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方法文章

新生小鼠脑室内及血管内注射病毒颗粒与荧光微珠

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DOI：

10.3791/54164

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2016年7月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Regenerative & Infectious Pathology, Hamamatsu University School of Medicine, 2First Department of Medicine, Hamamatsu University School of Medicine, 3Faculty of Health Science, Tokoha University

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种向新生小鼠脑内进行脑室内和血管内注射病毒颗粒或荧光微珠的简单方法。通过显微镜观察或 原位 杂交。

摘要

在研究病毒性脑炎的发病机制时，感染途径至关重要。进入大脑的两种主要感染途径之一是血行途径，该途径涉及感染脑部的内皮细胞和周细胞；另一种是脑室内（ICV）途径。一旦进入中枢神经系统（CNS），病毒可通过脑脊液扩散至蛛网膜下腔、脑膜和脉络丛。在实验模型中，中枢神经系统内病毒分布的最早阶段尚未被充分阐明，尚不清楚是否仅有特定细胞在初始阶段被感染。本文中，我们分析了在新生小鼠脑内经脑室内（ICV）或血管内（IV）注射后，急性感染期（即原发性病毒血症阶段）巨细胞病毒（CMV）颗粒的分布情况。在ICV注射模型中，使用10 µl注射器配27 G针头，将5 µl小鼠巨细胞病毒（MCMV）或荧光微珠注射至耳眼连线中点处的侧脑室。在IV注射模型中，使用1 ml注射器配35 G针头，通过透射光源可视化新生小鼠浅表颞（面部）静脉，并向该静脉注入50 µl MCMV或荧光微珠。注射后在不同时间点采集脑组织，采用以下方法检测MCMV基因组 原位 杂交方法。通过荧光显微镜观察荧光微珠或表达绿色荧光蛋白的重组MCMV颗粒。这些技术可应用于多种其他病原体，以研究脑炎的发病机制。

引言

在研究病毒性脑炎时，病毒颗粒的初始分布对于理解疾病发病机制以及确定病毒在脑内的靶细胞至关重要。大多数病毒的大小在20至300 nm之间，尽管潘多拉病毒（Pandoravirus）的尺寸可超过700 nm1。在感染急性期，病毒颗粒的分布可能取决于颗粒大小、细胞受体的分布或细胞受体对病毒的亲和力。在动物模型中，已采用脑室内（ICV）、腹腔内、直接胎盘内和静脉内（IV）感染等方式来研究病毒性脑炎的发病机制。通过ICV途径接种病毒常用于在小鼠中建立中枢神经系统（CNS）感染。使用该技术的研究报道显示感染范围广泛，尤其累及脑室周围区域以及直接与脑脊液（CSF）接触的脑区细胞，类似于病毒性脑室脑炎的表现。腺相关病毒（AAV）颗粒体积较小（直径20–25 nm），有助于其在ICV感染后在整个脑组织中扩散2–4。腹腔内5、直接胎盘内6和静脉注射7属于血源性全身给药方式。病毒颗粒穿过血脑屏障（BBB）后可进入新生脑实质，表现为弥散性小胶质细胞结节8,9。

巨细胞病毒（CMV）是一种属于疱疹病毒科的常见病毒。在美国，到40岁时，50%至80%的人群曾感染过CMV。CMV感染通常无害，但可在免疫功能低下患者及胎儿中引起疾病。在所有分娩中，有0.2%至2%的新生儿患有先天性CMV感染10，导致小头畸形、室管膜周围钙化、小脑发育不全、小眼球、视神经萎缩等严重症状11,12。此外，约10%的非致死性CMV感染婴儿会出现智力障碍、感音神经性听力损失、视觉缺陷、癫痫发作和癫痫等后遗症13,14。中枢神经系统功能障碍是先天性CMV感染最常见的特征性表现。每年因先天性CMV导致永久性残疾的儿童数量超过唐氏综合征、胎儿酒精综合征或脊柱裂所导致的残疾人数15。目前尚无可用的CMV疫苗，因此迫切需要开发安全有效的疫苗。研究CMV颗粒在感染最初阶段与其受体的相互作用，对于理解疫苗的作用机制具有重要意义。

