我们建立了一种神经损伤方法，用于可靠地检测小鼠肌肉的再神经支配，从而研究神经肌肉接头的再生。该技术通过一种简单且高度可重复的手术损伤腓总神经来实现。随后通过将趾长伸肌进行整体封片来评估肌肉的再神经支配情况。
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摘要
摘要
神经肌肉接头（NMJ）在衰老、损伤和疾病过程中会发生有害的结构和功能改变。因此，深入了解参与维持和修复神经肌肉接头的细胞与分子变化至关重要。为此，我们建立了一种可重复且稳定的方法，用于检测小鼠中再生的神经肌肉接头。该神经损伤方法包括压迫腓总神经，该神经在膝关节附近经过腓肠肌肌腱的外侧头。使用70日龄的雌性小鼠，我们发现运动轴突在压迫损伤后7天内开始重新支配原有的突触后位点，并在12天内完全恢复对原有突触区域的占据。为评估该损伤方法的可靠性，我们比较了不同70日龄雌性小鼠之间的再支配速率。结果显示，在损伤后7天、9天和12天，各小鼠之间重新支配的突触后位点数量相似。为验证该损伤模型是否也可用于比较肌肉中的分子变化，我们检测了肌肉烟碱型受体γ亚基（gamma-AChR）和肌肉特异性激酶（MuSK）的表达水平。gamma-AChR亚基和MuSK在失神经支配后显著上调，并在神经肌肉接头再支配后恢复至正常水平。我们发现这些基因的转录水平与肌肉的支配状态密切相关。我们认为，该方法将加速我们对修复神经肌肉接头及其他突触过程中所涉及的细胞与分子机制的理解。
引言
在年轻成年且健康的动物中，神经肌肉接头（NMJ）是突触前成分（即α运动神经元轴突末梢）与突触后成分（即肌纤维上富含烟碱型乙酰胆碱受体（AChRs）的特化区域）之间高度稳定的连接结构1。突触前与突触后结构的近乎完美对位，对于正常的神经传导、α运动神经元和肌纤维的存活以及运动功能至关重要。然而，神经肌肉接头的功能会受到衰老、肌萎缩侧索硬化症（ALS）等疾病、自身免疫性疾病以及肌肉和周围神经损伤的不利影响2-5。这些损伤常导致突触前神经末梢退化，使肌肉失去神经支配，显著影响运动能力。因此，识别能够维持和修复神经肌肉接头功能的分子已成为研究重点。由于周围神经具有再生能力并可重新支配靶组织，周围神经损伤模型已被广泛用于研究再生过程中神经肌肉接头相关的分子变化。
周围神经损伤模型通常包括完全切断或挤压特定的神经分支6。切断后，神经内膜管需要重新形成，从而延迟了轴突再生及其对靶细胞和组织的再支配。此类损伤的严重性还会导致轴突偏离原有路径，使其无法到达原始靶点。相比之下，挤压性神经损伤保留了神经内膜的连续性，为再生轴突的有效且正确的重新生长提供了通路。此外，它还允许轴突寻找并重新支配其原始的肌纤维伙伴。无论采用何种损伤模型，轴突要实现再生并重新支配靶点，都必须发生一系列细胞和分子层面的变化。损伤发生后，靠近靶组织的近端神经片段会通过一种称为沃勒变性（Wallerian Degeneration）的过程被分解和清除7。该过程涉及施万细胞重编程并去分化为非髓鞘形成细胞，这些细胞可分泌促再生因子、清除髓鞘，并募集巨噬细胞至损伤部位8。巨噬细胞进一步完成髓鞘和轴突碎片的清除，否则这些残余物将阻碍再生轴突的生长9。与此同时，运动神经元和感觉神经元会激活促进其断裂轴突再生所需的机制。当再生轴突到达靶点后，必须由生长锥转变为能够正常传递（运动轴突）或接收（感觉轴突）信息的功能性神经末梢10。在此过程中，α-运动轴突经历一系列高度协调的变化，最终使其生长锥分化为一个功能完整的突触前末梢，该末梢几乎精确地与靶肌纤维上的突触后部位相对应11。
