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人胎盘组织来源的间充质干细胞/基质细胞的分离与扩增

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DOI：

10.3791/54204

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2016年6月6日

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1UQ Centre for Clinical Research, The University of Queensland, 2Translational Research Institute, Queensland University of Technology, 3Translational Research Institute, Mater Medical Research - University of Queensland

本文内容

摘要

本文描述了从人类足月胎盘中分离胎儿和母体组织的方法，随后从这些组织中分离并扩增间充质干细胞/基质细胞（MSC）。

摘要

间充质干细胞/基质细胞（MSC）是细胞治疗中极具前景的候选细胞。在大多数情况下，治疗反应似乎与细胞剂量相关。人足月胎盘富含MSC，且是一种体积较大的组织，通常在出生后被丢弃。胎盘是大规模生产多种同种异体MSC细胞剂量的理想起始材料。胎盘是一种母胎器官，可从中分离出胎儿或母体组织。本文描述了胎盘的解剖结构以及分离蜕膜（母体）、绒毛膜绒毛（胎儿）和绒毛膜板（胎儿）组织的操作步骤。该方案随后概述了如何从各个分离的组织区域中获取MSC，并提供了来自不同类型组织的扩增MSC的代表性分析结果。这些方法旨在用于临床前MSC的分离，但也已被改进并应用于临床级胎盘MSC的制备，以供人类治疗使用。

引言

间充质干细胞/基质细胞（MSC）正成为细胞治疗领域极具前景的候选细胞1。大多数应用旨在利用MSC介导的组织修复或免疫调节作用2。在许多此类应用中，同种异体MSC的效果可能与自体MSC相当3。使用同种异体MSC具有经济优势，因其可从单一来源组织大规模生产多个剂量的细胞，从而用于治疗大量患者4。

历史上，临床前和临床研究均采用骨髓来源的间充质干细胞 4骨髓通常从志愿者供体的髂嵴采集。该过程具有侵入性，且单次穿刺仅能采集少量骨髓（约20 ml）。要获得具有临床意义数量的间充质干细胞（MSC），需要进行 extensive 体外 扩增。细胞多能性随传代次数增加而降低 3，从而产生一个悖论：细胞群体扩增得越多，理论上达到临床疗效所需的细胞数量反而增加。与骨髓抽吸物相比，足月胎盘是一种物理体积较大的起始组织（通常为500–750 g） 4），可在剖宫产期间无菌采集，对供体无任何风险。来源于胎盘的间充质干细胞具有长期增殖能力 5 免疫调节能力 6，优于骨髓来源的间充质干细胞。在之前的一项研究中，我们证明单个胎盘所含的间充质干细胞足以用于制备多达7,000剂临床用量 4这些特性使胎盘成为制造同种异体间充质干细胞的理想来源组织。

胎盘是一种母胎器官，由胎儿组织和母体组织共同构成7，因此理论上可以分离出来源于胎儿或母体的间充质干细胞（MSC）。以下参考文献提供了关于人胎盘及其附属结构的发育与病理、以及显微和大体检查的详细信息8,9。胎盘本体主要由胎儿血管以及称为滋养层细胞的分泌和支持细胞组成，形成绒毛膜绒毛，其表面覆盖有丛密绒毛膜（板）8。分支状的胎盘绒毛浸泡在由子宫螺旋动脉输送来的母体血液中，从而实现胎儿与母体之间的营养物质、激素和气体交换。胎盘通过母体的蜕膜基质细胞锚定于子宫内膜，而胎儿来源的绒毛外滋养层细胞则散布于细胞外基质中8。绒毛汇聚至胎儿侧的绒毛膜板，在此处 形成脐带8。

首届胎盘来源干细胞国际研讨会（2008年）的一项成果是认识到有必要对人足月胎盘来源细胞的分离与鉴定进行标准化 10由于胎盘的解剖结构复杂，组织分离、间充质干细胞（MSC）的提取以及预期的培养结果对于该领域的新手而言可能具有较大挑战。本方案详细描述了胎盘绒毛组织的采集、MSC的分离与扩增过程，并通过流式细胞术对MSC进行表征分析。 体外 分化被视为常规操作 5,11-13，因此此处仅作简要描述。

正如最近一项系统性文献综述14所强调的，从胎盘绒毛膜绒毛中获得的间充质基质细胞（MSC）通常被认为是胎儿来源的。然而，仅有18%的研究检测了所获得MSC的来源，而在这些研究中，仅一半报告为胎儿MSC，另一半则报告为母体或混合来源的MSC群体。本文所述的三种组织成分（绒毛膜绒毛、绒毛膜板和底蜕膜）主要由胎儿膜/绒毛构成，同时含有少量附着于娩出后胎盘上的子宫来源母体细胞。我们提供的数据表明，如果目标是获取母体MSC，则应选择从胎盘的母体面而非胎儿面分离MSC，这与我们先前的报道一致5,11，且是更为合适的起始材料。本方案还描述了使用XY荧光原位杂交（FISH）技术来验证细胞培养物中细胞的胎儿或母体来源。尽管该方法为制造商提供的标准操作流程，但此类分析常被忽视，其重要性也常被低估14。

方案

马特健康服务部、皇家布里斯班妇女医院、昆士兰科技大学和昆士兰大学的人类研究伦理委员会批准了本研究以及研究中使用的人类胎盘样本的采集。所有实验方案均符合国家研究指南。患者已签署知情书面同意书，同意将组织用于科研目的。

