原代人支气管上皮细胞难以转导。本方案描述了慢病毒的制备与浓缩方法，以及在这些细胞向假复层上皮分化过程中实现高效转导所需的最适培养条件。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
体外培养原代人支气管上皮（HBE）细胞，采用气液界面条件，为研究气道上皮细胞的分化和功能过程提供了一个有用的模型。近年来，使用慢病毒载体进行外源基因递送已成为常规做法。尽管已有报道显示某些非HIV假型慢病毒可转导完全分化的气道上皮细胞，但总体转导效率通常低于15%。本文所介绍的方案提供了一种可靠且高效的慢病毒制备及转导原代人支气管上皮细胞的方法。在细胞贴壁阶段，使用未分化的支气管上皮细胞，在支气管上皮生长培养基中进行转导，并以感染复数（MOI）为4的条件，可实现接近100%的转导效率。本方案逐步描述了高滴度慢病毒载体的制备与浓缩过程以及转导操作流程，并讨论了为实现原代人支气管上皮细胞高效转导而确定最佳培养条件的相关实验。
引言
复制缺陷型假型慢病毒（LV）的开发为研究人员提供了一种安全且高效的体外递送转基因的方法in vitro 1。由于其具有长期表达的特性，这些LV还可用于体内递送治疗性因子in vivo 2,3。LV的生产需要将多种质粒共转染至人胚胎肾（HEK）细胞中：包括转移载体、包装用gag/pol质粒、包装用rev质粒以及包膜水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）质粒。第三代包装系统比第二代系统更安全，原因是rev基因被编码在独立的包装质粒上，从而降低了发生重组产生具有复制能力的慢病毒的可能性。尽管第二代包装系统产生的总转导单位高出五倍，但将原始病毒基因组拆分以构建第三代系统仅使转导效率出现轻微下降3,4。
尽管细胞系更容易且更高效地进行转导，研究人员已将研究重点转向原代细胞，因为后者更能代表 体内 组织 5,6然而，原代细胞难以被转导。尽管已有报道成功转导完全分化的气道上皮细胞，但总体效率未超过15% 7.
本文介绍了一种可产生高滴度慢病毒（LV）的实验方案。该方案通过逐步操作，可实现对原代人支气管上皮（HBE）细胞接近100%的转导效率。更具体而言，本方案描述了成功所必需的最佳培养条件3
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 第一阶段：HEK 293T 细胞培养
- 配制HEK细胞培养基（简称HEK培养基），即将10%（v/v）胎牛血清（FBS）和1%（v/v）青霉素/链霉素加入高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。
- 用I型胶原包被一个10 cm组织培养皿。将30 µl I型胶原与2 ml蒸馏水混合，将混合液均匀涂布于培养皿表面，在37 °C、5% CO₂条件下孵育2小时。2.
- 移除混合液，将培养皿置于超净工作台中干燥15分钟。
- 将HEK细胞以1 x 10的密度接种至包被的培养皿中6 细胞置于10 ml HEK培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下培养2.
- 当 HEK 细胞融合度达到 50-60% 时（图1a，铺板后2-3天，进入第2阶段。通过肉眼评估汇合度即可，无需定量。
注意：HEK 细胞在 HEK 培养基（见上文）中培养。当细胞达到汇合状态时，可进行传代例如 1/5）或冷冻保存以备后续使用。
2. 第二阶段：在 HEK 细胞中生产与浓缩慢病毒（LVs）
注意：在美国，这些实验方案应在符合机构和政府法规的前提下，在 BSL-2+（加强型 BSL-2）条件下实施。
- 使用钙沉淀法进行转染（脂....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
图1展示了转染过程中评估细胞和溶液的不同关键步骤。图1a显示了用于病毒生产的HEK293T细胞在转染前的最佳汇合度。重要的是，细胞应在培养皿中均匀分布。图1b通过明场光学显微镜和10倍物镜显示了转染混合液滴中的沉淀物。沉淀物越接近沙粒状而非团聚状，转染效率越高。在此图中，沉淀物略显粗糙。沉淀物是判断转染是否能产生高滴度病毒的可靠指标。如果任一组分缺失或质量不佳（例如载体DNA），将会形成团聚物，这是不良的征兆。若出现这种情况，更明智的做法是中止并重新开始实验，确保所有组分均已加入，并/或检查载体DNA和包装DNA的质量。图1c显示了与图A相同培养皿在过夜孵育后的状态。沉淀物（且应当）可见于细胞之间。我们注意到，转染后24小时内细胞增殖不明显。
图2展示了HBE细胞在转导前及转导后3天的.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案可确保接近100%的转导效率。然而，为实现这一目标，操作过程中有几个关键步骤至关重要。例如，在转染过程中，转导混合液（液滴）中或转导后第二天培养皿中出现沉淀物（图1b和d）是成功转染的重要指标。若无沉淀物或出现团块，可能是由于遗漏了某种转染试剂、pH值问题或质粒制备质量不佳所致。如果未形成沉淀，则次日很可能也观察不到沉淀。此外，若加入转染混合液或HEK培养基的速度过快，可能导致HEK细胞脱落，从而影响转染效率和病毒产量。另一个判断产量良好的指标是在第6天离心前：离心管底部应可见白色沉淀物。若转染失败，病毒产量极低，则不会形成该白色沉淀。在转导过程中，为获得高转导效率，必须使用已去分化的、处于类似干细胞状态的原代人支气管上皮（HBE）细胞。使用携带易于观察的荧光蛋白（如eGFP或mCherry）的载体也是一种有效的工具。
可根据不同的原代细胞对本方案进行调整。一种方法是降低培养基中的钙离子浓度。如图3a所示，使用钙离子浓度较低的BEGM培养基可显著提高原代HBE细胞的转导效率。.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢迈阿密大学生命联盟器官回收机构提供肺组织。同时感谢Lisa Künzi博士为图2B和图3-D所示实验提供的DNA样品，感谢Ben Gerovac博士和Lisa Novak提供用于图3A至图3C实验的mCherry病毒。我们还感谢迈阿密大学眼科系影像中心的Gabriel Gaidosh。
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）、囊性纤维化基金会和空乘人员医学研究所向Matthias Salathe博士提供的资助支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HEK293T/17 细胞 | ATCC | CRL-11268 | |
| 胎牛血清 (FBS) | Sigma | 12306C | 使用浓度为 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| 青霉素/链霉素 (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | 使用浓度为 1x |
| 胶原蛋白 I | BD Biosciences | 354231 | 用蒸馏水按 1:75 稀释 |
| Calphos | Clontech | 631312 | 转染试剂盒，包含 2 M 氯化钙溶液、2x HEPES 缓冲液 (HBS) 和无菌 H2O |
| 聚乙二醇 8000 | VWR scientific | 101108-210 | 40% 储存液 |
| 两性霉素 B | Sigma | A9528 | 使用浓度为 1x |
| 胰蛋白酶 | Sigma | T4799 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12 mm | Corning | 3460 | |
| 胶原蛋白 IV | Sigma | C7521 | 用蒸馏水按 1:10 稀释 |
| 六亚甲基溴化铵 | Sigma | H9268 | 2 mg/mL 储存液 |
| 嘌呤霉素 (10,000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | 使用浓度为 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | 慢病毒表达载体 |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | 包装质粒 DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | 包装质粒 DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | 包装质粒 DNA |
参考文献
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Jr Gene thera....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
