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方法文章

利用原子力显微镜、冲击压痕和流变仪表征脑组织的多尺度力学特性

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DOI：

10.3791/54201

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2016年9月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4Department of Neurology, The F.M. Kirby Neurobiology Center, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

本文内容

摘要

我们介绍了一组用于表征大脑在微观、介观和宏观尺度下的黏弹性力学特性的技术。

摘要

为了设计和构建受大脑特性启发的材料，无论是用于力学模拟还是组织再生研究，都必须在不同的空间和时间尺度上对脑组织本身进行充分表征。与许多生物组织类似，脑组织具有复杂的层级结构。然而，与其他大多数组织不同的是，脑组织的力学刚度极低，其杨氏弹性模量 E 仅为数百帕斯卡（Pa）量级。这种低刚度特性给关键力学性能的实验表征带来了挑战。本文展示了多种经过改进的力学表征技术，可用于在不同长度尺度和加载速率下测量脑组织等水合、柔软生物材料的弹性与黏弹性特性。在微米尺度上，我们采用原子力显微镜辅助的压痕法进行蠕变柔量和力松弛实验；在介观尺度上，使用基于摆锤的仪器化压痕仪进行冲击压痕实验；在宏观尺度上，则通过平行板流变仪测定频率依赖性的剪切弹性模量。我们还讨论了每种方法所面临的挑战与局限性。综合这些技术，可实现对脑组织的深入力学表征，有助于更好地理解脑的结构，并推动仿生材料的工程化设计。

引言

构成生物器官的大多数软组织在力学和结构上具有复杂性，与矿化骨组织或工程材料相比刚度较低，并表现出非线性和与时间相关的变形特性。与其他人体组织相比，脑组织表现出显著的柔顺性，其弹性模量 E 数量级约为数百帕斯卡（Pa）1。脑组织在结构上具有异质性，灰质与白质区域分明且相互交错，功能上也存在差异。理解脑组织的力学特性有助于设计材料和计算模型，以模拟脑组织在损伤过程中的响应，促进对机械性损伤的预测，并推动防护策略的工程化设计。此外，这些信息还可用于确定组织再生的设计目标，并加深对与多发性硬化症和自闭症等疾病相关的脑组织结构变化的理解。本文中，我们介绍并演示了多种可用于表征包括脑组织在内的柔顺性软组织在微、中、宏观尺度下黏弹性特性的实验方法。

在微尺度上，我们采用原子力显微镜（AFM）压痕技术进行了蠕变柔量和力松弛实验。通常，AFM压痕技术用于估算样品的弹性模量（或瞬时刚度）2-4。然而，同一仪器也可用于测量微尺度下的黏弹性（与时间或速率相关）特性5-10。这些实验的原理如图1所示：将AFM悬臂探针压入脑组织，保持特定大小的作用力或压入深度，并随时间测量相应的压入深度或力的变化。利用这些数据，可分别计算蠕变柔量JC和松弛模量GR。

在介观尺度上，我们在保持组织结构和水合水平的液体浸没条件下，使用基于摆锤的仪器化纳米压痕仪进行冲击压痕实验。实验装置如图2所示。当摆锤摆动并与组织接触时，记录探针位移随时间的变化，直至振荡的摆锤在组织内停止运动。根据探针产生的阻尼谐振振荡运动，可计算组织的最大穿透深度xmax、能量耗散能力K以及耗散品质因子Q（反映能量耗散速率）11,12。

在宏观尺度上，我们使用平行板流变仪来量化组织的频率依赖性剪切弹性模量，即储能模量 G' 和损耗模量 G"。在这种流变测量中，我们在已知振幅和频率下施加谐波角应变（以及相应的剪切应变），并测量反作用扭矩（以及相应的剪切应力），如图3所示。根据测得的扭矩的振幅和相位滞后，以及系统的几何参数，我们可以计算在特定施加频率下的 G' 和 G"13,14。

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方案

伦理声明：所有实验方案均经波士顿儿童医院动物研究委员会批准，并符合美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的要求。

