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小鼠后肢急性与亚急性缺血模型的建立方法

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DOI：

10.3791/54166

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2016年6月21日

 ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Duke University Medical Center

本文内容

摘要

在小鼠中通过手术诱导后肢缺血有助于研究血管生成，但在某些近交系小鼠中，该方法受到限制，因为这些品系会出现明显的缺血诱导性组织坏死。本文描述了一种使用缩窄环（ameroid constrictor）诱导亚急性肢体缺血的方法，通过逐步实现动脉闭塞，从而避免上述问题。

摘要

外周动脉疾病（PAD）是发达国家心血管疾病发病率和死亡率的主要原因，因此需要能够可靠地模拟人类疾病的动物模型，以开发针对该疾病的新疗法。小鼠后肢缺血模型已被广泛用于此目的，但通过股动脉结扎诱导急性肢体缺血的标准操作可能导致显著的组织坏死，从而影响研究人员对缺血条件下血管和骨骼肌组织反应的观察。一种替代股动脉结扎的方法是使用缩窄环（ameroid constrictors）诱导股动脉逐渐闭塞。当将这些装置放置在与股动脉结扎相同或不同的位置时，可在1至3天内逐步闭塞动脉，从而产生更为缓慢的亚急性缺血状态。这种方法导致的骨骼肌组织坏死程度较轻，可能更接近人类PAD中的病理生理反应。由于遗传背景会影响急性与亚急性缺血模型的结果，在选择最适模型时需慎重考虑所使用的小鼠品系。本文描述了在小鼠股动脉上正确实施结扎或安装缩窄环的操作步骤及其解剖学定位方法，以诱导小鼠亚急性或急性后肢缺血。

引言

外周动脉疾病（PAD）是发达国家心血管疾病发病率和死亡率的主要原因1。PAD 是由于外周动脉发生动脉粥样硬化性阻塞，导致肢体缺血，从而引起运动性或静息性疼痛，有时还会出现难以愈合的溃疡和坏疽，最终可能需要截肢。目前针对 PAD 的治疗主要集中于血管内介入2或外科血运重建3，因为基本上尚无有效的药物治疗方法4。

遗憾的是，血运重建的疗效往往有限，因为旁路移植术的失败率较高（5年内高达50%）5，在某些人群中情况更差（例如，吸烟者、女性、非大隐静脉移植物）6,7。血管腔内治疗手段（如血管成形术和支架植入术）也因再狭窄率高而受限（1年内超过50%），尤其是在股腘动脉疾病中更为显著8，尽管药物洗脱球囊和支架的应用在一定程度上改善了治疗效果9-11。为了开发新的外周动脉疾病（PAD）治疗方法，必须建立能够可靠模拟人类疾病的动物模型。

迄今为止，外周动脉疾病（PAD）最常用的模型是后肢缺血模型（HLI），该模型最常在小鼠中建立12,13。在最常见的建模方式中，该模型包括手术结扎股动脉近端和远端及其之间的侧支血管，并切除该段血管，从而阻断血流，诱导急性肢体缺血。HLI模型主要用于研究外周肢体肌肉组织中的血管新生和动脉生成反应，以及各种治疗方法（例如，药物、基因递送、干细胞）对这些反应的影响。最近，我们课题组已利用该模型探讨骨骼肌细胞在肢体缺血反应中的作用，以及遗传差异对结局的影响14。

HLI 模型促进了我们目前对缺血引起的血管和肌肉反应依赖于遗传因素（即，近交系）15、年龄16以及是否存在其他与动脉粥样硬化相关的疾病或状况（包括糖尿病17和高胆固醇血症18）的理解。然而，传统 HLI 模型的一个重要缺陷在于，它是一种急性肢体缺血模型12,13，而人类外周动脉疾病（PAD）是由于外周动脉中闭塞性动脉粥样硬化病变逐渐发展所致，引起的是慢性缺血。