妊娠晚期胎盘样本取自澳大利亚布里斯班上述医院因常规剖宫产（CS）足月分娩的健康产妇。本研究采用性别异源的足月妊娠样本，以区分胎儿细胞与母体细胞。胎儿性别已于出生前通过超声检查和/或出生时临床医护人员对新生儿的肉眼观察确定。X与Y染色体荧光 原位 采用荧光原位杂交（FISH）进一步验证保存自原始胎盘组织的性别以及组织的胎儿或母体来源。

1. 收获前准备以下事项

注意：配制酶溶液时，应遵循各生产商针对其产品提供的具体要求和浓度说明。酶通常以粗提的蛋白质混合物形式提供，因此不同公司的相似酶可能具有不同的活性或浓度。鉴于此，应参考生产商的建议，并相应调整溶液的配制方法。

  1. 为本方案准备或购买总计1.5至2升无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）。
  2. 称取 I 型胶原酶，以 HBSS 溶解配制成 1 mg/ml 的胶原酶 I 储存液，轻轻涡旋以确保完全溶解。根据所需体积，用含钙和镁的 HBSS 将胶原酶溶液稀释至 100 单位（U）/µl（1,000 倍储存液），然后使用 0.2 µm 注射器滤器过滤。将溶液分装为每管 1 ml 至 1.5 ml 离心管中，于 -20 °C 保存，待用。
  3. 通过将非无菌dispase溶解于不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，配制浓度为10 mg/ml的dispase储存液。再用不含钙和镁的DPBS稀释至终浓度为2.4 U/ml。使用0.2 µm注射器滤器过滤除菌。将溶液分装为每管1 ml，置于1.5 ml离心管中，于-20 °C保存，待用时取出。
  4. 将DNase-I溶解于0.15 M NaCl中，配制成10 mg/ml的脱氧核糖核酸酶（DNase-I）贮存液。用0.2 µm注射器滤器过滤。分装为每管1 ml，置于1.5 ml离心管中，于-20 °C保存，备用。
  5. 通过将 100 U/ml I 型胶原酶、1.5 µg/ml DNase I 和 2.4 U/ml dispase 混合于无血清 DMEM 中，配制工作用消化液。酶液原液应在使用前新鲜解冻并立即稀释。消化液体积与组织体积之比大约为 1:1（例如10 ml 组织（在 50 ml 离心管中量取）需要加入 10 ml 消化液。
  6. 在 PBS 中配制 4% 多聚甲醛（PFA）溶液，并调节 pH 至 7.4 15将25 mL分装后，长期储存于-20 °C，或于4 °C保存1周。
  7. 从低糖DMEM（DMEM-LG）中配制MSC培养基，添加1×抗生素-抗真菌溶液和10%未灭活的胎牛血清。MSC级别的胎牛血清可从多家FBS供应商处购买。
  8. 根据机构指南预先对解剖器械进行高压灭菌消毒，包括剪刀、镊子、手术刀和大型金属解剖托盘。收集额外的无菌组织培养塑料器皿和耗材（例如 手术刀片、50 ml 和 15 ml 离心管、25 ml、10 ml 和 5 ml 移液管，以及 75 或 175 cm² 培养瓶2 细胞培养瓶
  9. 使用标准的原代细胞培养实验室设备：适用于原代细胞分离的II级生物安全柜、设定为5% CO₂的细胞培养箱2 37 °C，37 °C 培养箱中的摇床，以及可容纳 50 ml 离心管的离心机。
  10. 使用适当的个人防护装备：实验服、两副手套（始终佩戴）、护目镜和防滑闭口鞋，具体要求遵循机构指南。
  11. 根据机构指南预先准备好用于人血标本的适当去污溶液及液体生物废弃物容器。