1. 小鼠脑组织获取流程（用于原子力显微镜压痕和冲击压痕）

  1. 配制氯胺酮/赛拉嗪混合物以麻醉小鼠。将5 ml氯胺酮（500 mg/ml）、1 ml赛拉嗪（20 mg/ml）与7 ml 0.9%生理盐水溶液混合。
  2. 按每克体重7 µl的剂量，向小鼠（品系：TSC1; Syn-Cre; plp-eGFP；年龄：p21；性别：雄性或雌性）注射氯胺酮/赛拉嗪混合溶液。
  3. 当小鼠完全麻醉（表现为对脚趾和尾部夹捏无反应）后，使用大型解剖剪进行断头处死。
  4. 使用较小的解剖剪沿颅骨中线剪开以移除颅骨。从小脑开始，用弯头镊子逐步取下颅骨碎片。移除颅骨后，使用平头铲匙从小脑端轻轻抬起脑组织，取出全脑并置于培养皿中。使用刀片将小脑从脑组织上切除。
  5. 若需使用完整脑组织对新鲜组织进行冲击压痕测试，请将脑组织转移至含有冰上CO2-非依赖性成年神经组织营养培养基的圆底管中，并进入第4节操作。否则进入步骤1.6进行切片处理。
  6. 调整振动切片机参数：切片速度设为0.7 mm/sec，振动频率为70 Hz，切片厚度为350 µm。在振动切片机周围放置冰块。在切片机载物台上滴加少量超级胶水，将脑组织固定，使其可进行冠状面切片，脑组织方向应确保首先切割背侧。
  7. 向振动切片机槽内加入足量杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），使脑组织刚好浸没。升高切片机槽位，使刀片刚好浸入DPBS中。
  8. 按下启动键，开始切割厚度为350 µm的冠状脑切片。
  9. 使用画笔转移脑切片，避免组织损伤，将切片从振动切片机的DPBS浴中转移至装有冰上CO2-非依赖性成年神经组织营养培养基的圆底管中，并在48小时内对新鲜组织完成测量。如需开始原子力显微镜（AFM）压痕实验，请进入第3节。

2. 猪脑组织获取流程（用于流变学）

  1. 从当地屠户处获取牺牲后约1小时内矢状切开的猪半脑。将半脑置于成年神经组织专用的CO2-非依赖性营养培养基中，并冰上保存。
  2. 使用剃刀刀片或手术刀制备约5 mm厚的冠状脑切片，并将其保存于成年神经组织专用的CO2-非依赖性营养培养基中。确保切片表面尽可能平整。在切片过程中使用剃刀或手术刀进行轻柔的侧向移动操作。
  3. 将猪脑组织置于成年神经组织专用的CO2-非依赖性营养培养基中，并在冰上保存，于48小时内对新鲜组织进行流变学测量（第5节）。

