新生小鼠脑室内及血管内注射病毒颗粒与荧光微珠

摘要

在此，我们介绍一种向新生小鼠脑内进行脑室内和血管内注射病毒颗粒或荧光微珠的简单方法。通过显微镜观察或 原位 杂交。

摘要

在研究病毒性脑炎的发病机制时，感染途径至关重要。进入大脑的两种主要感染途径之一是血行途径，该途径涉及感染脑部的内皮细胞和周细胞；另一种是脑室内（ICV）途径。一旦进入中枢神经系统（CNS），病毒可通过脑脊液扩散至蛛网膜下腔、脑膜和脉络丛。在实验模型中，中枢神经系统内病毒分布的最早阶段尚未被充分阐明，尚不清楚是否仅有特定细胞在初始阶段被感染。本文中，我们分析了在新生小鼠脑内经脑室内（ICV）或血管内（IV）注射后，急性感染期（即原发性病毒血症阶段）巨细胞病毒（CMV）颗粒的分布情况。在ICV注射模型中，使用10 µl注射器配27 G针头，将5 µl小鼠巨细胞病毒（MCMV）或荧光微珠注射至耳眼连线中点处的侧脑室。在IV注射模型中，使用1 ml注射器配35 G针头，通过透射光源可视化新生小鼠浅表颞（面部）静脉，并向该静脉注入50 µl MCMV或荧光微珠。注射后在不同时间点采集脑组织，采用以下方法检测MCMV基因组 原位 杂交方法。通过荧光显微镜观察荧光微珠或表达绿色荧光蛋白的重组MCMV颗粒。这些技术可应用于多种其他病原体，以研究脑炎的发病机制。

引言

在研究病毒性脑炎时，病毒颗粒的初始分布对于理解疾病发病机制以及确定病毒在脑内的靶细胞至关重要。大多数病毒的大小在20至300 nm之间，尽管潘多拉病毒（Pandoravirus）的尺寸可超过700 nm¹。在感染急性期，病毒颗粒的分布可能取决于颗粒大小、细胞受体的分布或细胞受体对病毒的亲和力。在动物模型中，已采用脑室内（ICV）、腹腔内、直接胎盘内和静脉内（IV）感染等方式来研究病毒性脑炎的发病机制。通过ICV途径接种病毒常用于在小鼠中建立中枢神经系统（CNS）感染。使用该技术的研究报道显示感染范围广泛，尤其累及脑室周围区域以及直接与脑脊液（CSF）接触的脑区细胞，类似于病毒性脑室脑炎的表现。腺相关病毒（AAV）颗粒体积较小（直径20–25 nm），有助于其在ICV感染后在整个脑组织中扩散^2–4。腹腔内⁵、直接胎盘内⁶和静脉注射⁷属于血源性全身给药方式。病毒颗粒穿过血脑屏障（BBB）后可进入新生脑实质，表现为弥散性小胶质细胞结节^8,9。

巨细胞病毒（CMV）是一种属于疱疹病毒科的常见病毒。在美国，到40岁时，50%至80%的人群曾感染过CMV。CMV感染通常无害，但可在免疫功能低下患者及胎儿中引起疾病。在所有分娩中，有0.2%至2%的新生儿患有先天性CMV感染¹⁰，导致小头畸形、室管膜周围钙化、小脑发育不全、小眼球、视神经萎....

方案

所有实验方案均获得滨松医科大学动物护理委员会的批准。

1. MCMV（Smith株）及重组M32增强型绿色荧光蛋白（EGFP）-MCMV的制备

1. 根据以下方法（1.2 - 1.9）及先前所述方法，生成重组M32-EGFP-MCMV⁸.
2. 使用源自野生型MCMV Smith株（登录号：U68299）的重组病毒。将EGFP（4,361个碱基对；bp）插入至37,089至41,450 bp之间（M32 - M31 通过同源重组在MCMV基因组中定位基因座（locus）。
3. 通过聚合酶链式反应扩增MCMV M32 (41,450 - 39,286 bp，左侧侧翼序列和 M31 （37,089 - 39,246 bp，右侧侧翼序列基因位点，使用以下引物： M32，5′-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3′（正向引物），5′-CTACTAGCTAGCCTTCCGCGAGTCGCTGTATT-3′（反向引物）； M31，5′-CTAAATTAACTTAAGTCGTCCTCTTCGTCTCACAA-3′（正向引物），5′-AACTAGTCTAGATCGCTCCTGGTTGGTTTTTA-3′（反向引物）。
4. 插入 M32 使用 NheI 和 BamHI 限....