2. 胎盘间充质干细胞的分离

  1. 胎盘的制备
    1. 穿戴必要的个人防护装备。在生物安全柜中准备好所需材料、溶液和废液容器，以完成至酶消化步骤（第2.5.6节）的全部操作。
    2. 在获得知情同意和伦理批准后获取胎盘。通过剖宫产在无菌外科条件下采集胎盘，并将其装入无菌袋或桶中运送到实验室。
    3. 在运输过程中以及解剖前，将胎盘置于室温或4 °C保存。
      注：组织可在不影响细胞培养性能的情况下保存最长6小时。
      1. 应尽可能缩短胎盘采集与组织处理之间的时间。此建议基于实际操作经验。在某些情况下，我们在出生后延迟最多6小时才开始细胞分离过程。这些胎盘在实验室或采集中心均保存于室温或4 °C。当胎盘在4 °C或室温下保存时，所获得的间充质干细胞（MSC）未观察到可检测的差异，仅存在个体供体间的正常变异。
    4. 将装有胎盘的容器放入生物安全柜中。打开容器，将胎盘转移至无菌托盘中。
    5. 展开胎儿面的胎膜（羊膜囊或羊膜-平滑绒毛膜）8。辨识胎盘各部分结构：胎儿面有脐带插入点，通常位于胎盘中央；母体面（衬有基蜕膜）与胎儿面相对，具有明显的叶状结构（或小叶）。
    6. 开始解剖时，将胎盘置于无菌托盘中，使脐带朝上。
      注：本方案设计目标是从三种不同组织类型中每种获得足够接种一个T175培养瓶的细胞量。每次消化起始约使用10 g组织，这与从20 ml骨髓穿刺液中启动的MSC培养所用的起始培养瓶数量相似。若需要更多细胞，可采集更多组织并线性放大本方案。所建议的组织采集尺寸仅为基于胎盘组织实际操作性的参考值。胎盘绒毛中缺乏明确的解剖标志作为参照点，因此所标注的尺寸仅为估算值，脐带作为胎儿面上的定位标志。
  2. 蜕膜（D）组织的解剖
    1. 将胎盘翻转，使母体面（基蜕膜）朝上，确保带有脐带插入点的胎儿面朝下。
    2. 从胎盘母体面切取厚度约为0.5 cm的组织块（含基蜕膜组织）。
    3. 在解剖过程中，将组织块放入含有HBSS的培养皿中，以保持组织湿润。
    4. 转移足够量的组织至50 ml离心管中，使组织体积达到10 ml刻度线（约10 g组织）。
  3. 绒毛膜板（CP）组织的解剖
    1. 机械性去除胎盘胎儿面上的羊膜（非羊膜囊），保留绒毛膜绒毛部（即绒毛膜板）完整。
    2. 从绒毛膜板上切取约1 cm宽、0.5 cm深的组织块。优先从靠近脐带区域、远离胎盘边缘处采集绒毛膜板组织。
    3. 在解剖过程中，将组织块放入含有HBSS的培养皿中，以保持其湿润。
    4. 转移足够量的组织至50 ml离心管中，使组织体积达到10 ml刻度线（约10 g组织）。
  4. 绒毛（CV）组织的解剖
    1. 在已去除绒毛膜板（CP）的胎盘组织区域，解剖获取约1 cm2 × 0.5–1 cm深的绒毛组织（CV）。同样，优先从最靠近脐带、远离胎盘边缘的区域采集CV组织。尽量保持距胎盘母体面（含基蜕膜组织）至少1 cm的距离；目标是从胎盘绒毛组织内部获取组织。
    2. 在解剖过程中，将组织块放入含有HBSS的培养皿中，以保持其湿润。
    3. 转移足够量的组织至50 ml离心管中，使组织体积达到10 ml刻度线（约10 g组织）。
  5. D、CP和CV胎盘组织的剪碎与酶消化
    1. 将分别含有约10 g D、CP或CV组织的三个50 ml离心管中各加入约40 ml HBSS，反复倒置混匀以洗涤组织（重复约10秒）。
    2. 倾去上清液，并重复洗涤2–3次，直至溶液基本无血。倾倒上清时使用10 ml移液器或长镊子，确保组织块不随液体丢失。
    3. 将组织块转移回10 cm培养皿中，尽量减少液体转移。用剪刀或刀片将组织剪切成约1–5 mm3的小块。
    4. 将剪碎后的组织重新转移至相应标记（D、CP或CV）的50 ml离心管中。
    5. 加入新鲜配制的消化液，其体积至少与组织体积达到1:1比例（例如，10 ml组织加10 ml消化液）。盖紧管盖后反复倒置数次以充分混匀。
    6. 将含组织和消化液的离心管于37 °C孵育1–2小时。此步骤无需加湿环境或5% CO2。
      注：为有效解离细胞并最大化MSC产量，需进行快速振荡。若产量有限，则48小时后培养瓶中贴壁细胞极少，且首次传代时间超过1–2周。孵育时间和振荡方式取决于实验室所用37 °C培养箱的性能，可能需要优化。
      1. 若培养箱具备快速且可调控的振荡装置，可将组织与消化液置于50 ml离心管或无菌锥形瓶中，放入培养箱并设定振荡速度为250 rpm，可在1小时内完成完全消化。
      2. 若培养箱仅有轻微摇动或无摇动功能，则需每30分钟手动剧烈振荡离心管10秒，持续1.5至2小时。酶孵育期间可处理废弃物、清理生物安全柜内不必要的物品、更换污染的实验服，并准备下一步操作。
  6. 单个核细胞的收集与接种至培养瓶
    注：从前一步骤中可获得三个含正在消化组织的50 ml离心管（分别对应D、CP或CV）。当组织消化液呈现浑浊外观且组织中可见白色血管结构时，表明消化已完成。
    1. 向每管中加入30 ml含FBS的MSC培养基，以终止消化液中的酶活性。
    2. 为分离单个核细胞与未消化的大块组织碎片，对50 ml离心管进行瞬时离心。短暂启动离心机，使其达到340 × g并运行5秒后停止。此操作可使大块碎片沉淀至管底，而单个核细胞仍保留在液体悬液中。
      注：若仅进行短暂（瞬时）离心，单个核细胞将保留在液相中。若离心时间延长，单个核细胞也会与组织碎片一同沉淀，导致不必要的细胞损失。
    3. 收集含有单个核细胞的上清液，用移液器将其转移至新的50 ml离心管中。
    4. 向剩余的胎盘组织碎片中加入30 ml培养基或HBSS，并剧烈振荡。此举可使残留的已解离单个核细胞进入悬液，从而实现对潜在MSC的第二次收获。
    5. 对离心管进行第二次瞬时离心，并再次将上清液转移至新的50 ml离心管中。重复此步骤第三次，以最大化从每种组织来源中收集单个核细胞的效率。
    6. 将每种组织类型的上清液分别合并至两个50 ml离心管中，共得6管（D、CP和CV各两管）。每管于340 × g离心5分钟，使单个核细胞沉淀至管底。
    7. 小心倾去或用移液器吸走上清液至废液容器中。无需试图完全去除每一滴上清液。
      注：由于含有大量红细胞，细胞沉淀较为脆弱。若直接从50 ml离心管中倾倒上清液，需特别小心，避免误弃沉淀。
    8. 去除大部分上清液后，用手指轻弹离心管数次，使细胞沉淀松动。将沉淀合并，使D、CP或CV组织各自对应一个离心管，然后分别用35 ml MSC培养基重悬细胞。
    9. 可选：将单个核细胞组分通过安装在50 ml离心管上的100 µm孔径细胞滤网过滤，以去除细胞团块或纤维状物质。
      注：操作需谨慎，因滤网易堵塞或过满。此外，气泡可能阻碍滤液排出。若发生此情况，可缓慢提起滤网使其下方通气，或用细胞培养基冲洗滤网，或更换新滤网。省略过滤步骤似乎不会影响后续MSC培养的产量或质量。
      1. 可选地， 在此阶段可进行红细胞（RBC）裂解或密度梯度离心15。然而，我们的经验表明红细胞不会干扰MSC的贴壁或增殖，因此无需进行RBC裂解。若进行了RBC去除操作15，可在本步骤对单个核细胞进行计数。但需注意，此时绝大多数细胞并非MSC，而是来源于胎儿的滋养层细胞、内皮细胞和造血细胞，以及来源于母体的造血细胞和蜕膜基质细胞。
    10. 将每种D、CP或CV组织的细胞悬液分别接种至一个T175培养瓶中，在37 °C、5% CO2的加湿培养箱中进行培养。
  7. 分离后细胞扩增
    1. 在初次分离后48小时，从各培养瓶（D、CP和CV）中更换培养基，弃去原培养液并加入35 ml新鲜MSC培养基。弃去的培养液及未贴壁细胞可丢弃，因推测潜在MSC已贴附于组织培养瓶表面16。将培养瓶放回培养箱继续培养24小时。
    2. 再培养24小时后，用DPBS（25 ml）清洗培养瓶两次，以去除碎片和红细胞。轻轻晃动液体使其覆盖瓶底，以松动红细胞。用移液器吸除液体和碎片。向培养瓶中加入35 ml MSC培养基，放回培养箱继续培养。
    3. 每周更换培养基两次，持续培养至细胞单层达到80–90%融合度。初始扩增阶段通常需要4–14天，具体时间取决于组织质量、起始材料量以及消化液孵育的效率和时间。

