本方案详细介绍了如何制备具有不同遗传背景的嵌合型斑马鱼胚胎。结合斑马鱼胚胎无与伦比的成像能力，该方法为研究目的基因的细胞自主性与非细胞自主性功能提供了极为强大的手段。
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摘要
摘要
将两种不同遗传背景的动物进行手术性异种共生（parabiosis），可创建一种独特的情境，用于研究目的基因的细胞内在作用与细胞外在作用、细胞的迁移行为以及在不同遗传背景下分泌信号分子的功能。由于异种共生动物共享血液循环系统，来自其中一只动物的血液或血液携带的任何因子都会与其伴侣动物相互交换。因此，可以在另一种遗传背景下研究源自某一遗传背景的细胞和分子因子。成年小鼠的异种共生已被 广泛应用于衰老、癌症、糖尿病、肥胖和大脑发育等领域的研究。近年来，斑马鱼胚胎的异种共生被用于研究造血作用的发育生物学。与小鼠不同，斑马鱼胚胎具有透明特性，使得在异种共生环境下可直接观察细胞行为，使其成为研究基本细胞与分子机制的一种极为强大的方法。然而，该技术的应用受限于制备异种共生斑马鱼胚胎所需较高的技术学习曲线。本实验方案提供了逐步操作指南，介绍如何通过手术将两个不同遗传背景的斑马鱼胚胎的囊胚进行融合，以研究目的基因的功能。此外，异种共生的斑马鱼胚胎可耐受热激处理，从而实现基因表达的时间特异性调控。该方法无需复杂的设备，广泛适用于在胚胎发育过程中对细胞迁移、命运决定和分化等过程的体内（in vivo）研究。
引言
野生型与基因修饰动物之间遗传嵌合体（嵌合体）的制备 是研究候选基因细胞内在功能与细胞外在功能的一种成熟且经典的方法1-6囊胚移植在斑马鱼中已被广泛用于生成嵌合胚胎，以研究细胞自主性7-9然而，根据所关注的组织类型，可能难以可重复地将供体细胞靶向至目标组织例如， 血液 1-3, 7-9小鼠遗传学家长期以来一直采用异种共生手术方法来构建具有共享血液循环系统的连体生物 10-14由于共血动物共享血液循环系统，因此可以研究来自一只动物的细胞与另一只具有不同遗传背景的动物的细胞之间的相互作用 10-16最近，Karima Kissa 团队巧妙地展示了构建连体斑马鱼胚胎的能力，并利用该系统研究造血干细胞和祖细胞（HSPC）的迁移。15此外，斑马鱼异种共生模型最近被用于研究内皮钙黏蛋白5在造血干细胞（HSC）出现与迁移过程中的作用，16 并研究斑马鱼发育过程中基质细胞在造血干细胞和祖细胞微环境中的作用 17.
与小鼠不同，斑马鱼胚胎具有透明性，可在异种共生发育过程中直接观察细胞，这使得该系统具有独特的强大优势。然而，斑马鱼异种共生技术的应用受限于较高的学习难度，且在精细的胚胎上进行异种共生手术在缺乏详细指导和可视化演示的情况下具有较高的技术挑战性。本实验方案旨在提供一套清晰、分....
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方案
本方案已获波士顿儿童医院动物护理与使用委员会批准。本方案改编自先前发表的方法15。
1. 试剂的准备（提前数天或数周）
- 制备1.5%琼脂糖包被的培养皿。 将1.5 g琼脂糖加入100 ml斑马鱼E3培养基中，置于锥形瓶内。加热溶解后，将约5 ml液体倒入直径100 mm、深度20 mm的培养皿中。
注意：这些培养皿用于胚胎去壳（步骤 3.1）和异体共生手术（步骤 3.3）。将琼脂糖包被的培养皿在 4 °C 下保存数周；在进行异体共生手术当天早晨，从冰箱中取出并恢复至室温。 - 制备4%甲基纤维素溶液。 在锥形瓶中加入4 g甲基纤维素粉末和100 ml E3溶液，并放入搅拌子。将锥形瓶置于4 °C的搅拌台上，调至最低转速，持续搅拌最多2天。
- 间歇使用刮勺将甲基纤维素的白色结块打散。在此浓度下，甲基纤维素晶体不会完全溶解。当溶液变得澄清、均匀且无白色结块残留时，将溶液分装至1.5 ml离心管中，并于-20 °C冷冻保存以长期储存。
注意：可使用较低浓度的甲基纤维素；然而，这种较高百分比、黏稠度更高的甲基纤维素效果最佳。
- 间歇使用刮勺将甲基纤维素的白色结块打散。在此浓度下，甲基纤维素晶体不会完全溶解。当溶液变得澄清、均匀且无白色结块残留时，将溶液分装至1.5 ml离心管中，并于-20 °C冷冻保存以长期储存。
- 配制高钙任氏液（HCR）溶液。 配制 400 ml HCR 溶液，需混合 8 ml 5M NaCl（终浓度 116 mM）、400 µl 3M KC....
