表征使用原子力显微镜，冲击压痕和流变测定脑组织的多尺度力学性能

Summary

我们提出了一套技术来表征大脑在微观、中观和宏观尺度上的粘弹性力学特性。

Abstract

设计和工程师由大脑的属性激发的材料，无论是机械模拟物或组织再生的研究中，脑组织本身必须很好地表征在不同的长度和时间尺度。像许多生物组织，脑组织呈现出一个复杂的，分层结构。然而，与大多数其它组织，脑是非常低的机械刚度，以Pa的100s的顺序上杨氏弹性模量即这种低刚度可以呈现挑战关键的机械性能的实验表征。在这里，我们表明，已适应测量水分，符合生物材料的脑组织等，在不同的尺度和负荷率弹性和粘弹性能几种机械表征技术。在微尺度，我们进行使用原子力显微镜启用压痕蠕变遵守和力量松弛实验。在mesos凯尔，我们执行使用的是基于钟摆仪器化压压痕冲击实验。在宏观尺度，我们进行平行板流变量化该频率依赖剪切弹性模量。我们还讨论了与每个方法相关的挑战和限制。这些技术共同使脑组织，可用于更好地理解脑的结构和工程师仿生材料进行了深入的机械特性。

Introduction

包含生物器官最软组织是在机械上和结构复杂，低刚度相比矿化骨或工程材料，并显示出非线性的和取决于时间的变形。相比，在身体的其他组织，脑组织是非常柔顺的，以帕¹的100秒的数量级上的弹性模量例如脑组织呈现出具有鲜明和相互交叉的灰质和白质区域也有所不同功能结构的异质性。理解脑组织力学会在材料和计算模型的设计有助于向模拟大脑损伤时的反应，促进机械损伤的预测，并启用的保护策略工程。此外，这样的信息可以用来考虑的组织再生的设计目标，以更好地理解脑组织是与疾病，如多发性硬化症和孤独症有关的结构变化。 HERE，我们描述和证明了可用来表征机械柔性组织中，包括脑组织的粘弹性能几个实验方法，在微观，中观和宏观尺度。

在微尺度，我们进行了蠕变遵守和用原子力显微镜（AFM） - 启用压痕力松弛实验。通常情况下，使能AFM压痕用于估计样品^2-4的弹性模量（或瞬时刚度）。然而，同样的仪器也可用于测量微尺度粘弹性（时间或速率依赖性）性质^:5-10。这些实验中，在图1所示的原理，是缩进悬臂探针进入脑组织的AFM，保持力或压痕深度指定大小，并测量在分别压痕深度和力，相应的变化，随着时间的推移。通过这些数据，我们可以计算出蠕变补偿分别_lianceĴC和松弛模量G _R，。

Protocol

伦理学声明:所有的实验方案是由波士顿儿童医院的动物研究委员会批准并符合健康指南实验动物的护理和使用全国学院。

1.鼠标脑组织采集程序（启用了AFM压痕和影响压痕）

1. 准备氯胺酮/甲苯​​噻嗪混合物麻醉小鼠。结合5毫升氯胺酮（500毫克/毫升），加入1ml甲苯噻嗪（20毫克/毫升）和7毫升0.9％盐溶液中。
2. 每氯胺酮/甲苯​​噻嗪溶液克体重7微升注入小鼠（男或女品种:TSC1; Syn的Cre重组酶; PLP-EGFP;:;年龄性别P21）。
3. 一旦鼠标完全麻醉，这表现在缺乏应对脚趾和尾掐的，安乐死通过使用大型清扫剪刀斩首鼠标。
4. 删除通过使用更小的解剖剪刀剪下来中间的头骨。在小脑开始，REM奥雅纳件用弯钳的头骨。除去头骨后，通过使用一个平铲解除脑，开始于小脑提取大脑，并放置在脑上的培养皿。从使用刀片大脑除去小脑。
5. 如果使用对新鲜组织，转移脑冲击压痕测试整个大脑进入圆底管在冰上成人神经组织CO ₂独立营养培养基，然后继续部分4。否则进行到步骤1.6切片的程序。
6. 调整vibratome设置以0.7毫米/秒，70赫兹的振动频率，以及350微米的切片厚度的速度。环绕冰的vibratome菜。将强力胶民建联到vibratome板安装的大脑，使冠状切片可以切割，用脑面向通过背侧削减第一。
7. 填充有足够的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）....