3. 原子力显微镜辅助压痕法

  1. 根据制造商说明，使用贻贝来源的生物粘合剂制备60 mm直径的培养皿（P60）。
    1. 配制含有 0.1 M 碳酸氢钠的中性缓冲液储备液，溶剂为无菌水，pH 值调至 8.0。使用 0.2 微米滤器对碳酸氢钠缓冲液进行过滤除菌，并储存于 4 °C.
    2. 在层流罩中，将6.25%贻贝来源生物粘合剂与3.125% NaOH的碳酸氢钠缓冲液混合。
    3. 移液器 100μl 将3.1.2中的生物粘附溶液加入直径为60 mm的培养皿（P60）中，并用移液器吸头将溶液铺展成直径3-5 cm的圆形区域。
    4. 将P60培养皿置于超净工作台中不盖盖子，让溶液自然干燥（约30分钟）。用PBS洗涤1次，再用无菌水洗涤2次。将培养皿在超净工作台中晾干，并存放于密封塑料袋中 4 °C 长达1个月。
  2. 校准原子力显微镜并将脑组织样本安装至原子力显微镜中。
    注意：请按照制造商的说明进行原子力显微镜（AFM）校准。
    1. 小心装载一个标称弹性常数为0.03 N/m的原子力显微镜探针 20 μm将直径为的硼硅酸盐玻璃珠放入探针架中。
    2. 使用热调谐法校准原子力显微镜悬臂梁的弹簧常数和倒光学杠杆灵敏度（InvOLS） 15,16.
      注意：一旦计算出原子力显微镜（AFM）探针的弹簧常数，其值在重复使用过程中应保持不变。然而，每次激光重新对准悬臂时，均需对InvOLS进行重新校准。此外，校准应选择比悬臂刚度高数个数量级的基底进行，例如聚苯乙烯。
    3. 打开载物台加热器并将温度设置为 37 °C.
    4. 将脑切片置于第3.1节中准备的P60培养皿上。
      1. 轻轻倒入 350 μm 厚脑切片，以及 CO2将无血清培养基从圆底烧瓶转移至涂有贻贝来源生物粘合剂的P60培养皿中。
      2. 轻轻倾斜P60培养皿，将脑片置于培养皿中央。如有必要，使用手动移液器缓慢吸取培养基，以展平发生折叠的脑片，或进一步调整脑片至培养皿中央位置。
      3. 使用P1000移液器小心吸除多余培养基（切勿使用真空泵）。
      4. 将盖子盖在P60培养皿上，让脑片贴附20分钟。
    5. 取下原子力显微镜（AFM）探头，将固定于P60培养皿中的脑片置于AFM载物台上，并加入约2 ml预热的CO₂饱和人工脑脊液2非依赖性培养基
    6. 在将原子力显微镜探针插入脑片周围的培养基时，为防止探针因表面张力而断裂，需小心地在探针上滴加一滴培养基。
    7. 将原子力显微镜（AFM）探头重新放置到载物台上，并开始降低探头，直至其浸入培养液中。
    8. 使用顶视CCD相机，将激光重新定位到悬臂上。
      注意：由于空气与介质的折射率不同，激光在悬臂上的对准位置会略有变化。
    9. 等待5分钟，使悬臂梁适应浸没在温热液体中的环境，然后重置镜面校准，使自由偏转为0 V。
    10. 根据制造商的说明，对原子力显微镜探针进行热谱扫描16利用第一个热峰的拟合结果重新计算培养基中AFM探针的InvOLS。
    11. 使用光学显微镜，移动样品台，使AFM探针下方对准目标脑区。
      注意：胼胝体会呈现较暗的外观，因其比周围的灰质更不透明。皮层位于胼胝体的上方。
    12. 将镜片校准重置为 0 V 的自由偏转状态。
    13. 在原子力显微镜软件的总和与偏转仪上，点击“Engage”以启动原子力显微镜探头。
    14. 使用原子力显微镜探头上的位置调节旋钮，降低探头直至悬臂与样品接触。
  3. （可选）如有需要，可按照前述方法测量样品的弹性模量 4,17,18.
  4. 进行蠕变柔量实验。