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结果
与先前已发表的研究一致15，斑马鱼胚胎成功进行异时共体融合取决于两个胚胎的发育时期、相对方向以及甲基纤维素的浓度。仅使用几种简单且低成本的工具，即可通过手术融合正在发育的囊胚，使其发育为具有共享血液循环的异时共体胚胎。这些工具包括一支经改造的巴斯德移液管、一个10 ml移液泵，以及带木质手柄的解剖针，后者可单独使用，也可在末端通过实验室封膜固定加样枪头或玻璃显微注射针后使用（图1）。
将两个囊胚置于4%甲基纤维素中，并使用加样枪头调整其位置，使它们的动物极相对（图2A），然后用玻璃显微注射针在两个胚胎接触点处小心地造成损伤（图2B）。更严重的损伤（比较图2B与图2C），以及对胚胎对重新进行额外损伤以加强初始连接，可提高胚胎维持连接并成功融合的可能性（
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讨论
异体共生融合技术一直是研究成年小鼠模型和鸡胚中候选基因细胞功能的有力工具10-14。最近，已有研究描述了一种囊胚融合方法，用于生成连体的斑马鱼胚胎15。在本实验方案中，通过基于视频的教程演示并更详细地描述如何创建具有不同遗传背景的异体共生斑马鱼胚胎，以研究目标候选基因在造血发育及其他过程中所发挥的时间特异性、细胞内在性和细胞外在性作用。
本文所述方法最近被用于追踪一个胚胎中造血干细胞（HSC）的出现、通过血液循环迁移至遗传背景不同的另一胚胎，以及随后的植入与分化过程16。与Kissa研究组的发现一致，胚胎的发育阶段和相对位置被证实会影响异种共生融合的成功率及解剖学特征。通过对实验方案进行几项关键性改进，异种共生体的存活率显著提高。这些改进包括：对囊胚造成更明显的损伤，刺穿后将针头保持在原位2–3秒，随后在15分钟后重新检查囊胚配对情况，如有必要，通过额外的损伤操作加强初始连接。根据这些补充建议，几乎100%的异种共生体存活并保持连接状态，其中75%实现了共用血液循环。
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
感谢朱莉·R·珀林对本文手稿提出的宝贵意见。D.I.S. 的研究得到了美国血液学会、库利氏贫血基金会以及美国国立卫生研究院（NIH，资助号 K01DK085217 和 R03DK100672）的资助。E.J.H. 是霍华德·休斯医学研究所海伦·海·惠特尼基金会研究员。B.L. 是霍华德·休斯医学研究所医学研究研究员。B.W.B. 的研究得到了癌症研究所欧文顿奖学金以及美国临床肿瘤学会（ASCO）征服癌症基金会青年研究者奖的资助。L.I.Z. 的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH，资助号 R01CA103846、P01HL032262 和 R01HL04880）、塔布骨髓增生异常综合征研究基金会以及哈佛干细胞研究所的资助，同时是霍华德·休斯医学研究所的研究员。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 甲基纤维素 | Sigma | M0387 | |
| E3/HCR 所需的单独组分： | 配制 1L 溶液：14.61 g NaCl，0.63 g KCl，2.43 g CaCl2·2H2O，1.99 g MgSO4 | ||
| NaCl（氯化钠） | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl（氯化钾） | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2（二水合氯化钙） | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| MgSO4（七水合硫酸镁） | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Hepes（1 M）缓冲液 | ThermoFisher | 15630-080 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | |
| 抗生素： | |||
| 青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep） | Life technologies 公司旗下 Gibco | 15140-120 | |
| 氨苄青霉素钠盐 | Sigma Life Science | A0166 | |
| 来自卡那链霉菌的硫酸卡那霉素 | Sigma Life Science | K1377 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | |
| 来自灰色链霉菌的 50 mg/ml 蛋白酶 K（Pronase） | Roche | 11459643001 | |
| 用于制备针头的毛细玻璃管（Capillary Glass & Filaments） | Sutter Instrument | 货号：BF 100-50-10 | |
| 带木质手柄的解剖镊（Teasing needles） | Fisher Scientific | S07894 | |
| 玻璃巴斯德移液管 | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| 10 ml 移液泵（绿色）（Pipette Pump Pipettor） | Novatech International | F37898-0000 | |
| 直径 100 mm、深度 20 mm 的塑料培养皿（PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG） | Greiner Bio-one | 664102 | |
| 右旋糖酐，级联蓝（Cascade Blue），分子量 10,000，阴离子型，赖氨酸可固定 | ThermoFisher | D-1976 | |
| PTU。工作液浓度为 0.003%（50 倍浓缩液为 0.15%）。配制 500 ml 溶液需加入 0.75 g N-苯硫脲 | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 三卡因（Tricaine，粉末）（Tricaine Methanesulfonato，Tricaine-S） | Western Chemical Inc | MS 222 | |
| 低熔点琼脂糖（Ultrapure LMP agarose） | Invitrogen | 16520100 | |
| 塑料移液管（仅使用宽口端） | Fisherbrand | 137115AM | |
| 用于成像的玻璃底六孔板 | MatTek | P06G1.5-20-F | |
| 固定在木质手柄解剖针末端的塑料 Western 上样枪头（GELoader tips） | Eppendorf | 22351656 | |
| 若需为直立显微镜封片，则需玻璃盖玻片、载玻片及真空脂： | |||
| 真空脂（Dow Corning® 高真空硅脂 无色，5.3 盎司/管） | Dow Corning | Z273554 | |
| 玻璃盖玻片 | Corning Life Sciences | 2960-244 |
参考文献
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
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