一种饲养方法 黑腹果蝇 在无菌和已知菌条件下进行培养的方法被介绍。果蝇胚胎在次氯酸钠中脱去卵壳，无菌转移至无菌培养基中，并在密闭容器中饲养。通过将细菌接种至培养基和胚胎，可建立已知菌关联，细菌的存在通过全虫涂板法确认 果蝇 匀浆液
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摘要
摘要
近年来，微生物对多种动物特征和行为的影响日益受到关注。果蝇 黑腹果蝇 是研究微生物与动物宿主相互作用的模型，得益于能够大规模培养大量样本的方法 果蝇 在无微生物（无菌）条件下，或与定义明确的微生物群落（已知菌群）共同培养。本文概述了一种样本采集方法 果蝇 胚胎、次氯酸盐去壳与灭菌，以及转移至无菌培养基。将灭菌后的胚胎转移至50 ml离心管中的无菌培养基内，发育中的幼虫和成虫在试管打开前始终保持无任何外源微生物的状态。 Alternatively，可通过将目标微生物接种至无菌培养基和胚胎，培育具有特定菌群组成的果蝇。我们描述了引入4种细菌物种以建立代表性已知菌群微生物组的方法 果蝇 最后，我们描述了确认细菌群落组成的方法，包括检测是否为无菌 果蝇 成年后仍保持无菌状态。
引言
大多数动物从出生到死亡都与细菌（“微生物群”）密切相关1无菌动物与有菌动物的比较研究表明，微生物会影响动物健康的多个方面，包括代谢、营养、血管、肝脏、呼吸、免疫、内分泌和神经功能2果蝇 黑腹果蝇 是研究微生物存在条件下多种过程的关键模型3,4 以及研究微生物群对动物健康的影响5,6没有一种细菌物种存在于所有个体中（“核心”），但 醋酸杆菌 和 乳酸杆菌 在实验室饲养和野外捕获的样本中，该物种在微生物群中均占数量优势 D. melanogaster. 其他 醋杆菌科 （包括 Komagataeibacter 和 Gluconobacter), 厚壁菌门 （例如 肠球菌 和 Leuconostoc，以及 肠杆菌科 频繁存在于 果蝇 丰度较低或丰度较高但出现不规律的个体7-12.
微生物群 果蝇 在世代内和世代间，哺乳动物的表现不稳定14,19微生物群落的不稳定性在测量依赖微生物群的性状时可能导致表型噪声。例如， 醋杆菌科 影响脂质（甘油三酯）的储存 果蝇15-18。如果 醋杆菌科 在一个试管中的果蝇数量多于另一个试管中的果蝇数量19，同基因型果蝇可能具有不同的表型20解决小鼠肠道微生物群不一致问题的方案14 自20世纪60年代以来，通过向每一代新生小鼠仔鼠引入由8种优势微生物组成的明确定义的菌群（改良Schaedler菌群），确保每只仔鼠均暴露于相同的关键小鼠肠道微生物成员。该方法即使在微生物群并非研究主要目标的情况下，也能有效控制微生物群的组成。32，并为确保在多种实验条件下关键微生物的存在提供了先例。
定义微生物对...的影响 果蝇 营养，已开发出多种建立无菌果蝇品系的方案，包括对胚胎（无论是来源 从头合成 每一代或通过转移至无菌饮食进行代际维持）以及抗生素处理13不同的方法各有优势，例如抗生素处理和连续传代操作简便、快速，而后者在控制混杂变量方面更具优势 从头合成 去壳例如，卵密度、残留污染微生物、抗生素的脱靶效应）。无论采用何种制备方法，向无菌胚胎引入特定微生物种类均可实现培养 果蝇 具有明确定义的（“已知菌群”）微生物群落。或者，可模拟使用 Schaedler 菌群的方法，将该菌群接种至常规孵化的卵中（仅执行步骤 6–7），以确保每个试管中均存在影响性状的微生物，从而避免因微生物群不一致带来的复杂性。本文描述了无菌及已知菌群果蝇的培养方案 果蝇 由 从头合成 胚胎去壳，以及确认引入或污染的微生物类群的存在。
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方案
1. 培养细菌（在挑选卵子前约1周开始）
- 制备改良MRS20（mMRS）平板和肉汤试管（表1）。每只100 mm培养皿中倒入20 ml mMRS琼脂，静置冷却/干燥过夜；或每只18 mm试管中加入5 ml mMRS肉汤。