3. pMSCs 的传代培养

  1. 当细胞培养物达到 80–90% 汇合时，用 20 ml 1× HBSS 或 DPBS 洗涤两次，弃去洗涤液。向每瓶中加入胰蛋白酶替代物（即 使用5 ml处理T175培养瓶。
  2. 将培养瓶在 37 °C 下孵育 5 分钟，以使间充质干细胞从组织培养表面解离。每隔约 2 分钟轻敲培养瓶侧面，以促进细胞脱落。
  3. 当细胞从培养表面脱离并形成单细胞悬液时，用MSC培养基冲洗培养瓶，并将细胞收集至离心管中。MSC培养基可稀释并灭活胰蛋白酶替代物（每T175培养瓶使用约15 ml MSC培养基）。
  4. 将每个组织培养瓶中的内容物转移至50 ml离心管中。
  5. 以 340 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
  6. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 ml MSC培养基中。
  7. 将10 µl细胞悬液与10 µl台盼蓝稀释。使用血细胞计数板计数细胞，并计算细胞总数 15.
  8. 将细胞以每平方厘米1,150个细胞的密度传代至新的培养瓶中2 在新鲜的MSC培养基中重悬，并置于组织培养孵箱中孵育。以该接种密度，将200,000个MSC接种至每个新的T175培养瓶中，每瓶加入35 ml MSC培养基。每周换液两次，直至细胞融合度达到80–90%。后续传代时接种密度为1,150个细胞/cm²。2 或每瓶T175培养瓶接种200,000个MSC。
  9. 当第1代（P1）或第2代（P2）细胞达到汇合状态时，将大部分细胞冻存以备后续使用，仅重新接种一个T175培养瓶用于进一步传代和鉴定。扩增后的细胞可用于第3代（P3）或第4代（P4）的中胚层分化实验及流式细胞术鉴定。
    注意：在早期传代过程中，可能仅有少量分散的克隆集落，但每个集落内部的局部细胞密度可能非常高。这种情况并不理想，因为细胞的局部密集排列会导致接触抑制，延缓细胞生长并降低培养效果。我们建议在观察到密集集落时，应及时收获细胞并重新接种至新的培养瓶中。这一重新分布过程可为细胞提供充足的增殖空间，从而整体提升培养性能。
  10. 为冻存间充质干细胞（MSC），收集约 1 x 106 细胞用1 ml含90% FCS和10%二甲基亚砜（DMSO）的冻存液重悬，按标准程序冻存。
    注意：在代表性结果部分，描述了使用流式细胞术对三种不同扩增细胞群（D、CP 和 CV）进行的间充质干细胞表征、中胚层分化以及XY FISH分析以确定其性别。在本研究中，胎盘来源于男婴，因此所有胎儿细胞均可被识别为男性（含Y染色体），而所有母体细胞均可被识别为女性（仅含X染色体）。

结果

胎盘间充质干细胞的分离步骤总结见图1。用于分离间充质干细胞的胎盘解剖结构的三个区域在图2中进行了标注，分别为母体蜕膜，以及主要来源于胎儿的绒毛膜板和绒毛组织。许多教科书、文献和在线资源详细描述了各种胎盘组织的发育过程及其功能作用（详见参考文献8）。

