该流动黏附实验为T细胞与上皮细胞相互作用提供了一个简单且高影响力的模型。通过注射泵产生剪切应力，并利用共聚焦显微镜采集图像以进行定量分析。这些研究的目标是在流动条件下有效量化T细胞的黏附情况。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
总体而言，T细胞黏附是其功能的关键组成部分，参与介导细胞向炎症部位的募集以及与抗原呈递细胞（APC）相互作用形成免疫突触这两个不同的生物学过程。这两种T细胞黏附情境的不同之处在于：T细胞与APC之间的相互作用可被视为静态的，而T细胞与血管壁之间的相互作用则受到血液循环所产生的剪切应力的挑战。所谓静态，是指两种细胞彼此之间相对静止，这种相互作用通常发生在淋巴结内。当T细胞与血管壁相互作用时，细胞会发生停滞，并必须抵抗由此产生的剪切应力1,2。这些差异凸显了有必要将静态黏附和流动条件下的黏附视为两种独立的调控过程加以深入研究。T细胞黏附的调控机制最简洁的描述是：通过控制细胞表面表达的整合素分子的亲和力状态，进而调节整合素与其相互作用细胞表面黏附分子配体的结合。目前对整合素亲和力状态调控机制的认识，大多来源于较为简化的体外（in vitro）模型系统。本文所述的在流动条件下进行黏附检测的方法，能够在刺激后实时观察并精确量化T细胞与上皮细胞之间的相互作用。流动条件下的黏附实验可用于研究T细胞经抑制性或刺激性物质处理后其内部的黏附信号通路。此外，该实验方法的应用范围还可扩展至除T细胞信号外的任何黏附性白细胞群体，以及任何整合素-黏附分子配对的研究。
引言
在健康的免疫系统中，T淋巴细胞黏附介导多种不同的生理过程3，在T细胞迁移和抗原呈递中发挥关键作用。无论是在免疫监视过程中还是在主动免疫应答期间，黏附的这两种广泛功能均至关重要4。T细胞与内皮细胞相互作用的生理信号事件不同于T细胞与抗原呈递细胞（APC）之间的相互作用，因此需要采用不同的研究方法，以充分理解其中涉及的信号级联过程。在淋巴细胞渗出过程中，T细胞牢固黏附于血管壁需要快速而动态的整合素活化。处于活化状态的整合素与内皮表面的黏附分子之间形成紧密相互作用，从而产生抵抗血流剪切力的黏附力，使T细胞能够在血管壁表面爬行，寻找允许其穿过的区域5。T细胞沿血管壁双向爬行依赖于极性黏附，即T细胞具有明确的黏附前端6。最重要的是，牢固黏附和跨内皮迁移必须能够抵抗循环血流所产生的剪切力。
在设计研究淋巴细胞黏附的实验时，应关注特定的刺激因素。尽管整合素活化是所有T细胞黏附形式中常见且关键的组成部分，但不同受体及其共受体下游的活化级联反应可能各不相同。同样，整合素与黏附分子配对在特定的微环境及特定亚群细胞中发挥作用，因此这些配对可能受到截然不同的调控。本文所介绍的模型非常适合研究在剪切应力条件下导致整合素活化的信号转导级联过程7。由于这些力学作用已被证实可直接影响T细胞行为，静态黏附系统无法充分揭示此类相互作用机制8。尽管本模型以T细胞和经基因工程改造表达人ICAM-1的CHO（中国仓鼠卵巢）细胞（CHO-ICAM细胞）为例进行展示，但该系统可轻松改造用于研究不同的白细胞群体或黏附分子。
该实验提供了一种利用剪切应力定量检测T细胞黏附性和整合素活化的方法，可模拟白细胞外渗过程中的牢固黏附阶段。通过使用CHO-ICAM细胞，可实时检测LFA-1在不同刺激条件下对配体的亲和力变化。该技术仅需常规可购得的微型流动小室和注射泵，相较于其他模型，显著简化了模拟血流和剪切应力所需的设备。9 该实验的另一主要优势在于，可通过基因工程改造的表达特定人源黏附分子的CHO细胞，清晰地研究特定信号通路及单个整合素的活化状态。此外，该方法能够将定量数据与活细胞成像相结合，具有显著优势。总体而言，尽管已有多种静态T细胞黏附实验被用于良好地模拟T细胞与抗原呈递细胞（APC）的相互作用，但这些模型无法充分反映T细胞与上皮细胞黏附的动态过程。因此，在选择黏附实验方法时，必须考虑所研究的刺激因素。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 铺板CHO-ICAM细胞
