小鼠后肢急性与亚急性缺血模型的建立方法

摘要

在小鼠中通过手术诱导后肢缺血有助于研究血管生成，但在某些近交系小鼠中，该方法受到限制，因为这些品系会出现明显的缺血诱导性组织坏死。本文描述了一种使用缩窄环（ameroid constrictor）诱导亚急性肢体缺血的方法，通过逐步实现动脉闭塞，从而避免上述问题。

摘要

外周动脉疾病（PAD）是发达国家心血管疾病发病率和死亡率的主要原因，因此需要能够可靠地模拟人类疾病的动物模型，以开发针对该疾病的新疗法。小鼠后肢缺血模型已被广泛用于此目的，但通过股动脉结扎诱导急性肢体缺血的标准操作可能导致显著的组织坏死，从而影响研究人员对缺血条件下血管和骨骼肌组织反应的观察。一种替代股动脉结扎的方法是使用缩窄环（ameroid constrictors）诱导股动脉逐渐闭塞。当将这些装置放置在与股动脉结扎相同或不同的位置时，可在1至3天内逐步闭塞动脉，从而产生更为缓慢的亚急性缺血状态。这种方法导致的骨骼肌组织坏死程度较轻，可能更接近人类PAD中的病理生理反应。由于遗传背景会影响急性与亚急性缺血模型的结果，在选择最适模型时需慎重考虑所使用的小鼠品系。本文描述了在小鼠股动脉上正确实施结扎或安装缩窄环的操作步骤及其解剖学定位方法，以诱导小鼠亚急性或急性后肢缺血。

引言

外周动脉疾病（PAD）是发达国家心血管疾病发病率和死亡率的主要原因¹。PAD 是由于外周动脉发生动脉粥样硬化性阻塞，导致肢体缺血，从而引起运动性或静息性疼痛，有时还会出现难以愈合的溃疡和坏疽，最终可能需要截肢。目前针对 PAD 的治疗主要集中于血管内介入²或外科血运重建³，因为基本上尚无有效的药物治疗方法⁴。

遗憾的是，血运重建的疗效往往有限，因为旁路移植术的失败率较高（5年内高达50%）⁵，在某些人群中情况更差（例如，吸烟者、女性、非大隐静脉移植物）^6,7。血管腔内治疗手段（如血管成形术和支架植入术）也因再狭窄率高而受限（1年内超过50%），尤其是在股腘动脉疾病中更为显著⁸，尽管药物洗脱球囊和支架的应用在一定程度上改善了治疗效果^9-11。为了开发新的外周动脉疾病（PAD）治疗方法，必须建立能够可靠模拟人类疾病的动物模型。

迄今为止，外周动脉疾病（PAD）最常用的模型是后肢缺血模型（HLI），该模型最常在小鼠中建立^12,13。在最常见的建模方式中，该模型包括手术结扎股动脉近端和远端及其之间的侧支血管，并切除该段血管，从而阻断血流，诱导急性肢体缺血。HLI模型主要用于研究外周肢体肌肉组织中的血管新生和动脉生成反....

方案

所有动物实验均按照杜克大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。本研究使用雄性小鼠，但根据研究的科学目的，也可使用任一性别小鼠。

1. 脱毛

1. 麻醉诱导前，设置一个术前准备区域，包括一个设定温度的带覆盖层的加热垫 37 °C 并连接至异氟烷持续气流的鼻锥端口。
2. 将小鼠放入麻醉诱导室。设定 O₂ 将流量计调至 1 L/min，异氟烷浓度设为 1 - 3%。
   注意： 通常使用2%异氟烷对25 g小鼠进行麻醉诱导。
3. 通过轻轻摇晃鼠盒并观察小鼠翻正反射的缺失，来检查小鼠的刺激反应。
4. 用 O₂ 冲洗反应室₂ 在打开之前先清除异氟烷。迅速将小鼠移至加热垫上，并通过鼻罩连接异氟烷。
5. 将异氟烷浓度调整至1.5%。通过足底反射（脚趾夹捏）检查刺激反应。
6. 手术期间在双眼大量涂抹眼用润滑剂，以防止眼睛干燥。
7. 使用小型电动剃毛器剃除后肢两侧的毛发。剃毛时应拉紧皮肤，以避免划伤。
8. 涂抹预热的脱毛膏，静置1分钟。用湿润的纱布轻轻擦去。
9. 如需稍后进行手术操作，关闭异氟烷，将小鼠转移至铺有纸巾的空恢复笼中，以确保小鼠不会吸入笼垫料。监测动物状态，直至其能够维持胸卧位。否则，将小鼠转移至手术台。
   注意：