分离后48小时并去除组织碎片后的细胞培养形态。
培养48小时后，间充质干细胞（MSCs）会贴附于组织培养塑料表面，而红细胞（RBCs） 及大多数其他细胞碎片则不会贴壁。此时，必须将培养基更换为35 ml新鲜培养基。在更换培养基之前，由于大量红细胞的存在会阻碍观察，难以进行精确的形态学评估。不同胎盘供体来源的培养上清外观可能存在显著差异。这种差异在示例1和示例2中可直观看到（图3A）。这两个间充质干细胞分离样本虽初看差异明显，但均来自两个不同的胎盘，并在同一时间进行操作。然而，在洗涤之后，两者的培养形态变得相似（见洗涤后的示例3，图3A）。

在显微镜下观察，48小时换液后，仅有少量细胞贴附于培养瓶上（图3B），且这些细胞的形态与扩增程度更高的间充质干细胞（MSCs）有显著差异。部分碎片和红细胞（RBCs） 会以悬浮或聚集贴壁的形式存在，但不会干扰MSCs的生长。贴附在培养瓶底部的较长的成纤维样细胞可能包含间充质干细胞、造血细胞、滋养层细胞或内皮细胞等多种细胞成分。然而，非MSC细胞不会影响MSC培养，因为在MSC培养条件下，这些细胞通常无法存活超过1-2代。尽管初始培养时细胞形态可能存在一定差异，后续的扩增结果通常较为一致。

MSC 培养物随时间变化的形态学特征
在此代表性示例中，分离后七天可见少量成纤维样间充质干细胞（MSC）克隆集落，但也可观察到非MSC细胞，表现为圆形或 loosely attached 的细胞（图 4A). 贴壁细胞是最初所称的 "成纤维细胞集落形成单位" (CFU-F) 17 并随后称为MSC 1813天后，成纤维样MSC集落已变得较大（图4B）。此时，单层细胞通常会达到80-90%融合，应进行传代。从第2代开始，胎盘间充质干细胞单层在融合时将形成典型的漩涡状形态（图 4C。除非以低密度传代细胞，否则将不再观察到CFU-F的形成。在低密度下，胎盘来源的间充质干细胞比成人骨髓来源的间充质干细胞形态更小、更呈方形。 1尽管胎盘来源的间充质干细胞与骨髓来源的间充质干细胞具有相似的增殖速率，但前者更不易发生快速衰老。 5.

胎盘间充质干细胞的表征 体外
每个扩增的细胞群体都必须进行表征，以确保其符合标准的间充质干细胞（MSC）标准 16包括：（1）塑料黏附性；（2）表达间充质表面标志物且不表达造血系表面标志物；（3）具有中胚层分化潜能。

胎盘来源的间充质干细胞具有贴壁生长特性。
如图4所示，培养中的间充质干细胞呈贴壁生长，且具有成纤维细胞样的形态；这证实了这些细胞符合定义间充质干细胞的第一个标准16。

胎盘来源的间充质干细胞表达间充质表面标志物。
间充质干细胞的第二个定义性特征是表达间充质表面标志物，同时不表达造血表面标志物16。由于目前尚无单一标志物能够明确鉴定间充质干细胞，通常需联合使用多种标志物，并结合流式细胞术分析，以确认细胞具有间充质特性而无造血特性。在本研究提供的代表性数据集（图5A）中，我们检测了细胞对间充质标志物CD73、CD105、CD90、CD146和CD44，造血标志物CD45和 CD34，以及HLA-DR和内皮细胞标志物CD31的表达情况。本胎盘间充质干细胞表征过程中所使用的所有抗体均列于材料/设备表中。染色操作严格按照试剂生产商的说明书进行，分析方法详见文献19。

细胞对间充质标记物 CD73、CD105 和 CD44 呈阳性，对细胞表面标记物 CD45、CD34、HLA-DR 和 CD31 呈阴性，符合预期5,20。在我们的代表性数据集中，约有 37% 和 57% 的细胞分别对 CD90 和 CD146 呈阳性21。CD90 和 CD146 均为常用的间充质干细胞（MSC）标记物21。MSC 的细胞表面标记物表达谱可能因 MSC 组织来源、培养基成分或传代次数的不同而有所差异22。根据我们多年的实践经验，在经历 1–2 次传代后，胎盘来源的 MSC 未观察到与非间充质细胞的长期污染5,11。

胎盘间充质干细胞具有间充质分化潜能
根据定义，MSC 必须具备 体外 中胚层分化能力 5,13中胚层分化潜能通常通过三系或双系分化检测进行评估。双系分化检测一般评估成骨和成脂分化能力，而三系分化检测 additionally 评估软骨分化能力。在本文展示的代表性结果中，我们发现扩增后的间充质干细胞群体形成了钙盐沉积，提示具有成骨分化能力，同时也形成了脂质空泡，提示具有成脂分化能力（图5B).

