胞外基质中的微重力条件下²⁴培养。

如先前所描述，该模型的主要特征是:（i）以模仿上皮组织单层组织的能力，（ⅱ）上皮细胞，紧密连接，桥粒和微绒毛的适当极性的诱导，（ⅲ）一个长长期培养（最多20天）用初级细胞的高存活率（ 即 ，成纤维细胞和内皮细胞），（四）中的表达的组织样分化标志物包括绒毛蛋白，细胞角蛋白，E-钙粘蛋白和亩霉素，（五）的能力，以产生相当大量的细胞因子（ 例如 ，IL-8）和在抗原刺激碱性磷酸酶，（ⅵ）营养物如葡萄糖（ 即 ，二糖酶的表达的运输，和糖的存在转运），和（vii）

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
四旋转器/独立旋转壁容器 （RWV） 生物反应器	Synthecon	RCCs-4DQ	最多可容纳 4 个罐体。也可提供带有更多或更少容器的型号。
一次性 50 ml 血管	Synthecon	D-405	盒，含 4 个血管
HCT-8 上皮细胞	ATCC	CCL-244
CCD-18Co 成纤维细胞	ATCC	CRL-1459
人脐静脉内皮细胞	ATCC	CRL-1730	HUVEC
成纤维细胞生长因子-基础	Sigma	F0291	bFGF
干细胞因子	Sigma	S7901	SCF
肝细胞生长因子	Sigma	H1404	HGF
内皮素 3	Sigma	E9137
层粘连蛋白	Sigma	L2020	从小鼠 Engelbreth-Holm-Swarm 肿瘤
内皮生长因子中分离	Sigma	V7259	VEGF
白血病抑制因子	Santa Cruz	sc-4377	（LIF
腺嘌呤	Sigma	A2786
胰岛素	Sigma	I-6634
3,3'，5-三碘-L-甲状腺原氨酸	Sigma	T-6397	T3
霍乱毒素	Sigma	C-8052
纤连蛋白	BD	354008	从人血浆
中分离的载脂蛋白-转铁蛋白	Sigma	T-1147
肝素	Sigma	H3149
硫酸乙酰肝素  蛋白多糖	Sigma	H4777	从小鼠基底膜中分离 Engelbreth-Holm-Swarm 肿瘤
胶原蛋白 IV	Sigma	C5533	从人胎盘中分离
热灭活胎牛血清	Invitrogen	10437-028
D-MEM，粉末	Invitrogen	12800-017
10% 福尔马林–PBS	Fisher Scientific	SF100-4
牛 I 型胶原蛋白	Invitrogen	A1064401
胰蛋白酶-EDTA	Fisher Scientific	MT25-052-CI
丙酮酸钠	Invitrogen	11360-070
庆大霉素	Invitrogen	15750-060
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140-122
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-081
Hepes	Invitrogen	15630-080
火腿F-12	Invitrogen	11765-054
基础培养基 Eagle	Invitrogen	21010-046	BME
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
内皮细胞基础培养基	Lonza	CC-3156	EBM-2
内皮细胞生长补充剂	Millipore	02-102	心电图