室管膜脑炎和弥漫性小胶质细胞结节是巨细胞病毒性脑炎的两种主要病理特征16。目前尚不清楚在感染急性期，巨细胞病毒颗粒（150 - 300 nm）如何在脑内扩散，以及细胞受体的分布及其对病毒的亲和力如何影响病毒的传播。Kawasaki et al. 从感染最早期阶段病毒颗粒及其受体（β1整合素）分布的角度，评估了脑室内（ICV）和静脉内（IV）感染的情况。我们发现，在ICV和IV感染的最早期阶段，巨细胞病毒颗粒的播散与β1整合素的表达具有良好的相关性8。ICV感染是室管膜脑炎的模型，而IV感染是弥漫性小胶质细胞结节的模型。研究病毒颗粒或荧光颗粒的动态行为，将有助于了解颗粒大小、病毒与细胞受体的相互作用以及病毒穿透血脑屏障的机制。以下方案可用于研究中枢神经系统中的任何病毒感染及病毒载体。

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方案

所有实验方案均获得滨松医科大学动物护理委员会的批准。

1. MCMV（Smith株）及重组M32增强型绿色荧光蛋白（EGFP）-MCMV的制备

  1. 根据以下方法（1.2 - 1.9）及先前所述方法，生成重组M32-EGFP-MCMV8.
  2. 使用源自野生型MCMV Smith株（登录号：U68299）的重组病毒。将EGFP（4,361个碱基对；bp）插入至37,089至41,450 bp之间（M32 - M31 通过同源重组在MCMV基因组中定位基因座（locus）。
  3. 通过聚合酶链式反应扩增MCMV M32 (41,450 - 39,286 bp，左侧侧翼序列和 M31 （37,089 - 39,246 bp，右侧侧翼序列基因位点，使用以下引物： M32，5′-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3′（正向引物），5′-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3′（反向引物）； M31，5′-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3′（正向引物），5′-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3′（反向引物）。
  4. 插入 M32 使用 NheI 和 BamHI 限制性酶切位点将目的片段插入 EGFP 表达载体中。插入 M31 位点插入到 M32-EGFP-使用 AflII 和 XbaI 位点切割重组质粒。 M32-EGFP-M31 使用 NheI 和 AflII 酶切序列 M32-EGFP-M31 重组质粒并溶于H2O.
  5. 在感染MCMV（Smith株）后24小时（hpi），使用电穿孔系统将切割后的质粒转染至NIH3T3细胞的细胞核中，以诱导同源重组。
  6. 感染后第3天，将细胞与未感染的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）按1/1,000的比例在六孔板中进行共培养，并筛选表达EGFP的感染细胞集落。
  7. 从含有绿色荧光灶的孔中收集含病毒的上清液，并进行十倍稀释。用于纯化时，应选择呈现单个绿色荧光灶的孔。
  8. 当有限稀释感染产生的所有病灶均显示EGFP表达时，表明病毒制备物已纯化，无野生型病毒残留。采用此前所述的噬斑测定法对病毒进行定量。17.
  9. 在生物安全二级实验室的认证生物安全柜中操作MCMV，操作时需佩戴手套和口罩。
  10. 传代MCMV（Smith株）及重组MCMV于源自12日龄ICR小鼠胚胎的MEF细胞中制备，方法如前所述17.
  11. 通过在16 °C下以3,000 × g离心20分钟，从感染的MEF培养物上清液中去除细胞。
  12. 将上清液在70,000 × g条件下超速离心40分钟。用1 ml Tris缓冲盐水重悬含有病毒颗粒的沉淀，并转移至预形成的线性山梨醇梯度（25% – 70%）上。再次于70,000 × g超速离心 g 60 分钟18.
  13. 用注射器收集含有病毒颗粒的条带。将收集的病毒颗粒在70,000 × g条件下进一步超速离心40分钟，以获得病毒沉淀。
  14. 将沉淀重悬于1 ml磷酸盐缓冲液（PBS）中，于-80 °C保存，直至进行感染实验。
  15. 采用此前所述的噬斑试验法测定病毒滴度19.
  16. 通过荧光显微镜观察重组MCMV颗粒的EGFP表达（激发波长489 nm，发射波长508 nm）图1A以及通过透射电子显微镜（TEM）观察颗粒结构8 (图1B).