为了克服这一缺陷，Tang 及其同事最初采用缩窄性美洲环构建了渐进性股动脉闭塞的大鼠模型。 19，同一研究团队随后开发了类似的鼠类模型 20. Ameroid缩窄器最初于20世纪50年代在犬类慢性心肌缺血模型中被描述 21,22这些装置具有一个外层金属套管，包裹着内层的吸湿性材料（通常为酪蛋白），当其被放置在动脉周围时，会因吸收周围组织的水分而逐渐引起血管闭塞。在对该模型的改进中，Yang 等 在近端和远端股动脉上放置缩窄环，位置对应于传统手术结扎部位，同时结扎股动脉的侧支，与传统模型一致。与急性下肢缺血（HLI）相比，由美洲缩窄环诱导的缺血模型术后4至5周表现出较低的炎症相关基因和剪切应力依赖性基因表达、更差的血流恢复，以及更轻的肌肉坏死。 20基于这些观察结果，人们认为逐渐性动脉阻塞可能提供一种与人类疾病更相关的外周动脉疾病（PAD）模型。

值得注意的是，在原始研究报告中，仅在 C57BL/6 小鼠中检测了缩窄环诱导缺血的影响19，而该品系对缺血诱导的肌肉坏死具有相对抗性15。我们近期进一步改进了这一渐进性缺血模型，并在对缺血更为敏感的 BALB/c 小鼠品系中探讨了其效应23。在该模型的第一种实施方式中，我们在股动脉的近端和远端均放置了缩窄环，但保留了所有侧支血管完整。在第二种较温和的改良方式中，仅在股动脉近端放置单个缩窄环，同时同样保留动脉的所有侧支血管完整。在这两种模型改良方式中，我们发现尽管 BALB/c 小鼠的血流和血管密度与 C57BL/6 小鼠相似，但仅前者表现出显著的肌肉坏死，而 C57BL/6 小鼠则无此现象。与我们先前的研究14类似，这些结果表明，肢体肌肉损伤不仅受血流影响，还在一定程度上依赖于遗传背景。此外，我们发现肢体血流在术后3天内即降至最低水平，因此该模型更符合“亚急性”而非渐进性肢体缺血的特征。

基于这些先前的研究，显然单一的诱导后肢缺血方法可能并不适用于所有情况。由于多种条件（例如，遗传差异以及合并症的有无）会影响血管和骨骼肌的特异性反应，研究者可能需要调整后肢缺血的慢性程度和（或）严重程度，以最符合其研究目的。此外，以往对该模型的描述通常缺乏适当的解剖标志，难以实现研究者之间技术操作的可靠重复性。本文描述了在小鼠中诱导急性或亚急性后肢缺血的方法，并提供了精确的解剖标志。

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方案

所有动物实验均按照杜克大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。本研究使用雄性小鼠，但根据研究的科学目的，也可使用任一性别小鼠。

1. 脱毛

  1. 麻醉诱导前，设置一个术前准备区域，包括一个设定温度的带覆盖层的加热垫 37 °C 并连接至异氟烷持续气流的鼻锥端口。
  2. 将小鼠放入麻醉诱导室。设定 O2 将流量计调至 1 L/min，异氟烷浓度设为 1 - 3%。
    注意： 通常使用2%异氟烷对25 g小鼠进行麻醉诱导。
  3. 通过轻轻摇晃鼠盒并观察小鼠翻正反射的缺失，来检查小鼠的刺激反应。
  4. 用 O₂ 冲洗反应室2 在打开之前先清除异氟烷。迅速将小鼠移至加热垫上，并通过鼻罩连接异氟烷。
  5. 将异氟烷浓度调整至1.5%。通过足底反射（脚趾夹捏）检查刺激反应。
  6. 手术期间在双眼大量涂抹眼用润滑剂，以防止眼睛干燥。
  7. 使用小型电动剃毛器剃除后肢两侧的毛发。剃毛时应拉紧皮肤，以避免划伤。
  8. 涂抹预热的脱毛膏，静置1分钟。用湿润的纱布轻轻擦去。
  9. 如需稍后进行手术操作，关闭异氟烷，将小鼠转移至铺有纸巾的空恢复笼中，以确保小鼠不会吸入笼垫料。监测动物状态，直至其能够维持胸卧位。否则，将小鼠转移至手术台。
    注意： 脱毛过程可能刺激皮肤并影响灌注测量结果。建议在去除动物毛发后等待1至2天，再进行术前灌注扫描或手术操作。