坐骨神经、胫神经和副神经一直是研究轴突和神经肌肉接头（NMJ）再生的主要选择12-14。然而，使用这些模型来比较不同动物之间或不同条件下再生NMJ相关的细胞和分子变化时，存在诸多局限性。首先，坐骨神经支配后肢大部分肌肉，其损伤会显著限制动物的运动和感觉功能，因此无法利用该方法单独研究运动的影响，或运动与其他因素的联合作用。此外，坐骨神经结构较粗，需要施加较大的压迫力才能完全损伤所有轴突。这可能导致表层轴突被完全切断，而深层轴突的神经内膜管仍保持完整，从而造成不同轴突之间再生速度和准确性的显著差异。若对该神经进行完全横断，则更为不利，因为许多轴突将无法重新连接到原有的肌纤维。更为复杂的是，坐骨神经本身在终末分支的数量和起源位置上存在固有的解剖学变异，因此很难在相同位置制造损伤。尽管胫神经较小，更适合进行压榨性损伤，但该神经分支也缺乏易于识别的解剖标志，无法作为可靠的损伤定位点。
支配胸锁乳突肌的副神经分支（属于第XI对脑神经）也曾被用于研究神经肌肉接头（NMJ）的再生15。该神经具有特殊优势，因为与其它肌肉中的神经肌肉接头相比，胸锁乳突肌内的神经肌肉接头在活体动物中更易于成像观察。但与坐骨神经和胫神经类似，该神经缺乏可用于在相同位置进行损伤的特定解剖标志，从而限制了其作为实验队列中个体动物间NMJ再生比较模型的应用。损伤部位的不一致会导致NMJ再支配速率的变异性。由于上述局限性，本文所介绍的方法采用损伤另一分支周围神经的方式来研究再生中的神经肌肉接头。
腓总神经（也称为腓总神经）具有多种特征，使其成为在不同动物及不同处理条件下研究神经肌肉接头（NMJ）再生的可靠神经。腓总神经在解剖路径上具有可预测性，当其经过膝部腓肠肌外侧头肌腱时，该交界处可作为损伤定位的稳定解剖标志。该神经可通过一个微小且微创的切口暴露，切口位置靠近但解剖上独立于目标肌肉。本文展示的结果表明，在70日龄的年轻雌性小鼠中，腓总神经受压损伤后8天，再生的运动轴突开始在趾长伸肌（EDL）中重新形成神经肌肉接头（NMJ）。重要的是，在同龄同性别动物之间，再支配的模式和速率具有一致性，因此提供了一个可靠的损伤模型，将显著加快我们对维持和修复神经肌肉接头所需细胞与分子变化的理解。
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方案
所有实验均在NIH指南下进行，并经弗吉尼亚理工大学机构动物护理和使用委员会批准的动物实验方案许可。
1. 手术前动物准备
- 使用无菌1 ml胰岛素注射器，通过皮下腹股沟注射给予小鼠氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物进行麻醉。载体溶液包含0.9%生理盐水、17.4 mg/ml氯胺酮和2.6 mg/ml赛拉嗪。注射后将动物放回笼中，等待药物起效。
注意：如果初始剂量在操作过程中未能提供足够的麻醉效果，可追加注射初始剂量的25%。 - 注射后监测动物，检查呼吸频率是否稳定以及意识水平是否适当降低。通过夹捏后肢足部来检测意识水平，当麻醉充分时应无反应。
注意：对于平均体重为25至30 g的年轻成年小鼠，通常需要3-5分钟。如果动物在注射后10分钟仍存在反应，可追加注射麻醉初始剂量的25%。 - 将凡士林和轻质矿物油眼用软膏涂抹于动物眼睛表面，以防止干燥。将动物从笼中取出，置于清洁、平坦的表面上。使用电动毛发修剪器从足部至骨盆剃除所需后肢的毛发，仅暴露肢体的外侧区域。
- 在剃毛部位涂抹脱毛剂，作用1分钟。使用实验室擦拭纸手动清除毛发。用浸有乙醇的实验室擦拭纸清洁脱毛区域。
2. 手术操作
- 通过高压灭菌器或其他适当方法对手术器械进行灭菌。用80%乙醇/H2O清洁手术区域和手术板。用聚维碘酮对手术区域进行消毒。 将小鼠置于手术板上，并固定四肢。使目标后肢保持解剖学自然位置，膝关节轻微伸展，无内旋或外旋。
- 将动物和手术板置于手术显微镜下。通过触诊浅表解剖标志确定正确的切口位置，特别是骨性膝关节以及胫前肌与腓肠肌之间的肌嵴。