2. 罗丹明红荧光微球的制备

  1. 购买羧基荧光尼罗红微珠，根据直径将500 µl微珠分装至离心管中（0.04 - 0.06 µm，约3.63 × 1012 粒子；0.1 - 0.3 µm，约5.75 × 1010 粒子；1.7 - 2.2 µm，约6.85 × 107 粒子）。
  2. 用500 µl的0.1 M NaOH处理微珠约1天，以去除任何内毒素，随后在室温下将微珠重悬于无菌水中。
  3. 使用前，在室温下用取自C57BL/6小鼠的10%小鼠血清对微珠进行过夜吸附处理。
  4. 为分离聚集体，使用前需充分涡旋并超声处理微珠。

3. 新生小鼠脑室内注射MCMV和荧光微珠

  1. 将怀孕的ICR小鼠饲养在温度受控、12小时光照/12小时黑暗循环的动物设施中。出生当天记为P 0.5。
  2. 用70%酒精对10 µl注射器和27 G 针头进行消毒。
  3. 通过缓慢拉动注射器活塞，将含有MCMV或荧光微珠的注射液（5 µl）吸入针头中。
  4. 将新生小鼠（P 0.5）置于冰上3–4分钟以进行固定。待动物进入麻醉状态后，采用脚趾夹捏反应法判断麻醉深度。
  5. 使用无毒实验室记号笔标记注射位点，位置约为矢状缝外侧0.7–1.0 mm，前囟后方0.7–1.0 mm处（图2A）。
  6. 在标记的注射位点，将针头垂直刺入颅骨表面以下2 mm深度。作为参考，可用无毒记号笔在针尖起始处2 mm位置做标记。
  7. 缓慢将5 µl MCMV（约5 × 105 PFU）注入侧脑室，无需切开头皮（图2B）。
  8. 在另一组小鼠中，采用相同方法注射含荧光微珠（0.1–0.3 µm，约5.75 × 108个颗粒）的5 µl溶液。
  9. 停止推动活塞后10–20秒内缓慢拔出针头，以防止液体回流。
  10. 将小鼠置于温暖容器中恢复5–10分钟，直至其活动能力和整体反应性恢复正常。
  11. 按照第5节所述方法，在注射后不同时间点（3、12、24、48和72小时）取脑组织。

4. 新生小鼠的MCMV或荧光微珠静脉注射

  1. 将新生小鼠（出生0.5天）置于冰上3–4分钟以进行固定。
  2. 使用带有35 G针头的1 ml注射器，对出生0.5天的新生小鼠进行静脉注射MCMV。
  3. 使用透射光源（静脉显像仪）观察浅表颞部（面部）静脉。注射前，用外科胶带将新生小鼠固定在透射光源装置上（图2C）。
  4. 佩戴放大镜（1.5倍）的情况下，缓慢将50 µl的MCMV（约5.45 × 109 粒子）或荧光微珠（0.04–0.06 µm，约3.63 × 1011 粒子；0.1–0.3 µm，约5.75 × 109 粒子；1.7–2.2 µm，约6.85 × 106 粒子）注入浅表颞静脉（图2D）。
  5. 拔出针头后，使用含70%酒精的纱布按压注射部位，直至出血停止。
  6. 将新生小鼠置于温暖容器中约5分钟，待其恢复后再放回鼠笼。
  7. 按照第5节所述方法，在注射后不同时间点（3、12、24和72小时）取脑组织。

5. 石蜡切片用脑组织样本的制备

  1. 将注射后的新生鼠置于小型塑料培养皿中 置于碎冰上。
  2. 动物麻醉后，使用脚趾夹捏反应法评估麻醉深度。
  3. 通过肋骨笼进行一次中央或两次末端的水平切割，以打开胸腔。
  4. 用锋利的剪刀在心房处剪开切口。将4%多聚甲醛（PFA）溶液注入心房。当观察到自发性运动（PFA舞蹈）和肝脏颜色变浅时，停止灌注。无需放血。
  5. 解剖新生个体（如前所述）20用剪刀剪去头部。
  6. 沿颈部至鼻部的皮肤做正中切口，以暴露颅骨。
  7. 将虹膜剪的尖端从一侧枕骨大孔插入，沿颅骨内表面小心滑动。
  8. 向后颅骨表面的远端边缘做一切口，并在对侧做相同的切口。清除小脑周围的颅骨。
  9. 小心地将一侧颅骨剥离，以避免损伤脑组织。在脑的另一侧重复此操作。
  10. 使用解剖刀切断大脑腹侧表面的嗅球及其神经连接。
  11. 用剪刀小心剪除连接脑组织与颅骨的残余硬脑膜，轻柔地将脑组织从头部分离，并取出脑。
  12. 将脑组织置于含有4% PFA的固定液小瓶中，固定液体积至少为脑组织体积的10倍，在4°C下固定24小时。
  13. 通过一系列梯度乙醇溶液对组织进行脱水以置换水分，随后用石蜡浸润，形成组织块。使用切片机将石蜡包埋的组织块切成4 µm厚的切片21.
  14. 脱蜡并复水感染脑组织切片22继续进行 原位 石蜡包埋切片的杂交