Results

图4示出代表压痕和力与时间的反应（ 图4B，C）用于蠕变柔和力松弛实验中，给定分别施加的力或压痕深度（ 图4A中的D）。利用这些数据和系统的几何形状，蠕变柔量J _C（t）和强制松弛模量_ģR（T）可被计算为大脑（ 图4C中的F）的不同的区域。虽然以前的研究表明大脑²³的不同区域的弹性模量之间的差，粘弹性特性以这种方式对小鼠脑组织切片不显示给定的组织切片中的区域间的变化进行测定。

冲击压痕在空间和时间上concentra高速率测量组织的机械性质特德加载。这些实验的结果提供了关于组织响应于外伤性损伤或与手术相关故意的变形如何消耗能量的信息。冲击压痕探针的阻尼振荡运动（ 图2B）提供的信息来.......

Discussion

本文提出的每个技术测量脑组织的机械性能的不同方面。蠕变柔和应力松弛模量随时间变化的机械性能的量度。储存和损耗模数代表率相关的机械性能。冲击压痕还测量速率依赖性机械特性，但在能量耗散的情况下。当表征组织的机械性能，同时启用AFM压痕和流变的常用方法。因为除了提供时间相关的材料性质，不同的实验参数可以用来测量细胞和组织的弹性模量^4，甚至频率相关特性^24，如先前所述使能的AFM压痕是特别有用的。然而，实验的数据和设计的准确解释是具有挑战性的标准，水合组织。虽然流变措施散装适合组织的联系，使AFM压痕探测相关细胞的微环境微尺度卷。冲击压痕提供的材料以浓缩，动态冲击负荷，这是在像学习造成的焦点冲击创伤性​​脑损伤应用中是有用的上下文中如何变形以具体量化的装置。而从各技术的结果是不能直接比较，通过冲击压痕测量的能量耗散特性遵循相同的趋势，通过流变学测量的剪切损耗弹性模量，如下文所讨论。

在这里说明脑组织的启用AFM压痕，我们通过测量蠕变柔并迫使松弛粘弹性。由于AFM探针的小规模的，这种技术可以测量的脑的解剖学不同的区域，如胼胝体和皮质，分别为（

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
甲苯噻嗪	Lloyd 实验室		处方药
氯胺酮	AnaSed 注射液		处方药
振动切片机（振动片切片机）	Leica	VT1200
Hibernate-A 培养基	Gibco	A1247501	用于成人组织的 CO2 依赖神经培养基
力显微镜，MFP-3D-BIO	庇护研究	-
培养皿加热器	庇护研究	-
AFM 探针，0.03 N/m，10 &微;m 半径硼硅酸盐球	Novascan	PT.
Cell-Tak	Corning	354240	贻贝衍生生物粘合剂
氢钠	Sigma-Aldrich	S5761	替代供应商
氧化钠，1 N	Sigma-Aldrich	59223C	替代供应商 仪器
化压头，NanoTest Vantage	Micro Materials Ltd.	-	探头尖端需要加工（钢平冲头，1 毫米直径，4-5 mm 长度）
NanoTest Liquid Cell	Micro Materials Ltd.	-
平行板流变仪 MCR501	Anton-Parr-PP25
	Anton-Parr-25		mm 直径平面测量板
胶粘剂砂纸	McMaster-Carr	4184A48	备用供应商 可以使用
泰 4013 瞬干胶	汉高	20268	备用供应商