- 使用手术刀或弹簧剪在皮肤上做一条约3 cm的切口，同时用普通镊子夹持组织。切口方向应垂直于腓总神经的走行方向。
- 继续切开浅筋膜，暴露股二头肌和股外侧肌。通过切开连接的深筋膜分离这两块肌肉。切开1-2 cm即可。
- 使用机械牵开器将股二头肌向尾侧牵拉，以暴露腓总神经。
- 沿神经向近端追踪，直至找到其与腓肠肌外侧头肌腱的交汇处。注意：充分暴露可能需要进一步调整已牵开的皮肤和肌肉。该交汇处将作为神经损伤的稳定解剖标志。
- 用精细镊子夹住神经，使镊尖与腓肠肌肌腱外侧缘平行。对腓总神经施加稳定而有力的压力，持续挤压5秒。
- 通过手术显微镜目视确认神经是否完全压伤。损伤部位将呈现半透明状。若使用在外周轴突中表达荧光蛋白的小鼠，损伤部位的荧光将消失。
- 移除牵开器，将肌肉复位至其解剖位置。用6-0丝线缝合切口，1-3针间断缝合即可。将恢复中的小鼠置于清洁笼盒内的加热垫上。
- 术后监测所有动物2小时，观察呼吸情况及对麻醉的任何不良反应。手术恢复后立即通过皮下腹股沟注射给予首剂布托啡诺（0.05-0.10 mg/kg）。在接下来的48小时内，每12小时追加一次给药，共追加3次。完全恢复后，将小鼠送回动物饲养设施。
3. 拇长伸肌（EDL）肌肉的分离与染色
- 使用异氟烷处死动物。将0.5 ml液态异氟烷加入一个装有吸水实验室擦拭纸的50 ml离心管中。将未加盖的离心管与动物一同放入密闭的2,500 cm³容器内3 腔室。至少暴露4分钟即可。通过检测双侧眼睑反射、趾夹反射和尾夹反射的消失，确认每只动物在进行灌注前已处于无意识状态。
- 经心脏灌注16 先用 10 ml 0.1 M PBS 灌注动物，随后用 25 ml 含 4% 多聚甲醛的 0.1 M PBS（pH 7.4）灌注。可在 PBS 中加入肝素（30 单位/20 g 动物体重，终浓度 10 单位/ml）以防止小毛细血管床内血液凝固，从而改善灌注效果。
- 使用剪刀在腹部周围横向剪开覆盖后肢的皮肤，将其剥离至后肢及足部以下，用镊子完成剥离。
- 用镊子夹住并剥离后肢的浅筋膜。若使用外周轴突表达荧光蛋白的小鼠，将整只小鼠置于50 ml离心管中，用4% PFA过夜后固定。用PBS冲洗三次。
注意：固定后的小鼠可保存在4 °C的PBS中。若不进行此步骤，则跳过本步骤，无需对动物进行后固定，直接进入步骤3.6。 - 分离EDL肌肉18 从小鼠后肢获取肌腱时，应尽量保持近端和远端肌腱的完整性。
- 将EDL肌肉在封闭缓冲液（含0.5% Triton X-100、3% BSA和5%山羊血清的1x PBS）中孵育至少1小时。
- 为了可视化运动轴突及其神经末梢，将肌肉置于含有神经丝蛋白抗体（1:1,000）和突触结合蛋白-2抗体（1:250）的试管中，用封闭缓冲液稀释后孵育3天。随后用1×PBS缓冲液洗涤肌肉3次，每次10分钟。注意：若使用在外周轴突中表达荧光蛋白（XFP）的小鼠，则可省略此步骤。
- 将对侧未受伤的EDL染色，作为神经肌肉接头完全支配的阳性对照。阴性对照应包括损伤后4天获取的EDL，此时神经肌肉接头已完全失神经支配，以及仅用二抗染色的EDL。
- 用适当的荧光标记二抗孵育肌肉组织，以检测神经丝蛋白和突触结合蛋白-2，孵育1天。用1×PBS缓冲液洗涤肌肉组织3次，每次10分钟。注意：此步骤可与步骤3.10同时进行。若使用在外周轴突中表达荧光蛋白的小鼠，则可省略此步骤。
- 为了可视化神经肌肉接头的突触后区域，将肌肉与含5 µg/ml Alexa-555标记的α-银环蛇毒素（alpha-bungarotoxin）的封闭缓冲液孵育，孵育时间至少为2小时。随后用1x PBS缓冲液洗涤肌肉三次，每次10分钟。