- 将Acetobacter pomorum、A. tropicalis、Lactobacillus brevis和L. plantarum划线接种于mMRS琼脂平板上。Acetobacter在30 °C条件下培养过夜。Lactobacillus需进行厌氧培养：将平板放入密闭容器中，充入二氧化碳后密封，在30 °C条件下培养过夜。
注意：L. brevis菌落可能需24–48小时方可可见。平板可保存于4 °C，菌落可在3周内使用。 - 在将去壳卵转移至无菌饲料前2–3天（第5节），从mMRS平板上挑取单菌落接种至含mMRS肉汤的试管中。Acetobacter在30 °C、振荡条件下培养，Lactobacillus在30 °C静置培养24小时或直至肉汤浑浊。
2. 准备无菌饮食
- 制备无菌饮食（表2在2 L锥形瓶中。微波加热培养基直至连续沸腾三次，每次沸腾之间搅拌混合。
- 将烧瓶置于搅拌台上，转移饲料至锥形离心管时保持搅拌。将7.5 ml饲料转移至50 ml离心管中。管盖松松盖上，放入一个带盖的、可高压灭菌的聚丙烯架中。
- 使用高压灭菌器在 121 °C 和 15 psi 条件下灭菌果蝇食物 25 分钟。从高压灭菌器中取出架子后，立即水平摇动每个架子，以确保食物在冷却过程中不分层。注意避免垂直摇动架子，以防食物溅到管盖或管口边缘。将食物在摇床上冷却 exactly 45 min，随后再次手动水平摇动食物。
注意：饲料可在 4-15 °C 条件下保存长达一周。 - 作为使用可高压灭菌的带盖架子（步骤2.1–2.3）或在含酸性防腐剂的饲料上培养果蝇的替代方法，请执行以下步骤：
- 在2 L的烧瓶中加入磁力搅拌子，配制1 L液体饲料。对饲料进行高压灭菌。
- 高压灭菌后，加入10 ml 防腐剂，并在加热磁力搅拌器上持续搅拌。当琼脂冷却至50–60 °C时，将锥形瓶转移至生物安全柜内的加热磁力搅拌器上，并维持瓶内温度在50–60 °C。
- 在生物安全柜中，用移液器将约 7.5 ml 分别加入锥形管中。
3. 准备产卵笼
- 通过将100 ml水、10 g酿酒酵母、10 g葡萄糖和1 g琼脂放入微波炉加热制备葡萄汁琼脂平板。在步骤1.1中煮沸三次，并加入10 g冷冻葡萄汁浓缩液，以提高琼脂平板上卵的可见度。
- 当琼脂冷却至55 °C时，将20 ml倒入100 mm培养皿中，静置使其凝固。
- 通过将1 g酿酒酵母与15 g水混合制成酵母糊，覆盖琼脂平板表面。将酵母糊倒入琼脂平板，确保表面完全覆盖，然后倒去多余液体，留下一层薄薄的酵母残留物。若使用多个平板，可依次将酵母糊倒入多个平板中。
- 将琼脂平板转移至饲养笼底部。
注意：32盎司的熟食容器可作为亚克力果蝇饲养笼的良好替代品。- 通过在32盎司熟食容器盖子上切一个孔，并用无毒胶水将透气网膜粘在孔上，制成容器盖。若所用胶水可溶于水，则应避免盖子接触水分。
- 将200–300只果蝇转移至容器中，并盖上盖子。用空的培养皿盖覆盖网膜保护的孔，以防止琼脂表面水分蒸发；如需要，可在盖内放置湿润的纸巾。在25 °C下孵育果蝇过夜，孵育时间为16–20小时。
4. 收集卵子
- 通过将尼龙网放入塑料衬套中，制备用于收集卵的筛子。
- 为取回带有卵的培养板，将果蝇从笼中转移至一个空容器以去除果蝇。如果次日需继续使用同一批果蝇，请立即将其转移至含有新鲜酵母化葡萄汁琼脂板的新笼中。同一批果蝇可连续使用3-5天。
- 用干净的画笔将死亡的果蝇从琼脂表面移除，注意不要破坏琼脂结构。
- 用蒸馏水冲洗琼脂板，轻轻刷下卵，并将悬液倒入筛网上以收集卵。重复此操作3-4次，直至琼脂板上的全部或大部分卵被收集完毕。
5. 脱去卵壳并转移至无菌培养基
- 用70%乙醇喷洒生物安全柜内部（包括侧面）进行准备。用实验纸巾擦拭底部，并用紫外灯照射约15分钟以对操作台面灭菌。将所有非生物用品（样本杯、毛刷、镊子、废液容器、400 ml无菌水和100 ml 0.6%次氯酸钠溶液）用乙醇喷洒后立即放入生物安全柜中，并用紫外灯照射15分钟进行灭菌。