2. 术前准备

  1. 本实验过程中使用以下工具：小型直手术剪、2 把尖头弯镊、小型格拉费镊、持针器、3 个拉钩、小型弹簧剪以及细头棉签。
  2. 手术开始前，使用高压灭菌器对所有工具进行灭菌。每次手术前及每完成最多 5 只动物的手术后，使用热珠灭菌器进行灭菌。若手术动物数量超过 5 只，需额外准备并灭菌多套手术器械包。
  3. 准备无菌手术区域，包括带有覆盖层的温控加热垫和异氟烷吸入装置。所有操作均须在 10 倍体视解剖显微镜下进行。
  4. 按照步骤 1.1 至 1.5 所述方法对小鼠进行麻醉和术前准备。
  5. 确认小鼠已完全麻醉后，将其仰卧位固定于手术台上，并使用手术胶带固定两后肢。
  6. 若使用温控加热垫，应连接温度探针，并用手术胶带将其固定于手术平台底部，以防术中意外脱落。
  7. 使用碘伏和酒精棉片交替擦拭切口部位共 3 次。用无菌手术巾覆盖动物体表，并剪开一小孔暴露手术切口区域。

3. 诱导肢体缺血

  1. 使用解剖刀沿内侧大腿中线从膝部向腹部做初始切口，并用精细剪刀将切口延长至约 1 cm（图 1A）。

显示动脉分支的解剖图；标注结构包括FA、FV、SA，突出显示解剖部位。
图1. 小鼠后肢缺血手术的手术部位及血管解剖标志。 (A) 仰卧位小鼠后肢的外部视图。虚线表示切口位置，用于正确实施后肢缺血手术。 (B) 小鼠后肢近端血管视图。股动脉（FA）的近端起始于腹股沟韧带（IL）下方。FA的远端位于其分叉为腘动脉（PA）和隐动脉（SA）的位置。从FA发出的主要侧支动脉包括股外侧旋动脉（LCFA）、近端股深动脉（PCFA）和浅表腹壁阴部动脉（SCEA）。股静脉（FV）紧邻FA走行，静脉分支与主要动脉分支平行可见。星号（*）表示放置缩窄环或结扎线的近端和远端位置，具体取决于诱导的是亚急性还是急性缺血。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 用镊子打开切口，暴露覆盖腹股沟脂肪组织（IFT）的膜。
  2. 使用闭合的镊子刺穿该膜，进入 IFT 与腹腔之间的间隙。轻轻松开镊子压力，将 IFT 与腹肌分离，暴露出其下方的神经血管束。观察近端和浅表尾侧分支作为重要的解剖学标志（图 1B）。
  3. 插入牵开器，将腹腔组织向近端牵拉，暴露位于股外侧动脉近端的近端缩窄器或结扎部位（图 1B）。股外侧动脉位于近端和浅表尾侧动脉近端约 5 mm 处。
    1. 在切口远端插入另外两个牵开器，一个位于内侧，一个位于外侧，将 IFT 向远端牵离手术区域，以扩大手术视野。
  4. 使用两把精细镊子去除覆盖神经血管束的最外层膜。将精细镊子的一半尖端轻轻插入静脉与动脉之间，沿连接两者的膜下方向滑动。闭合镊子，轻柔撕除该膜。
  5. 将闭合镊子的尖端插入静脉与动脉之间，通过松开镊子压力在两者之间创建间隙。重复此操作，在动脉与神经之间创建另一间隙。
  6. 对于亚急性肢体缺血模型，将缩窄器放置于股动脉近端（图 2）。
    1. 安装近端缩窄器时，将镊子尖端滑入股动脉下方，将其从神经血管束中分离出来。使用另一把弯头镊子夹住缩窄器边缘，并引导其穿过股动脉下方。
    2. 将股动脉置入缩窄器的凹槽中。对远端缩窄器重复相同操作，将其放置于股动脉分叉为腘动脉和隐动脉的部位近端（图 2）。