注意：此步骤的目的是将 CHO-ICAM 细胞接种到流动小室中，过夜培养，以形成融合的单层细胞。
- 在37 °C、5% CO2条件下，将CHO-ICAM细胞培养于10 cm经组织培养处理的培养皿中，每皿加入10 ml含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的RPMI培养基（CHO-ICAM完全培养基）。
- 收集细胞时，加入1 ml 0.5%胰蛋白酶-EDTA溶液，室温下轻轻振荡孵育1分钟，随后加入4 ml培养基中和胰蛋白酶活性。
- 使用血细胞计数板对CHO-ICAM细胞进行计数，并计算每腔室接种0.75 × 105个细胞。注意：本实验中，接种3个腔室共需2.25 × 105个细胞。
- 将每腔室所需的0.75 × 105个CHO-ICAM细胞在室温下以500 × g离心5分钟，弃上清后将细胞沉淀重悬于每腔室30 µl的CHO-ICAM完全培养基中。
注意：本实验中，接种3个腔室共需90 µl培养基。 - 将细胞缓慢加入流式腔室的一个储液端口，随后将腔室置于37 °C、5% CO2培养箱中静置5分钟，使细胞沉降。
- 向每个腔室的两个储液端口交替加入共200 µl完全培养基，交替添加以避免系统平衡过程中细胞移动。
- 将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜孵育。
2. T细胞的制备
注意：本实验可使用原代人T细胞或T细胞系进行。关于从血液中分离T细胞的方案已有先前文献描述10。若使用原代人T细胞，建议采用新鲜分离的细胞以获得最佳结果。若使用T细胞系，则应遵循细胞来源提供的培养方案。为了在荧光显微镜下检测细胞，需用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）对T细胞进行标记。
- 使用血细胞计数板对T细胞进行计数，并计算每个腔室所需的2 × 106个细胞。注意：本实验中，3个腔室共需要6 × 106个细胞。
- 将每个腔室对应的2 × 106个T细胞在室温下以500 × g离心5分钟，弃上清后用含1%葡萄糖或2%胎牛血清（FBS）的1 ml磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞。
- 按1:1,000比例加入CFSE（储存液浓度为5 mM），避光并在室温下孵育8分钟。
- 在室温下以500 × g离心5分钟。
- 用每种条件240 µl无血清RPMI培养基重悬细胞沉淀（参见第4节"注意"）。本实验中，将细胞沉淀重悬于720 µl普通RPMI培养基中。将细胞分装至预先标记对应腔室的空1.5 ml离心管中，每管240 µl。将细胞置于37 °C加热块中保存，待用。
3. 设置 输入/输出 灌流与注射泵
- 将显微镜活细胞成像培养室预热至 37 °C。
- 制备 输入 冲洗：
- 用一个500 ml的玻璃瓶装满水，并在瓶盖上打两个孔。标记这两个孔 "在" 和 "出。" 这将作为加热的水浴装置 输入 培养基
- 运行 输入 通过盖子上的孔将软管接入水浴。确保连接注射器一端的软管从 "在" 孔和将要连接的一侧 输入 储液器穿过 "出" 孔
- 冲洗 输入 用60 ml水冲洗以去除系统中的任何空气。
- 引物 输入 用预热至 37 °C 的无血清 RPMI 培养基冲洗。取 60 ml 注射器装满培养基，推动液体通过管路，直至管路完全充满且无任何气泡。
注意：根据所用导管的长度，预充所需体积会有所不同。- 根据实验所需的流速（此处为 0.3 ml/min）乘以分钟数（5 min）再乘以实验中的腔室数量（此处为 3），计算实验所需培养基体积；本实验使用 4.5 ml 培养基。注意：建议在灌注完成后，注射器中仍保留额外 5 ml 体积（此处总计为 9.5 ml）。
- 将整个 输入 将装置放入显微镜的活细胞成像腔室中以维持37 °C。将管路和注射器引出腔室，并将注射器装入注射泵中。
- 准备 输出 冲洗：
- 在250 ml瓶的瓶盖上打一个孔，用作 输出 废弃物
- 运行 输出 将管子穿过孔洞并插入瓶中。轻轻固定瓶盖，不要完全拧紧。