- 将整块肌肉置于带正电荷的玻片上，直接将肌肉放置在玻片表面，滴加数滴基于甘油的封片剂，盖上盖玻片。轻压盖玻片使其与玻片贴合，从而压平肌肉组织。使用实验室擦拭纸吸除玻片与盖玻片边缘多余的封片剂。用指甲油密封盖玻片与玻片之间的缝隙。
4. 成像与数据分析
- 为分析神经肌肉接头（NMJ）的结构，使用配备有488、555和633 nm激发光源的共聚焦激光扫描显微镜对趾长伸肌（EDL）进行成像，并采用20倍和40倍物镜采集发射光信号。
- 为观察完整的神经肌肉接头，对从神经肌肉接头最底部至最顶部可见区域、以1至2 μm间隔获取的光学切片创建最大强度投影图像。使用 commercially available imaging software（商用成像软件）生成最大强度投影图像。
- 为确定再支配速率，将神经肌肉接头分为以下类别：1）完全失神经支配 = 突触后位点完全无轴突接触，轴突与乙酰胆碱受体（AChRs）之间的共定位小于5%；2）部分神经支配 = 轴突与突触后区域部分重叠，轴突与AChRs之间的共定位为5–95%；3）完全神经支配 = 突触前与突触后结构几乎完全对应，轴突与AChRs之间的共定位大于95%。排除垂直于成像平面或在图像中未能完整显示的神经肌肉接头。注意：在所有这些实验中，每组至少检测3只动物，每只动物分析不少于50个神经肌肉接头。采用学生t检验进行显著性判断，P值小于0.05视为具有统计学意义。
- 为实现操作者盲法，可由不同人员分别执行手术和图像分析。分析人员在不知晓处理分组的情况下，可对神经肌肉接头评分保持客观。或者，可将图像随机化后提供给操作者进行分析，使其无法获知图像来源动物的信息。
5. 定量 PCR
- 使用异氟烷和颈椎脱位法处死动物。按照步骤 3.3 去除覆盖腿部肌肉的皮肤和浅层筋膜。按照步骤 3.4 分离胫骨前肌和趾长伸肌（EDL）肌肉。
- 将完整的胫骨前肌和趾长伸肌（EDL）肌肉置于 1.5 ml 离心管中，在液氮中快速冷冻。将组织从离心管中取出，放入预冷的研钵中（研钵部分浸入液氮）。使用研钵和研杵将冷冻肌肉研磨成细粉。
- 将冷冻的肌肉粉末溶解于市售的 RNA 提取试剂中，并按照制造商说明书，使用市售试剂盒进行 RNA 提取和基因组 DNA 去除。
- 按照制造商说明书，使用市售的逆转录酶混合物进行逆转录反应。
- 使用市售试剂盒进行定量 PCR（qPCR），选择适当的看家基因（见材料表）。使用市售的定量 PCR 扩增仪执行 PCR（见材料表）。
- 退火温度设置为 58 °C。根据 Taq 聚合酶/SYBR Green 混合物制造商的说明调整其他扩增参数。在扩增仪程序中加入最终的熔解曲线步骤，温度从 65 °C 以 0.5 °C 递增至 95 °C，用于检测引物特异性和引物二聚体形成。
- 采用 2-ΔΔCT 法21 计算相对 mRNA 表达水平，以 18S RNA 作为对照基因。
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结果
腓总神经（也称为腓总神经）起自腘窝上方的坐骨神经，绕过腓骨头至小腿前侧（图1A）。在此处，该神经分为腓浅神经和腓深神经，共同支配足部和脚趾的背屈肌（胫骨前肌、趾长伸肌和趾短伸肌、拇长伸肌），以及足部的外翻肌（腓骨肌）。该神经还含有感觉纤维，投射至足背及小腿下半部的外侧。它是一种相对较细的结构，由运动和感觉轴突组成。该神经分支走行路径明确且可预测。在膝关节外侧，神经走行于腓肠肌外侧头肌腱表面，位置较浅表（图1和图2）。这一位置可作为稳定的解剖标志，通过小切口即可到达，从而减少对皮肤和筋膜的损伤（图1A）。与坐骨神经和胫神经相比，该神经直径较小，因此使用较小的压力即可压伤所有轴突，降低表层轴突被完全切断的可能性。
仅在神经元中表达黄色荧光蛋白（YFP）的小鼠17被用于优化腓总神经的压榨操作，并清晰地可...