    1. 在软件的函数编辑器中构建一个施加力函数。该力函数包括一个持续0.1秒、上升至5 nN设定值的斜坡阶段，随后保持该力20秒，接着以1秒的斜坡下降至0 nN的施加力。
      1. 在压痕主控面板的压痕方法下，选择“Load”作为压头模式；“N”作为单位；“Function editor”作为压头函数。
      2. 在函数编辑器的“分段参数”面板中，创建一个力函数分段，起始值为 0 nN，结束值为 5 nN，持续时间为 0.1 秒。点击“插入”——>".
      3. 下一个片段中，将起始力设为 5 nN，结束力设为 5 nN，时间设为 20 秒。点击“插入”——>."
      4. 对于最后一段，将起始值设为 5 nN，结束值设为 0 nN，时间设为 1 秒。点击“绘制”，然后关闭函数编辑器窗口。
    2. 在主控面板的“力”选项卡中，勾选“触发后压头加载”，并将施加力的函数设置为在达到 0.1 V 的触发点后启动。
    3. 在主面板的“力”选项卡底部点击“单次力”，这将触发构建的施加力函数以实现蠕变柔量。
    4. 单次力压痕完成后，抬起原子力显微镜（AFM）探头，使其脱离与样品的接触，然后重新使探头与样品接触，并重新调零自由偏转。
    5. 重新定位样品台以找到新的感兴趣区域，然后降低原子力显微镜（AFM）探头使其与样品接触。注意：移动样品台时必须先将AFM探头从样品表面收回，否则可能导致精密的AFM悬臂损坏。
    6. 重复步骤 3.4.3–3.4.5，直至收集到所需数量的数据。
  5. 进行力松弛实验。
    1. 在软件的函数编辑器中构建一个应用压痕函数。该压痕函数包括一个持续 0.1 秒的斜坡，上升至设定点 3 μm 并保持20秒，随后在1秒内斜坡下降至压痕深度 0 µm.
      1. 在压痕主控面板的压痕方法下，选择“Indentation”作为压头模式；“m”作为单位；“Function editor”作为压头函数。
      2. 在函数编辑器的“段参数”面板中，创建一个从以下位置开始的施加力函数段 0 µm，结束于 3 µm，时间为0.1秒。点击“插入——”>".
      3. 接下来的部分，将起始位置设为 3 µm，结束 3 µm，时间设为20秒。点击“插入——”>."
      4. 对于最后一段，将开始位置设为 3 µm，结束 0 µm，时间设为1秒。点击“绘制”，然后关闭函数编辑器窗口。
    2. 在主控面板的“力”选项卡中，勾选“触发后压头加载”，并将施加力的函数设置为在达到 0.1 V 的触发点后触发。
    3. 在主面板的“力”选项卡底部点击“单次力”，将触发已构建的施加压痕功能以进行力松弛。
    4. 单次力压痕完成后，抬起原子力显微镜（AFM）探头，使其脱离与样品的接触，然后重新使探头与样品接触并重新归零偏转量。
    5. 移动载物台以定位新的感兴趣区域，并降低物镜头使其接触。
    6. 重复步骤 5.3–5.5，直至收集到所需数量的数据。
  6. 结束实验并进行清理。
    1. 实验结束后，升起原子力显微镜探头并将其从样品上移除。
    2. 使用实验室纸巾小心地吸去多余液体，避免触碰悬臂。
    3. 使用少量乙醇小心清洁原子力显微镜（AFM）悬臂梁支架。切勿将悬臂梁支架上的精密电子元件暴露于乙醇中。取下AFM悬臂梁并放入储存容器中。
    4. 按照适当的生物安全规程处理脑组织样本。
  7. 使用 MATLAB，根据 Lee 和 Radok（1960 年）推导的解，结合压头几何形状计算蠕变柔量和应力松弛模量 19.
    1. 计算力 F 和压痕深度 静力平衡方程，δ符号，教学公式，物理学习工具 来自悬臂位置的数据 z，偏转 d，以及弹簧常数， kc