为表征本文报道的间充质干细胞（MSC）群体，我们将细胞以每毫升诱导培养基中接种6 × 104个细胞的密度接种于24孔培养板中。培养基组分详见材料/设备表。尽管诱导培养基配方在文献中较为常见，但已发表的配方存在较大差异。因此，我们在此简要列出所用的诱导培养基配方及染色方法。成骨诱导培养基包含DMEM-HG、10% FBS、1×抗生素-抗真菌溶液、10 mM β-甘油磷酸钠、100 nM地塞米松和50 μM L-抗坏血酸-2-磷酸。成脂诱导培养基包含DMEM-HG、10% FBS、1×抗生素-抗真菌溶液、10 μg/ml胰岛素、100 nM地塞米松、200 μM吲哚美辛和500 μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。培养物置于37 °C、5% CO2的培养箱中，培养14天。在培养期间，每星期更换两次诱导培养基。经过14天诱导后，根据我们先前发表的研究5，对培养物进行骨样基质（成骨）或脂滴空泡（成脂）的鉴定。成骨钙基质沉积分析首先通过吸除培养基，用4%多聚甲醛固定20分钟，用DPBS洗涤单层细胞，然后按照制造商说明书使用茜素红S染色。成脂诱导的评估方法为吸除培养基，用4%多聚甲醛固定20分钟，洗涤单层细胞，然后按照制造商说明书使用油红O溶液染色。染色后的钙沉积物和脂滴在光学显微镜下观察，并保存图像以供后续参考。

在先前的发表文献中，我们已更为详尽地表征了胎盘来源的间充质干细胞的分化潜能 4,5胎盘来源的间充质干细胞成骨分化能力与骨髓来源的间充质干细胞相似，而其成脂分化效率通常低于骨髓来源的间充质干细胞 5我们不常规进行软骨分化，原因有多个，尽管我们此前已报道过胎盘来源的间充质干细胞（placental-MSC）的软骨分化能力。 5首先，尽管中胚层分化能力是间充质干细胞（MSC）的一个定义性特征，但其重要性可能居于次要地位。 23-25，尤其是当治疗效果可能源于间充质干细胞的旁分泌分泌物时 26其次，尽管多米尼奇 等 成人骨髓来源间充质干细胞临床制备的建议最低标准 16，但最近的研究表明，来自不同微环境的MSC具有不同的固有特性和分化能力 5,13,27-32。事实上，Parolini 等 提出胎盘来源的MSC应分化为 "一个或多个中胚层来源的" 谱系而非全部三个谱系 10最后，许多间充质干细胞研究将软骨形成分化排除在外，因为其通过与成骨作用相似的细胞内信号通路（TGF）进行β 家族通路 33-35.

采用该培养方法时，尽管起始材料在解剖位置上来源于胎盘，但所获得的间充质干细胞（MSC）为母体来源。
许多出版物认为，培养从胎儿绒毛膜中分离的细胞可获得胎儿间充质干细胞 14然而，正如我们先前所报道的那样 5所有采用本方案获得的胎盘绒毛膜来源的细胞培养物，均会迅速富集母源间充质干细胞，这与母体蜕膜间充质干细胞培养物的预期结果一致。在这些代表性结果中，我们使用了来自男婴的胎盘组织，以便能够清晰区分扩增后细胞群体中的胎儿细胞与母源细胞贡献。本研究中所用的XY FISH试剂盒列于下文 材料与设备清单，并遵循制造商的说明。

在所提供的代表性数据中，来自母体蜕膜的培养物在第0代时约含有90%的母体细胞（XX）和约10%的胎儿细胞（XY）。图6。到第2代时，源自母体组织的细胞群体几乎全部为母源细胞（XX），而胎儿细胞（XY）无法被检测到。这表明对母体组织进行物理分离可使后续培养中的母源细胞得到富集。然而，必须关注来自胎儿绒毛及绒毛板的培养结果。在第0代时，胎儿绒毛和绒毛板来源的培养物中约85%为XY，即具有胎儿来源，表明靶向分离使胎儿细胞得以富集图6在传代0代时，两种培养物均含有约15%的母源细胞（XX）污染。令人意外的是，在传代2代时，两种胎儿来源的培养物中几乎全部（约100%）为母源细胞（XX），而胎儿细胞（XY）已无法检测到。XY荧光原位杂交（FISH）分析表明，来源于胎儿绒毛组织的培养物被母源细胞（XX染色体）快速且一致地占据。这一培养现象至关重要，却常被忽视。 5该分析的详细内容包含在本方案中，因为它表明了一个非常重要的现象：当使用添加10%胎牛血清的DMEM培养基时，母源细胞会迅速占据所有培养物 旨在支持胎源性细胞群体的其他因子。

figure-results-1
图1：胎盘间充质干细胞分离流程概要。（步骤1）熟悉胎盘的解剖结构。（步骤2）使用剪刀从蜕膜、绒毛膜绒毛或绒毛膜板中手动分离 10 g 组织。（步骤3）用剪刀或解剖刀将分离出的蜕膜、绒毛膜绒毛或绒毛膜板组织切成细小碎片。
（步骤4）通过使用dispase和胶原酶I消化1-2小时，从细小组织碎片中释放细胞。
（步骤5）通过脉冲离心和/或经细胞筛过滤洗涤，将细胞 与纤维组织分离。收集细胞并重悬于培养基中，接种至培养瓶中。请点击此处查看该图的放大版本。