- 放置 输出 将装置放入显微镜的活体成像腔内。
- 计算产生所需剪切应力（dyn/cm²）所需的流速（ml/min）2）。不同血管区域的剪切应力存在差异，因此在确定剪切应力水平时，应综合考虑所研究的细胞类型、处理方式及整体模型。
注意：这些实验在 0.4 dyn/cm 条件下进行2 以紧密模拟小静脉环境。- 计算剪切应力时需考虑腔室尺寸。使用以下公式（由制造商提供）11）适用于此处使用的流式室（参见材料表）： T = η * 176.1 * ø 其中 T = 剪切应力，η = 动力黏度，ø = 流速。注意：RPMI 培养基在 37 °C 时的动力黏度为 0.007。
4. 加载流室并刺激细胞
注意：为了启动黏附，T细胞必须被激活。在以下实验中，细胞将保持未激活状态，或用SDF-1α12或佛波酯肉豆蔻酸乙酸酯（PMA；阳性对照）13进行激活。为了向T细胞有效呈递趋化因子，CHO-ICAM细胞预先与SDF-1α孵育（随后进行多次洗涤），以使其在细胞表面呈递。PMA是一种佛波酯，其结构与第二信使二酰甘油（DAG）相似；在此实验中用作阳性对照。T细胞在装入流式腔室前直接用PMA处理。
- 将流动腔载玻片置于显微镜上，并使用20倍物镜将焦平面调整至CHO-ICAM单层细胞。
- 将所有其他条件下的CFSE标记T细胞保持在37 °C加热块中。在进行各条件检测前立即按以下步骤准备CHO-ICAM或T细胞：
- 对于未刺激条件（腔室1），保留一个试管/流动腔不作处理，作为刺激的阴性对照。
- 对于PMA刺激（腔室2），用PMA（10 ng/ml）刺激一组T细胞作为阳性对照；在装入流动腔前立即处理。
- 对于SDF-1α刺激（腔室3），通过每次从上部储液池（输出储液池）移除70 µl，重复3次，然后向底部储液池（输入储液池）加入70 µl SDF-1α（100 ng/ml），对第三个流动腔进行刺激。孵育5分钟。
- 从一个腔室的输出储液池中每次移除并弃去70 µl，重复3次。
- 将70 µl预处理（如适用）的T细胞悬液加入输入储液池，重复3次。等待5分钟，使细胞从腔室入口（"In"）移动，并到达腔室近端出口（"Out"）。
- 在此期间，对CFSE标记的T细胞拍摄5个视野图像。选择分布在腔室中心区域的视野（图1）。使用以下激发/发射条件：激发激光波长：488 nm；发射收集滤光片：500 - 540 nm。这些图像将作为流动前的细胞计数。
- 同时将输入和输出管路连接至流动腔的储液池。
注意：必须同时连接管路，以避免向腔室内引入气泡，并维持腔室整体的平衡。 - 在观察CFSE标记T细胞的同时，以0.3 ml/min（0.4 dyn/cm2）开始流动。流动开始时，尤其是第一个腔室，T细胞滚动的观察通常会滞后于流动启动，因此应在T细胞开始移动时起计时5分钟。
- 5分钟后终止流动，在CFSE通道下拍摄5个视野图像。随机选择分布在流动腔中心区域的视野（图1）。这些图像将作为流动后的细胞计数。
5. 测定贴壁细胞百分比
注意：对所获取图像中细胞数量的确定是通过自动化软件进行客观分析的。在我们的研究中使用了 Volocity 软件（版本 6.2.1），但其他软件如 ImageJ（版本 1.48V）也同样适用。
- 确定每种条件下流体处理前每个视野的细胞数量。5个视野的平均值即为"流体处理前平均细胞数"。7
- 确定每种条件下流体处理后每个视野的细胞数量。5个视野的平均值即为"流体处理后平均细胞数"。7
- 使用以下公式计算黏附细胞的百分比：黏附细胞百分比 =（流体处理后平均细胞数）/（流体处理前平均细胞数）× 100%。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
图中显示了使用Jurkat细胞和原代人CD3+ T细胞进行流式黏附实验的代表性结果，细胞按所示条件用SDF-1α刺激。所有实验中的阴性对照均为未刺激细胞。未刺激细胞的基础黏附率通常在5%–10%之间；若基础黏附率明显高于此范围，则提示实验存在问题，可能是在准备过程中T细胞群体发生了非特异性预激活。除计算黏附百分率外，还可计算每种条件下流体作用后黏附细胞数量相对于未刺激细胞的倍数增加。此处提供了采用这两种计算方法的数据。