显示带有微夹的鼠动脉及标记 LCFA、PA、SA 的手术过程；生物学实验。
图 2. Ameroid 缩窄器与结扎线的放置位置。 (A) 在股动脉上放置两个 Ameroid 缩窄器以诱导亚急性后肢缺血的示例。近端缩窄器置于股外侧旋动脉（LCFA）稍近端处，远端缩窄器置于腘动脉（PA）与隐动脉（SA）分叉处稍近端。安装缩窄器时需使槽口朝上，以确保动脉被正确置入缩窄器内。 (B) 结扎股动脉以诱导急性后肢缺血的示例。结扎线（黄色箭头）的位置与 (B) 图中缩窄器的位置相对应，两对结扎线之间（星号）的股动脉被切断。标尺：1 mm。 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 对于急性肢体缺血，结扎并横断近端股动脉。
    1. 为横断股动脉，在近端缩窄器位置近端（见步骤 3.7）下方穿入 7-0 缝线并结扎。在第一结扎点远端约 1 mm 处打第二个结扎线。
    2. 使用弹簧剪在两个结扎线之间横断动脉。对于远端动脉横断，重复上述步骤，在股动脉分叉为腘动脉和隐动脉的近端约 1 mm 处放置两个相距约 1 mm 的结扎线，但需确保其位于浅尾侧腹下动脉远端（见 图 1）。
  2. 使用间断的 5-0 Vicryl 缝线关闭切口。

4. 灌注成像

  1. 将小鼠移至激光多普勒血流成像仪（LDPI）下方设定为 37 °C 的加热垫上，并通过鼻罩连接异氟烷气源。若无温度监测设备，需让小鼠静置 5 分钟，使其体温升至 37 °C。
  2. 打开成像仪并启动图像采集软件。
  3. 点击“新建单幅图像”图标，打开“扫描仪设置”窗口。将“扫描尺寸”设为“大”，将“扫描速度”设为“4 ms/像素”。在“扫描区域（单位）”面板中，通过更改 x 和 y 的数值设定扫描区域。
  4. 点击“视频与距离”选项卡以查看视频画面，调整小鼠位置，使其位于红色轮廓标示的扫描区域内。点击“自动测距”以校准激光与受试对象之间的距离。点击“下一步”进入“受试对象信息”窗口。
  5. 输入受试对象信息及任何相关备注。点击“下一步”按钮，进入扫描窗口。
  6. 点击“开始测量”按钮，弹出“确认或覆盖扫描距离”对话框。点击“确定”以确认扫描距离。观察扫描过程开始，持续 4 至 8 分钟，具体时长取决于扫描区域的大小。
  7. 扫描完成后，系统将弹出“另存为”窗口。为文件命名并保存。
  8. 关闭异氟烷气源，将小鼠转移至空的恢复笼中，并持续监测直至动物能够维持胸卧位。切勿将正在从麻醉中恢复的小鼠放入含有其他小鼠的笼中。
  9. 打开图像分析软件。点击“打开”图标，浏览并打开待分析的图像文件。在文件窗口中，观察小鼠的血流、照片及彩色图像。
  10. 要在血流图像上标记感兴趣区域（ROI），请先点击“显示 ROI”图标。然后点击“添加多边形”按钮，拖动光标围绕非手术肢体绘制 ROI，右键单击以闭合图形。再次选择“添加多边形”，在手术肢体周围绘制对应的 ROI。
  11. 点击“统计”图标，打开“图像 ROI 统计结果（PU）”窗口。在“血流 %”列中观察血流的百分比差异。
    注意： 首先绘制的 ROI 将作为参考。
    注意： 每次后续进行血流灌注扫描前，均需按照第 1 节所述步骤麻醉小鼠，并按照步骤 4.1 至 4.11 对动物进行成像。