      静力平衡方程 δ = d − z，用于平衡与位置分析的数学公式。 和 弹簧力公式 \(F=k_cd\)，用于静力平衡分析的方程。. 
    2. 使用 Lin 所述的算法在压痕曲线中确定接触点 等 20.
    3. 定义数据分析的兴趣窗口。兴趣窗口是指力（用于蠕变柔量）或压痕深度（用于力松弛）保持在设定值的区域（即，如图所示的第3区 图1C,D).
    4. 对于蠕变柔量实验，计算实验蠕变柔量模量 Jc(t)，响应阶跃载荷 数学分析方程中的赫维赛德阶跃函数公式，F(t) = F₀H(t)。:
      流体动力学公式 Jc(t)=16√R/3Fo δ^(3/2)(t)；用于动态分析的方程。,
      其中 H(t) 是Heaviside阶跃函数，且 R 为球形探针的半径。
    5. 对于力松弛实验，计算实验力松弛模量， GR(t)，响应于阶跃压痕深度 δ函数平衡方程，δ(t) = δ₀(t)；公式概念:
      静力平衡公式 G_R(t)=(3/16√Rδ₀^(5/2))F(t)；受力分析示意图。.

4. 冲击压痕

  1. 校准仪器化纳米压痕仪，并根据制造商的说明调整默认设置，以在水合脑组织上进行动态冲击实验。
    1. 使用镊子将球形探头滑动安装到摆锤上。
    2. 将熔融石英样品粘附在已旋入平移台的样品柱上。
    3. 进入校准菜单并选择“液体池”。按照软件提示操作，使探针与熔融石英样品接触。
    4. 选择“普通”作为压头类型，并使用默认的0.05 mN压头载荷。单击“继续”以执行普通压头配置的校准。
    5. 将样品台向后移动至少 5 mm。安装杠杆臂，以便将探针降入液体池中，并通过选择“Liquid Cell”作为压头类型，在新配置下重复液体池校准。点击“Continue”以获得液体池校准因子。
    6. 通过进入实验菜单并选择“特殊选项”来激活液体池软件功能。使用最新的校准值。
    7. 增大电容器极板间距，因为这将增大最大可测深度，而在测试高顺应性材料时这是必要的。
      1. 在“系统”菜单下，选择“非保护设置”和“机器参数”，将摆锤测试的负载速率、零负载速率和待机斜坡偏移分别更改为 0.5 mN/sec、0.1 mN/sec 和 3 V。
      2. 使用扳手，将控制电容器极板间距的三个螺母顺时针方向逐次小幅旋转。
      3. 每次顺时针旋转一周后，在维护菜单中选择“Bridge Box Adjustment”并进行一次良好的摆锤测试，这需要将配重块从摆锤侧移开。
      4. 重复步骤 4.1.7.2–4.1.7.3，直至近似深度校准读数达到 70,000 nm/V 或更高值。
    8. 在摆锤底部安装一个新的限位挡块，该挡块可通过电源开关控制启停。将位于摆锤后方的原始限位挡块缩回，以消除对摆锤运动的潜在阻碍，从而实现更高的冲击速度以及在柔性样品中更大的穿透深度。
    9. 让柜内达到热平衡（约需1小时）。
    10. 当机柜平衡时，返回系统菜单，选择“非保护设置”和“机器参数”，将深度校准（dcal）接触速度设置为 1 µm/sec，初始压痕接触速度至 3 µm/sec，以及超低载荷接触速度 1 µm/sec.
    11. 在“校准”菜单下，对此新配置执行标准深度校准。
    12. 打开电磁铁的电源，并将其设置为 10 V。进入实验菜单，选择“冲击”和“调节冲量位移”。根据软件提示（自动提示）校准摆锤的摆动距离。
  2. 将小鼠脑组织置于液体池中。
    1. 从步骤1.5中取出全脑后，立即将其保存在CO2用于成年神经组织的无血清培养基置于冰上。
    2. 当冲击压痕装置完全准备好后，小心地将脑组织连同CO一同转移至培养皿中2不含血清的培养基。将脑组织切成厚度为6 mm、两侧表面平整的切片。
    3. 用一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水将切好的组织粘附在铝制样品柱上。
    4. 将液体池滑过样品台上的第二个O形圈，并向液体池中加入5 ml CO2-独立培养基以完全浸没组织。随后将该样品台小心地安装到仪器化纳米压痕仪内的平移台中。
  3. 测量脑组织的冲击响应。
    1. 如有必要，可不卸下杠杆臂，直接取下球形探针并更换为所需探针。
    2. 在“系统”菜单下，选择“非保护设置”和“机器参数”。将主撞击接触速度更改为 5 µm/sec.
    3. 当样品槽处于低位（-z 方向）且远离摆臂（+x 方向）时，沿 -x 方向移动，直至杠杆臂上的探针准确定位于样品槽上方。然后沿 +z 方向移动，直至探针完全浸入液体槽中并位于样品前方。
    4. 使用样品台控制窗口，小心接触后，将样品台从样品表面回撤约 30 µm.
    5. 在“实验”菜单下，单击“冲击”以设置冲击实验。选择一个特定的脉冲载荷，该载荷将根据摆动距离校准结果直接关联到相应的冲击速度。运行已设定的实验。
    6. 当摆锤回摆且样品表面继续向测量平面移动时，关闭下限位停止开关。
    7. 观察摆锤向前摆动并撞击样品的过程。软件将记录探针位移随时间变化的情况。
    8. 当xyz载物台窗口出现时，将限位停止开关重新打开。
    9. 重复步骤 3.4–3.8，以测试所需数量的不同载荷和位置。
  4. 使用定制的 MATLAB 脚本分析获取的摆锤位移-时间响应，以确定最大侵入深度 x最大，能量耗散能力 K，以及耗散品质因数 Q.11
    1. 转到分析菜单，将数据导出为文本文件。
    2. 对位移曲线求时间导数，得到速度随时间变化的函数。将零位移设为接触点 xo1.
      注意：撞击速度 v在 是接触前瞬间的最大速度。 x最大 对应于探针速度首次降低至零时的形变量。 xo2，这相当于 xr，是下一个循环中重新与变形样品接触所需的位置。回弹速度 v出 是位移处的速度 xr.
    3. 定义 K （无量纲）表示样品在第一次冲击循环中耗散的能量与恢复能量和耗散能量之和的比值。计算 K 基于摆的固有特性 21 （如旋转刚度和阻尼系数）， xo1, x最大值, xr, v在，以及 v出.
      注意：欲了解更多信息，可参考 Kalcioglu 的研究工作 等 2011.
    4. 由于位移可被描述为阻尼谐振振荡运动，将指数衰减函数拟合到位移-时间曲线的极大值上。
    5. 计算 Q （无量纲）即 π 乘以振幅衰减至初始值的 1/e 所需的振荡周期数 e. 较高的 Q 数值越小，表示能量耗散率越低。