图2A展示了每种实验条件下流动室中视野的代表性图像，分别显示流动前和流动后的状态。实验前，将Jurkat细胞（如图2A所示）或原代人CD3+ T细胞进行纯化、计数，并用CFSE标记。每种实验条件下均标记2 × 106个细胞。未刺激的T细胞被加入含有CHO-ICAM细胞的流动室中，体系中存在或不存在SDF-...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
为了准确分析T细胞黏附，在选择刺激物时必须考虑将其纳入研究中 体外 方法。尽管存在多种用于研究导致LFA-1活化及ICAM-1结合信号的检测方法，但这些方法并不完全可互换。一种静态黏附检测法10 最适合研究T细胞与抗原呈递细胞的相互作用；或者，本文详述的剪切应力方法则非常适合模拟T细胞与上皮细胞的相互作用。 体内，因为趋化因子在内皮上呈现，滚动的T细胞必须通过牢固黏附并抵抗血流的剪切应力来作出响应14,15因此，趋化因子信号传导的研究最适合在包含剪切应力的实验体系中进行。这种在流动条件下进行的黏附实验主要优势在于能够简单有效地模拟T细胞与整合素之间的相互作用。该实验方法的独特之处在于将功能研究与机制研究相结合，通过构建特定环境来研究单一整合素-黏附分子配对的相互作用。该方法的另一优势在于其可适应性强，可用于定量任何白细胞与任何黏附分子之间的黏附作用。此外，该方法还可用于筛选多种药物或基因操作对T细胞募集和外渗过程的影响，特别是通过改变整合素活化状态所产生的效应。
与任何体外（in vitro
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到了风湿病研究基金会和希尔希尔信托基金的支持。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| T 细胞样本（细胞系或原代细胞） | ATCC | TIB-152 | 外周人 T 细胞 |
| CHO-ICAM-1 细胞 | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml 玻璃瓶 | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml 玻璃瓶 | Fisher | FB800250 | |
| 硅胶管，0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| 带培养箱腔室的共聚焦显微镜 | Ziess | 700 | 任何宽场荧光显微镜 |
| 注射泵 | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml 注射器 | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5424 | |
| D-葡萄糖 | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity 软件 | Perkin Elmer | 版本 6.2.1 | |
| ImageJ 软件 | NIH | 版本 1.48V | |
| 经组织培养处理的培养皿 | Falcon | 353003 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红 | Gibco | 25200114 | |
| 热灭活胎牛血清 | Denville | FB5001-H | |
| 青霉素/链霉素 | Fisher | BP295950 |
参考文献
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. Application Note 11. , Available from: http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