结果

准确识别小鼠后肢血管系统对于确保本文所述诱导亚急性和急性后肢缺血技术的可重复性至关重要。除了动物实验本身固有的变异外，其他因素也可能影响激光多普勒灌注成像（LDPI）的结果，包括麻醉类型、动物体位（仰卧与俯卧）以及体温（见图3）。此外，亚急性后肢缺血模型的效果依赖于缩窄环（ameroid constrictor）的质量，而同一批次内的缩窄环质量可能存在较大差异（见图4）。上述每一项因素均可能对LDPI测得的血流定量结果产生显著影响，下文将对此进行更详细的讨论。

在建立亚急性后肢缺血模型时放置缩窄环，或在急性后肢缺血模型中结扎并横断股动脉后，应在术后立即获取激光多普勒灌注成像（LDPI）图像，此时动物仍处于麻醉状态，以展示手术效果并确立术后灌注的基线水平（图5）。灌注量的定量分析通过在缺血后肢周围绘制感兴趣区域（ROI），并在非缺血后肢.......

讨论

该操作中最困难的步骤可能是将股动脉与股静脉分离。与动脉相比，股静脉直径较大且管壁较薄，因此在手术操作过程中更容易发生穿刺或撕裂。通过使用 PBS 浸润的无菌棉签保持创面湿润，可降低静脉损伤的风险。此外，确保所有镊子锋利、对齐且无破损也非常重要，以便精确操作血管及周围组织。一旦发生出血，应使用无菌纱布对出血区域施加压力，直至出血停止。应对每只动物保留详细的手术记录，因为看似“轻微”的出血事件，长期来看可能代表意外的更严重缺血性损伤。为了保证数据的一致性，避免静脉或侧支动脉出血的手术至关重要。

该技术的一个局限性在于，缺血的严重程度和（或）发生时间（在亚急性美洲胺缩窄器模型中）可能因多种因素而存在较大差异。近端缩窄器/结扎部位将决定有多少侧支动脉受到缺血诱导的影响。保留侧支血管的完整性可减轻损伤的严重程度，尽管如前所述，在某些情况下， 即在某些遗传背景的动物中，即使是较轻的亚急性缺血也可导致显著的组织坏死 ²³此外，在远端增加第二个缩窄环或结扎线可降低急性和亚急性模型中的灌注。 ²³一些研究者已结扎或使用电灼术消融来自旋股外.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dumont #5/45 镊子	Fine Science Tools	11251-35	Dumoxel
Dumont 型号 5 微型镊子	Fine Science Tools	11200-14	Inox
超细 Bonn 剪刀	Fine Science Tools	14084-08
7-0 丝线缝合线	Sharpoint	DA-2527N
5-0 涂层 Vicryl 缝合线	Ethicon	J463G
Graefe 镊子	Fine Science Tools	11053-10
Vannas 弹簧剪刀	Fine Science Tools	15000-03
人工泪液软膏	Rugby Laboratories	0536-6550-91
外科胶带	3M	1530-0
精细棉签	Contec	SC-4
温度控制器	Physitemp	TCAT-2DF
Ameroid 收缩环	Research Instruments SW	MMC-0.25 x 1.00-SS
热珠灭菌器
Deltaphase 恒温垫	Braintree Scientific	39DP
持针器	Fine Science Tools
磷酸盐缓冲液	Gibco	10010-023
Moor LDPI	Moor Instruments	moorLDI2
moorLDI 测量软件	Moor Instruments	v. 6.0
脱毛膏	Nair