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结果

准确识别小鼠后肢血管系统对于确保本文所述诱导亚急性和急性后肢缺血技术的可重复性至关重要。除了动物实验本身固有的变异外，其他因素也可能影响激光多普勒灌注成像（LDPI）的结果，包括麻醉类型、动物体位（仰卧与俯卧）以及体温（见图3）。此外，亚急性后肢缺血模型的效果依赖于缩窄环（ameroid constrictor）的质量，而同一批次内的缩窄环质量可能存在较大差异（见图4）。上述每一项因素均可能对LDPI测得的血流定量结果产生显著影响，下文将对此进行更详细的讨论。

在建立亚急性后肢缺血模型时放置缩窄环，或在急性后肢缺血模型中结扎并横断股动脉后，应在术后立即获取激光多普勒灌注成像（LDPI）图像，此时动物仍处于麻醉状态，以展示手术效果并确立术后灌注的基线水平（图5）。灌注量的定量分析通过在缺血后肢周围绘制感兴趣区域（ROI），并在非缺血后肢...

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讨论

该操作中最困难的步骤可能是将股动脉与股静脉分离。与动脉相比，股静脉直径较大且管壁较薄，因此在手术操作过程中更容易发生穿刺或撕裂。通过使用 PBS 浸润的无菌棉签保持创面湿润，可降低静脉损伤的风险。此外，确保所有镊子锋利、对齐且无破损也非常重要，以便精确操作血管及周围组织。一旦发生出血，应使用无菌纱布对出血区域施加压力，直至出血停止。应对每只动物保留详细的手术记录，因为看似“轻微”的出血事件，长期来看可能代表意外的更严重缺血性损伤。为了保证数据的一致性，避免静脉或侧支动脉出血的手术至关重要。

该技术的一个局限性在于，缺血的严重程度和（或）发生时间（在亚急性美洲胺缩窄器模型中）可能因多种因素而存在较大差异。近端缩窄器/结扎部位将决定有多少侧支动脉受到缺血诱导的影响。保留侧支血管的完整性可减轻损伤的严重程度，尽管如前所述，在某些情况下， 即在某些遗传背景的动物中，即使是较轻的亚急性缺血也可导致显著的组织坏死 23此外，在远端增加第二个缩窄环或结扎线可降低急性和亚急性模型中的灌注。 23一些研究者已结扎或使用电灼术消融来自旋股外...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为R21HL118661、R56HL124444和R01HL124444（授予CDK），以及R00HL103797和R01HL125695（授予JMM）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Dumont #5/45 镊子Fine Science Tools11251-35Dumoxel
Dumont 型号 5 微型镊子Fine Science Tools11200-14Inox
超细 Bonn 剪刀Fine Science Tools14084-08
7-0 丝线缝合线SharpointDA-2527N
5-0 涂层 Vicryl 缝合线EthiconJ463G
Graefe 镊子Fine Science Tools11053-10
Vannas 弹簧剪刀Fine Science Tools15000-03
人工泪液软膏Rugby Laboratories0536-6550-91
外科胶带3M1530-0
精细棉签ContecSC-4
温度控制器PhysitempTCAT-2DF
Ameroid 收缩环Research Instruments SWMMC-0.25 x 1.00-SS
热珠灭菌器
Deltaphase 恒温垫Braintree Scientific39DP
持针器Fine Science Tools
磷酸盐缓冲液 Gibco10010-023
Moor LDPIMoor InstrumentsmoorLDI2
moorLDI 测量软件Moor Instrumentsv. 6.0
脱毛膏Nair

参考文献

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