间充质基质细胞（MSC）将根据其贴壁生长的特性和在培养基中存活与增殖的能力进行筛选。最后，在结果部分，扩增后的MSC可被鉴定并储存，以用于后续实验。

figure-results-2
图2：人类足月胎盘的解剖结构及本实验中分离的组织。 首先获取的组织是母体蜕膜。蜕膜是在胎盘从子宫壁脱落之后，残留在其表面的一层薄薄的组织（蜕膜由绿色标记标示）。从胎盘内部获取的第二种组织是胎儿绒毛膜绒毛（蓝色标记）。第三种获取的组织是胎儿绒毛膜板（红色标记）（改编自参考文献36）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：分离后48小时并清除组织碎片后的培养物形态。（A）在洗去碎片前，不同胎盘供体的培养上清液外观可能存在显著差异。示例培养物1和2展示了这种差异。这两个分离操作是同时进行的，但来自两个不同的胎盘。洗涤后，培养物将如示例3所示，清除红细胞 和组织碎片。后续的扩增结果通常一致。（B）在48小时换液后，仅有少量细胞贴壁于培养瓶。比例尺 = 200 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：间充质干细胞培养随时间推移的形态变化。 (A分离后第7天，可见少量成纤维样间充质干细胞集落，但同时存在非间充质干细胞，表现为圆形或 loosely attached 的细胞。 (B) 分离后第13天，成纤维样MSC集落已显著增大，MSC单层常已达到汇合状态，可进行传代。C从第2代开始，MSC单层细胞在汇合时将形成特征性的漩涡样形态。比例尺 = 200 μm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

figure-results-5
图5：通过流式细胞术鉴定间充质干细胞及其向中胚层分化的能力 (A胎盘绒毛来源的间充质干细胞通过流式细胞术分析显示出典型的间充质干细胞标志物表达谱，尽管这些细胞表面标志物在所有类型的人间充质干细胞中表达相似。每个直方图显示信号强度（x轴）与y轴上的归一化细胞数（最大值的百分比）之间的关系。在此代表性数据集中，细胞对CD73、CD105和CD44呈阳性，而对造血细胞标志物CD45呈阴性 CD34 和 HLA-DR。B胎盘来源的间充质干细胞通常具有较强的成骨分化能力，然而（C脂肪向分化效率可能低于骨髓来源的间充质干细胞。图注B和C中的图像采用40倍放大倍数拍摄。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图6：尽管起始材料在解剖学上位于胎盘，但通过本培养方法获得的胎盘间充质干细胞源自母体。 图示为从蜕膜、绒毛及绒毛板组织分离的胎盘间充质干细胞（MSC）培养物在每第二代时的胎儿（男性，XY）和母体（女性，XX）细胞成分的定量结果。源自胎儿绒毛组织的培养物中，母体细胞（XX）迅速且可重复地占据主导。胎儿 = 男性 = 单个细胞中检测到XY染色体，母体 = 女性 = 单个细胞中检测到XX染色体。数据 此处展示的数据来自 N = 3 个独立供体胎盘 男婴样本，每个数据点至少计数100个经XY FISH染色的细胞。柱状图表示平均值，误差线表示一个标准差。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

胎盘是一个体积较大的母胎器官，可从中分离出胎儿或母体的间充质干细胞（MSC）22。本文详细介绍了胎盘的解剖结构，并说明了如何特异性地分离蜕膜（母体）、绒毛膜绒毛（胎儿）和绒毛膜板（胎儿）组织（步骤2.2–2.4）。随后，我们概述了一种可靠的方案，可用于从上述三种组织中分别分离间充质干细胞（步骤2.5–2.6）。胎盘来源的间充质干细胞扩增效率高，其培养形态与骨髓来源的间充质干细胞相似（图3 和 图4）。成骨分化效果稳定（图5B），而脂肪分化效率通常较低（图5C）5。

许多刚进入该领域的研究人员会认为，所获得的培养物 从胎儿绒毛或绒毛膜板组织中分离的细胞将富集胎儿间充质干细胞（MSC）。然而，据我们观察，当使用标准的MSC扩增培养基（如DMEM-LG + 10% FBS）时，胎儿细胞的富集仅为暂时性 5此处我们以男婴胎盘组织为例提供代表性结果。使用男婴的胎盘组织，可轻松识别具有XY染色体的胎儿细胞，而母体细胞则可识别为具有XX染色体。 图6 显示一个代表性培养物的XY FISH结果。尽管来自胎儿绒毛膜绒毛或绒毛膜板组织的初始培养物中富含胎儿间充质干细胞（XY）（可达80%），但这些培养物会迅速被（约100%） 在前两次传代中，母源（XX）间充质干细胞在由DMEM-LG加10% FBS组成的常规培养基中，少数来自母体的间充质干细胞污染了胎儿组织，并在培养中胜过胎儿来源的细胞。

本方案中一个关键步骤是理解胎盘解剖结构，并明确胎儿组织和母体组织最有效的取材部位。如代表性结果部分所述，分离胎儿组织确实能够实现胎儿来源间充质干细胞（MSC）的短暂富集。通过添加特定的外源性生长因子以优化扩增培养基配方，应可实现对胎儿来源MSC群体的选择性扩增，从而制备出富集胎儿细胞而非母体细胞的细胞产品（本课题组目前正在开发此类培养基配方）。制备胎儿MSC群体可能具有多项优势，据称胎儿MSC在血管生成能力和免疫抑制特性方面均优于相应的母体MSC群体37。

在所述的每种分离方案中，我们均使用了约 10 g 组织。一个完整的胎盘通常重 500–750 g，而在先前的研究中，我们已证明通过自动化组织消化及细胞扩增生物反应器工艺，单个胎盘可制备超过 7,000 剂临床级细胞4。这些数据凸显了胎盘来源的间充质干细胞在同种异体间充质干细胞治疗中的潜在适用性，也表明无论间充质干细胞来源于胎儿或母体，该方法均具有重要意义。从治疗角度来看，最关键的是使用者必须充分了解细胞产品，并具备稳定生产该细胞产品的能力。我们希望本视频能够帮助研究人员理解胎盘解剖结构，掌握从胎盘中分离间充质干细胞的技术，并预判其培养物中可能含有的胎儿或母体细胞组成。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