5. 流变学

  1. 按照制造商的说明设置并校准流变仪。
    1. 打开流变仪设备/控制面板以启动仪器。在控制面板选项卡中，点击“initialize”。
    2. 安装直径为25 mm的测量板（PP25）和热系统。
    3. （可选）为减少流变仪平板与组织之间的滑动，可裁剪与顶部流变仪平板形状匹配的粘性砂纸片，并将砂纸粘附在顶部和底部平板上。
    4. 通过点击控制面板上的“set zero gap”使上板和下板接触。
    5. 通过点击“重置法向力”来校准法向力传感器。
    6. 在控制面板上打开服务选项卡，点击“测量系统”，然后点击“惯性测试”以进行惯性测试。记录测试前后的惯性值。根据制造商提供的探头允许限值，确认惯性处于可接受范围内。
  2. 将样品装入流变仪中。
    1. 在收获组织并切取约5 mm厚的猪脑冠状切片后，将其置于冰上保存于CO2-非依赖性培养基
    2. 将脑组织置于两块板之间。清除样品上下表面的大水滴以防止滑动，但不要将样品弄干。
    3. 缓慢降低测量板，直至其与组织表面完全接触，并在5-10分钟的松弛期后，测得的法向力稳定在0.01 mN。
      1. 在控制面板中，依次在测量位置框内输入较低的高度值，然后点击“测量位置”以缓慢降低测量板。
      2. 当测量板距离组织约1毫米时，以0.1毫米的步长逐步降低测量板，直至其完全接触组织上表面。确保在5至10分钟的松弛期后，测得的法向力稳定在0.01 mN。
      3. 记录初始测得的法向力。应在相同的压缩应力/应变条件下重复测量。
    4. 如果样本直径超过培养板的直径，使用塑料刀片修剪样本。在样本边缘滴加少量培养基（约1-2 ml）以润湿组织。
    5. （可选）降下加热罩。在控制面板上将温度设置为 37 °C 并点击“set”。
  3. 进行振幅扫描以确定材料的线性黏弹性范围（即， 发生剪切应变的条件 G' 和 G'' 在感兴趣的频率下保持恒定）例如， 1 rad/s
    1. 选择“文件/新建”。在凝胶选项卡下选择“振幅扫描：线性黏弹区”。选择窗口并点击“测量1：振幅扫描”。双击振荡框。输入初始和最终应变（例如， 0.01 到 105），频率（例如， 1 rad/s）以及每十倍频程的点数（例如， 6 点/十倍频程）。选择“ok”并点击开始。
    2. 对多个切片重复此操作，并进行多次试验，以确保线性弹性范围的一致性。样品的轴向压缩在不同样品间应保持恒定。
  4. 在组织的线性黏弹性应变范围内对组织进行频率扫描（例如， 1% 应变 22，以及在感兴趣的频率范围内例如，0.1-100 rad/sec。
    1. 单击“文件/新建”，在凝胶选项卡下选择“频率扫描”。单击窗口/测量1：频率扫描。双击振荡设置框。输入频率范围（例如，0.1 至 100 rad/s），应变（例如，1% 应变）以及每十倍频程的点数（例如，6 个点/十倍频程）。选择“ok”，然后单击“start”以启动频率扫描。
  5. 重复频率扫描（步骤 5.4）两到三次。
  6. 查看流变仪自动计算并导出的数据： G' 和 G 作为频率（频率扫描）或剪切应变（振幅扫描）的函数。注意： G' 和 G'' 根据样品的（最大）反应扭矩幅值进行计算 T'0，以及旋转位移角（或偏转角） φ₀ 符号表示波动方程中的初始相位角，用于物理和工程图示中。，以及相位滞后 Φ符号，静态平衡；在物理方程中至关重要；用于教学参考的示意图。样品对施加的振荡应变的响应图 3):
    粘弹性公式，G'=2T0h/(πφ0R⁴)cosΦ，与材料变形分析相关。
    表征流变学性质 G'' 的方程，参数为 T₀、h、φ₀、R；与粘弹性分析相关。
    其中 R 和 h 为样品的半径和高度。