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讨论
本文所述方法为研究参与神经肌肉接头（NMJ）修复机制提供了独特的机会。该方法涉及在腓总神经经过膝关节附近腓肠肌腱处时对其进行压榨损伤。我们发现，仅用镊子压迫神经5秒后，损伤4天即可观察到完全变性。在年轻成年小鼠中，α-运动轴突在损伤后7天开始重新支配趾长伸肌（EDL）中先前的突触位点，并在12天时完成突触前结构的重建，其形态与未损伤小鼠中的突触无法区分。此外，我们证明某些与NMJ相关的分子水平与NMJ的神经支配状态密切相关。重要的是，相同性别和年龄的动物之间，这些细胞和分子变化具有高度可重复性（图5a-b），从而为识别和验证参与NMJ修复的因素提供了可能。在手术操作方面，腓总神经分支在经过腓肠肌腱时位置表浅、易于暴露，仅需做小切口，对周围肌肉和血管系统的损伤极小。
使用腓总神经研究与再生神经肌肉接头（NMJ）相关的细胞和分子变化具有多项优势。腓肠肌肌腱可作为稳定的解剖标志，确保每次损伤腓总神经的位置及其与靶肌肉的距离保持一致。这使得能够在相同年龄和性别的动物之间可靠地比较轴突再生和肌肉再支配的速率。实现这一成功的关键步骤包括：确保每次手术的损伤部位...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Valdez实验室成员对实验设计提供的学术建议以及对稿件的评论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯胺酮 | VetOne | 501072 | |
| 赛拉嗪 | Lloyd Inc. | 003437 | |
| 丁丙诺啡 | Zoopharm | 1Z-73000-150910 | |
| Nair | Nair | ||
| Kim-wipes 擦拭纸 | Kimtech | 34155 | |
| 电动剃须刀 | Braintree Scientific | CLP-64800 | |
| 80% EtOH/H20 | |||
| 10% 普尔维碘 | |||
| 1 ml 胰岛素注射器 | |||
| 弹簧剪 | Vannas | 91500-09 | |
| 15号手术刀 | Braintree Scientific | SSS 15 | |
| #5 镊子 | Dumont | 11252-00 | |
| 带反向切割针的6-0丝线缝合线 | Suture Express | 752B | |
| 啮齿类动物加热垫 | Braintree Scientific | AP-R-18.5 | |
| Alexa 555 标记的α-BTX | Molecular Probes | B35451 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| Olympus 体视变倍显微镜 | Olympus | 562037192 | |
| Zeiss 700 共聚焦显微镜 | Zeiss | ||
| 可调流速蠕动灌注泵 | Fisher Scientific | 13-876-3 | |
| Aurum 总RNA微型试剂盒 | Bio-Rad | 7326820 | |
| Bio-Rad iScript RT Supermix | Bio-Rad | 1708840 | |
| SsoFast Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1725200 | |
| Bio-Rad CFX96 | Bio-Rad | 1855196 | |
| Puralube Vet 软膏 | Puralube | 1621 | |
| 突触结合蛋白-2 抗体 | Antibodies-Online | ABIN401605 | |
| 神经丝蛋白抗体 | Antibodies-Online | ABIN2475842 |
参考文献
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