RP 获得了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（NHMRC）博士后培训基金的支持。VS 获得了昆士兰大学国际研究生奖学金的支持。MRD 获得了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（NHMRC）和澳大利亚_inner wheel_组织的支持。

感谢临床和护理人员在患者知情同意和样本采集方面的协助。感谢 Nickolas Fisk 教授、Kerry Atkinson 教授和 Rohan Lourie 博士在产科、胎儿-胎盘发育及胎盘解剖学方面提供的有益讨论。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂
HBSSGibco/Invitrogen14185-052长名称：Hanks平衡盐溶液
FBSGibco/Invitrogen胎牛血清
胰蛋白酶替代物Gibco/Invitrogen12563-029长名称：TrypLE Select
DMEM-LGGibco/Invitrogen11885-092杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基-低葡萄糖
DMEM-HGGibco/Invitrogen11965118杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基-高葡萄糖（4.5 g/L）
PBS（无Mg²⁺和Ca²⁺）Gibco/Invitrogen14190-250长名称：无镁无钙杜尔贝科磷酸盐缓冲液
抗-抗-Gibco/Invitrogen15240-062长名称：抗生素-抗真菌素溶液 ×100
多聚甲醛粉末或4%溶液任何 
胶原酶 IInvitrogen17100-017 2,500 U/ml
Dnase ISigmaD502510 mg/ml  0.15 M NaCl
DispaseInvitrogen17105-041 10 mg/ml（水溶液，20,000 U/ml）
<强>材料<强>公司<强>货号<强>评论
<强>一次性用品：
50 ml 离心管Falcon 或任何品牌
培养皿，无菌塑料（直径 25 cm 和 10 cm）Nunc
细胞滤网（100 μm)Becton Dickinson352340
175 和 75 厘米2 T175 和 T75 组织培养瓶Nunc
5 ml、10 ml、25 ml 无菌血清移液管任何品牌
<强>材料<强>公司<强>货号<强>评论
<强>设备：
 离心  
 组织培养箱 37 °C，5% CO2
生物安全柜
 无菌剪刀和镊子
试管架 
移液器助吸器或同等产品
Gilson 型移液器及无菌吸头 1,000 µ升，200 µ升，20 µl.
摇床或振荡培养箱（37 °C)
个人防护装备
清洁溶液（适用于血液）
废物容器，用于组织/血液的正确处置垃圾桶
<强>用于间充质干细胞表征的试剂
<强>抗体（克隆编号）<强>制造商<强>目录编号<强>同型对照
CD73（AD2）Miltenyi Biotec130-095-183小鼠 IgG1
CD105（43A4E1）Miltenyi Biotec130-094-941小鼠 IgG1
CD90/Thy-1 (AC122)Miltenyi Biotec130-095-403小鼠 IgG1
CD45（5B1）Miltenyi Biotec130-080-202小鼠 IgG2a
CD34（AC136）Miltenyi Biotec130-090-954小鼠 IgG2a
HLA-DR (AC122)Miltenyi Biotec130-095-298小鼠 IgG2a
CD31（PECAM-1）BD Pharmingen555446小鼠 IgG1
CD146 (541-10B2)Miltenyi Biotec130-092-849小鼠 IgG1
CD44（DB105）Miltenyi Biotec130-095-180小鼠 IgG1
<强>同型对照（克隆编号）<强>制造商<强>目录编号
小鼠IgG1同型对照（IS5-21F5）Miltenyi Biotec130-092-214
小鼠 IgG1 同种型（IS5-21F5）Miltenyi Biotec130-092-212
小鼠IgG1同型对照（IS5-21F5）Miltenyi Biotec130-092-213
小鼠 IgG2a（S43.10）Miltenyi Biotec130-091-837
小鼠 IgG2a（S43.10）Miltenyi Biotec130-098-849
MACS 缓冲液Miltenyi Biotec130-091-221
<强>成骨分化<强>制造商<强>货号
DMEM-HGGibco/Invitrogen11965118杜尔贝科’改良型伊格尔培养基-高葡萄糖（4.5 g/L）
FBSGibco/Invitrogen胎牛血清
抗-抗-Gibco/Invitrogen15240-062长名称：抗生素-抗真菌素溶液 ×100
地塞米松SigmaD4902
β甘油磷酸Sigma50020
L-抗坏血酸-2-磷酸盐SigmaA8960-5G
茜素红SSigmaA5533-25G用于钙基质染色
<强>脂肪细胞分化<强>制造商<强>货号
DMEM-HGGibco/Invitrogen11965118杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基-高葡萄糖（4.5 g/L）
FBSGibco/Invitrogen胎牛血清
抗-抗-Gibco/Invitrogen15240-062长名称：抗生素-抗真菌素溶液 ×100
胰岛素SigmaI2643
地塞米松SigmaD4902
吲哚美辛SigmaI7378
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤SigmaI5879
油红O溶液SigmaO1391-250ML用于脂滴染色
<强>XY FISH试剂盒用于确定细胞的胎儿或母体来源
XY染色体FISH试剂盒Vysis（Abbott Molecular）07J20-050长名称：CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen 直接标记荧光DNA探针试剂盒

参考文献

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