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结果

图4展示了蠕变柔量和应力松弛实验中典型的压痕深度及力-时间响应曲线（图4B,E），分别对应于施加的力或压痕深度（图4A,D）。利用这些数据以及系统的几何参数，可计算出脑组织不同区域的蠕变柔量Jc(t)和应力松弛模量GR(t)（图4C,F）。尽管先前的研究表明脑部不同区域的弹性模量存在差异23，但通过该方法测得的小鼠脑组织切片的黏弹性特性在同一切片内并未显示出区域间的差异。

压痕冲击法用于测量组织在空间和时间上高度集中的高加载速率下的力学特性。这些实验结果可提供有关组织在创伤性损伤或与手术相关的有意变形情况下如何耗散能量的信息。压痕冲击探针的阻尼振荡运动（图2B）可提供数据，用于计算组织...

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讨论

本文介绍的每种技术均用于测量脑组织力学特性的不同方面。蠕变柔量和应力松弛模量用于表征时间依赖性力学特性。储能模量和损耗模量则反映速率依赖性力学特性。冲击压痕同样测量速率依赖性力学特性，但侧重于能量耗散的背景。在表征组织力学特性时，原子力显微镜辅助压痕（AFM-enabled indentation）和流变学是两种常用方法。其中，原子力显微镜辅助压痕尤为有用，因为它不仅能提供材料的时间依赖性特性，还可通过调节不同的实验参数来测量细胞和组织的弹性模量4，甚至频率依赖性特性24，如前所述。然而，对于柔软且含水的组织，数据的准确解读和实验设计仍具挑战性。流变学测量的是组织的整体特性，而原子力显微镜辅助压痕则探测与细胞微环境相关的微尺度体积。冲击压痕则提供了一种量化材料在集中动态冲击载荷下变形行为的方法，在研究局灶性冲击引起的创伤性脑损伤等应用中具有重要意义。尽管各技术所得结果不能直接比较，但通过冲击压痕测得的能量耗散特性与通过流变学测得的剪切损耗模量所呈现的趋势一致，如下文所述。

在本文所示的原子力显微镜（AFM）辅助脑组织压痕实验中，我们采用蠕...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢国家多发性硬化症协会和西蒙斯社会脑中心对本工作的支持。BQ 感谢美国国家国防科学与工程研究生奖学金项目的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
赛拉嗪Lloyd Laboratoried处方药
氯胺酮AnaSed Injections处方药
振动切片机（振动刀片式切片机）LeicaVT1200
Hibernate-A 培养基GibcoA1247501适用于成体组织的 CO2非依赖性神经培养基
原子力显微镜，MFP-3D-BIOAsylum Research-
培养皿加热器Asylum Research-
AFM 探针，0.03 N/m，10 µm 半径硼硅酸盐玻璃微球NovascanPT.GS
Cell-TakCorning354240来源于贻贝的生物粘合剂
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761可使用其他供应商
氢氧化钠，1 NSigma-Aldrich59223C可使用其他供应商
仪器化压痕仪，NanoTest VantageMicro Materials Ltd.-探针尖端需加工（钢制平冲头，直径 1 mm，长度 4-5 mm）
NanoTest 液体池Micro Materials Ltd.-
平行板流变仪 MCR501Anton-Parr-
PP25 Anton-Parr-直径 25 mm 的平板测量头
粘性砂纸McMaster-Carr4184A48可使用其他供应商
乐泰 4013 瞬干胶Henkel20268可使用其他供应商

参考文献

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利用原子力显微镜、冲击压痕和流变仪表征脑组织的多尺度力学特性
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