6. 冷冻切片脑组织样本制备

  1. 按照 5.1 - 5.11 步骤取出脑组织。
  2. 为观察荧光微珠和 M32-EGFP-MCMV，将切除的脑组织置于平底冷冻模具中，加入包埋介质完全覆盖脑组织样本，用镊子夹住模具边缘，将其放入预冷的 n-己烷（-80 ºC）中速冻，随后固定于持样头。
  3. 进行切片时，将冷冻组织块固定在预冷的恒冷切片机持样头上，连同持样头一起将冷冻组织转移至恒冷切片机腔室，将温度调至 -10 至 -20 °C，切取约 8 - 10 µm 厚的切片23。
  4. 使用细胞固定剂（异丙醇与聚乙二醇的混合物）喷雾固定切片，喷雾后于室温下晾干 30 分钟，并将切片储存于 -80 ºC，待后续使用。
  5. 将切片恢复至室温，用 PBS 洗涤三次。
  6. 用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的 Griffonia simplicifolia isolectin B4 抗体以 1:100 的浓度在 PBS 中室温孵育 10 分钟（图 5），或用藻红蛋白（PE）标记的 CD31 抗体以 1:100 的浓度在 PBS 中室温孵育 30 分钟（图 6）对切片进行染色。
  7. 用 PBS 洗涤切片三次。
  8. 洗涤后，使用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对切片进行染色以显示细胞核。将切片封片于抗荧光淬灭试剂中，使用荧光显微镜观察 DAPI（激发波长 345 nm，发射波长 455 nm）、EGFP（激发波长 489 nm，发射波长 508 nm）和尼罗红（Nile red，激发波长 553 nm，发射波长 637 nm）信号（图 3、图 5、图 6）。

7. 用于石蜡包埋切片的荧光原位杂交（FISH）

  1. 制备用荧光染料直接标记的DNA FISH探针 原位 使用含有完整MCMV DNA基因组的细菌人工染色体（pSM3fr）通过缺口平移法进行杂交19FISH探针的浓度为0.1 µg/µl。
  2. 脱蜡并复水感染脑组织切片22.
  3. 用 RNase（100 µg/ml 溶于 PBS）处理组织切片以检测病毒 DNA。
  4. 使用0.05% NP40、0.01 M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）在95–98°C条件下进行抗原修复20分钟。将切片冷却至室温20分钟。
  5. 在玻璃染色缸中，用纯水洗涤载玻片，每次2分钟，共洗三次。随后在37 °C下，使用0.06%胃蛋白酶、0.01 N盐酸溶液进行额外的抗原修复步骤，持续5分钟。
  6. 在玻璃染色缸中用纯水冲洗载玻片，每次2分钟，共冲洗三次。
  7. 将载玻片依次从70%乙醇转移至85%乙醇，再转移至100%乙醇，再次脱水组织切片。
  8. 配制10 ml杂交缓冲液，混合1.25 ml 原位 杂交盐溶液（3 M NaCl，100 mM Tris-HCl pH 8.0，100 mM 磷酸钠 pH 6.8，50 mM EDTA）中加入 5 ml 去离子甲酰胺、2.5 ml 50% 硫酸葡聚糖、250 µl 50x Denhardt 溶液、125 µl 100 mg/ml tRNA 和 875 µl H₂O2O.
  9. 将直接用荧光染料标记的、可随机识别整个MCMV基因组的DNA探针加入杂交缓冲液中进行稀释。最终体积应为10 µl（7 µl杂交缓冲液，1 µl探针（0.1 µg/µl），以及2 µl蒸馏水）。
  10. 将探针混合液（10 µl）加入每张载玻片，盖上盖玻片（15 × 15 mm），用橡胶胶水密封盖玻片。在85 °C下变性探针混合液5分钟，然后在42 °C下过夜完成杂交步骤。
  11. 用0.3% NP40、0.4x SSC在73°C洗涤载玻片2分钟；用0.1% NP40、0.4x SSC在73°C洗涤1分钟；再用2x SSC洗涤两次。
  12. 用 DAPI（10 ng/ml）对细胞核进行复染，然后加盖盖玻片。
  13. 使用抗荧光淬灭剂封片，然后在荧光显微镜下观察DAPI（激发波长345 nm，发射波长455 nm）和EGFP（激发波长489 nm，发射波长508 nm）的荧光信号图4).