结果

在研究病毒性脑炎发病机制的过程中，感染途径的选择至关重要。血源性途径代表了病毒对脑部内皮细胞和壁细胞的急性感染，而脑室内注射（ICV）途径则模拟了病毒通过脑脊液在蛛网膜下腔扩散，进而累及脑膜和脉络丛的急性感染过程。为分析急性脑炎中病毒颗粒的初始分布情况， 原位 采用杂交技术检测MCMV基因组，并直接观察M32-EGFP-MCMV颗粒或荧光微珠。

重组MCMV（M32-EGFP-MCMV）的制备

本实验方案说明了如何构建重组M32-GFP-MCMV。通过同源重组，将EGFP插入MCMV基因组的37,089至41,450 bp位置（M32-M31 位点）。EGFP蛋白与一种病毒蛋白（M32）融合，并在病毒颗粒内表达EGFP。同源重组完成后，当有限稀释感染所产生的所有病.......

讨论

在动物模型中，已采用脑室内注射（ICV）、腹腔注射、直接胎盘注射和静脉注射（IV）感染方法来研究病毒性脑炎的发病机制。我们选择新生小鼠的ICV和IV注射模型，因其操作简便，且可将病毒颗粒直接注入靶区域。尽管腹腔注射是一种较为简便的方法，但病毒颗粒通过间接途径在体内系统性扩散^5,24。直接胎盘注射是研究胚胎期系统性感染的良好方法，但该方法需要特殊技术培训才能获得稳定结果，且成功率较低。此外，该感染方式需通过胎盘实现，属于间接过程，每次实验难以精确控制注入胎儿体内的病毒量⁶。由于新生小鼠对巨细胞病毒（CMV）等病毒高度易感，本研究能够在感染的极早期阶段比较病毒颗粒的分布与被感染细胞的分布情况。ICV注射模型有助于研究绕过血脑屏障（BBB）的病毒感染行为²⁵，而IV感染模型则是一种模拟自然感染过程的系统性感染模型，包含病毒与血脑屏障之间的相互作用。

采用脑室内注射（ICV）方法时，我们确保针头至少深入颅骨2 mm。针头在脑室中保留约10 - 20秒，以防止液体从脑室回流²⁶。若操作得当，脑室内注射是一.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Tris；三（羟甲基）氨基甲烷	Sigma-Aldrich	T-6791
HCl	Sigma-Aldrich	H-1758
pEGFP-N1 载体	Clontech	#6085-1
D-山梨醇	Sigma-Aldrich	S-1876
SPHERO TM 荧光聚苯乙烯尼罗红 0.04 - 0.06	Spherotech, Inc.	FP-00556-2
SPHERO TM 荧光聚苯乙烯尼罗红 0.1 - 0.3	Spherotech, Inc.	FP-0256-2
SPHERO TM 荧光聚苯乙烯尼罗红 1.7 - 2.2	Spherotech, inc.	FP-2056-2
10% 小鼠血清	DAKO	X0910
C57BL/6 小鼠	SLC, Inc.
ICR 小鼠	SLC, Inc.
改良微量注射器（7000 系列）	Hamilton company
35 号针头	Saito Medical
A Wee Sight 透射照明器	Phillips Healthcare	1017920
O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek	4583
RNase A	Sigma-Aldrich	R4642
Nonidet(R) P-40	Nacalai	25223-04
柠檬酸盐缓冲液（pH 6）×10	Sigma-Aldrich	C9999-100ml
胃蛋白酶	Sigma-Aldrich	P6887
EDTA	dojindo	N001
甲酰胺	TCI	F0045
硫酸葡聚糖钠盐	Sigma-Aldrich	42867-5G
Denhardt 溶液（50×）	ThermoFishcer sceintific	750018
酵母 tRNA（10 mg/ml）	ThermoFishcer sceintific	AM7119
SSC 20×	Sigma-Aldrich	S6639
DAPI	ThermoFishcer sceintific	D1306
正己烷	Sigma-Aldrich	296090
Superfrost Plus 载玻片	ThermoFishcer sceintific	12-55-18
Cytokeep II	Nippon Shoji Co.
FITC 标记的扁豆凝集素 Griffonia simplicifolia isolectin B4	Vector laboratories, Inc.	L1104
抗小鼠 CD31（PECAM-1）PE	ebioscience	12-0311
ProLong  Gold	ThermoFishcer sceintific	P36934
BIOREVO	KEYENCE	BZ-9000E