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结果

在研究病毒性脑炎发病机制的过程中，感染途径的选择至关重要。血源性途径代表了病毒对脑部内皮细胞和壁细胞的急性感染，而脑室内注射（ICV）途径则模拟了病毒通过脑脊液在蛛网膜下腔扩散，进而累及脑膜和脉络丛的急性感染过程。为分析急性脑炎中病毒颗粒的初始分布情况， 原位 采用杂交技术检测MCMV基因组，并直接观察M32-EGFP-MCMV颗粒或荧光微珠。

重组MCMV（M32-EGFP-MCMV）的制备

本实验方案说明了如何构建重组M32-GFP-MCMV。通过同源重组，将EGFP插入MCMV基因组的37,089至41,450 bp位置（M32-M31 位点）。EGFP蛋白与一种病毒蛋白（M32）融合，并在病毒颗粒内表达EGFP。同源重组完成后，当有限稀释感染所产生的所有病...

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讨论

在动物模型中，已采用脑室内注射（ICV）、腹腔注射、直接胎盘注射和静脉注射（IV）感染方法来研究病毒性脑炎的发病机制。我们选择新生小鼠的ICV和IV注射模型，因其操作简便，且可将病毒颗粒直接注入靶区域。尽管腹腔注射是一种较为简便的方法，但病毒颗粒通过间接途径在体内系统性扩散5,24。直接胎盘注射是研究胚胎期系统性感染的良好方法，但该方法需要特殊技术培训才能获得稳定结果，且成功率较低。此外，该感染方式需通过胎盘实现，属于间接过程，每次实验难以精确控制注入胎儿体内的病毒量6。由于新生小鼠对巨细胞病毒（CMV）等病毒高度易感，本研究能够在感染的极早期阶段比较病毒颗粒的分布与被感染细胞的分布情况。ICV注射模型有助于研究绕过血脑屏障（BBB）的病毒感染行为25，而IV感染模型则是一种模拟自然感染过程的系统性感染模型，包含病毒与血脑屏障之间的相互作用。

采用脑室内注射（ICV）方法时，我们确保针头至少深入颅骨2 mm。针头在脑室中保留约10 - 20秒，以防止液体从脑室回流26。若操作得当，脑室内注射是一...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢滨松医科大学再生与感染病理学系的金田正明先生、铃木宏美女士和川岛满惠女士提供的出色技术支持。本研究由日本促进科学基金（Japan Society for the Promotion of Science）资助，资助号为23590445。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Tris；三（羟甲基）氨基甲烷Sigma-AldrichT-6791
HClSigma-AldrichH-1758
pEGFP-N1 载体 Clontech#6085-1
D-山梨醇Sigma-AldrichS-1876
SPHERO TM 荧光聚苯乙烯尼罗红 0.04 - 0.06Spherotech, Inc.FP-00556-2
SPHERO TM 荧光聚苯乙烯尼罗红 0.1 - 0.3Spherotech, Inc.FP-0256-2
SPHERO TM 荧光聚苯乙烯尼罗红 1.7 - 2.2Spherotech, inc. FP-2056-2
10% 小鼠血清DAKO X0910
C57BL/6 小鼠SLC, Inc.
ICR 小鼠SLC, Inc.
改良微量注射器（7000 系列）Hamilton company
35 号针头Saito Medical
A Wee Sight 透射照明器Phillips Healthcare1017920
O.C.T. 包埋剂Sakura Finetek4583
RNase ASigma-AldrichR4642
Nonidet(R) P-40Nacalai25223-04
柠檬酸盐缓冲液（pH 6）×10Sigma-AldrichC9999-100ml
胃蛋白酶Sigma-AldrichP6887
EDTAdojindoN001
甲酰胺TCIF0045
硫酸葡聚糖钠盐Sigma-Aldrich42867-5G
Denhardt 溶液（50×）ThermoFishcer sceintific750018
酵母 tRNA（10 mg/ml）ThermoFishcer sceintificAM7119
SSC 20×Sigma-AldrichS6639
DAPIThermoFishcer sceintificD1306
正己烷Sigma-Aldrich296090
Superfrost Plus 载玻片ThermoFishcer sceintific12-55-18
Cytokeep IINippon Shoji Co.
FITC 标记的扁豆凝集素 Griffonia simplicifolia isolectin B4Vector laboratories, Inc.L1104
抗小鼠 CD31（PECAM-1）PEebioscience12-0311
ProLong  GoldThermoFishcer sceintificP36934
BIOREVOKEYENCEBZ-9000E

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