- 开始第一次0.6%次氯酸钠清洗：将带有卵的套管放入一个120 ml的样本杯或其他无菌容器中。缓慢倒入约90 ml的0.6%次氯酸钠溶液至套管边缘稍下方。
- 漂洗卵2.5分钟。在此期间，使用镊子上下移动套管，定期重新悬浮卵。
- 在生物安全柜内，将套管直接转移至第二个预先装有90 ml漂白剂的样本杯中。
- 在生物安全柜内重复步骤5.3。第二次漂白处理结束时，卵应开始附着在套管壁上。
- 在生物安全柜内执行步骤5.7–5.8。
- 弃去漂白剂，并用无菌水清洗套管三次。每次清洗过程中，使用镊子移动套管多次重新悬浮卵。第三次清洗结束后，大多数卵应已附着在套管侧壁上。
- 使用经乙醇灭菌的毛刷，将卵从套管侧壁转移到无菌培养基上。可逐个或分小批转移卵。每瓶接种30–50个卵为宜。瓶盖保持松动，以允许氧气进入试管。若需维持无菌状态，则将试管转移至昆虫培养箱；否则按以下方法加入细菌。
6. 使用4种细菌制备无菌果蝇
- 制备细菌
- 在生物安全柜中准备好灭菌的必需物品（移液器、移液器吸头盒、灭菌离心管、MRS肉汤和试管架），如步骤4.1所述。将试管放入生物安全柜前，用浸有乙醇的实验室擦拭纸擦拭试管外表面。
- 将500 µl过夜培养物转移至无菌微量离心管中，通过离心沉淀细菌。若菌液密度较低，可向每管中加入最多1.5 ml培养物，或分次去除上清液后向同一管中添加额外培养物。将样品移出生物安全柜，于10,000 × g离心10分钟。使用滤芯吸头以避免样品间交叉污染。
- 通过测量OD值确定每种培养物的密度600若使用多孔板读数仪，将每种培养物分别以1倍、2倍和4倍稀释度各取200 µl转移至96孔板中。
- 使用酶标仪和以下公式，确定用于溶解每个细胞沉淀（5.2.2）的 mMRS 体积。计划加入足量的培养基，以便向每支果蝇培养管中接种 50 μl。
- 收集 OD600 在平板读数分光光度计上测定每种细菌培养物1:1、1:2和1:4稀释度的读数。为每种细菌菌株选择产生合适OD的稀释度600 在0.1至0.2之间选择一个数值，并将其及其对应的稀释倍数分别作为公式6.1.4.2或6.1.4.3中的“O”和“D”。
- 若使用本文所述的4种物种，需将细胞归一化至等效的菌落形成单位（CFU）/ml密度（OD600 先前确定的CFU换算系数20）使用此方程：
E = ((O-B) × V × D)/C
其中，E = 重悬沉淀的体积（μl），O = OD600 细菌，B = OD600 空白培养基，D = 稀释倍数，V = 离心前细菌培养物体积（µl），C = OD600 预设的常数。有关使用这些方程进行计算的示例，请参见补充代码文件。对于可自动调零的分光光度计，使用 "O" 代替 "O-B".
注：预设的常数（单位OD600，归一化至107 CFU/ml-1，由此推导出的常数20如下： A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056). - 若使用其他细菌种类（无CFU/OD600 常数可获得时，将密度归一化至OD600 = 0.1，使用此方程：
E = ((O-B) × V × D)/0.1 OD600
注意：单位与步骤 6.1.4.2 中相同。有关使用这些方程进行计算的示例，请参见补充代码文件。
- 在生物安全柜中，用移液器吸头吸除上清液，并根据步骤 6.1.4.2 的计算结果，用新鲜的 mMRS 或 PBS 重悬沉淀。
- 接种细菌
- 在生物安全柜中，将50 µl细菌转移至含有无菌食物和去壳卵的锥形管中。在转移卵后添加细菌，以防止不同样品管之间的污染。
- 将接种后的试管置于25°C培养箱中。
7. 测定菌落形成单位载量/检测无菌性
- 为测定全虫匀浆中的菌落形成单位（CFU）载量，将5只果蝇（羽化后5–7天）转移至含有125 µl陶瓷珠和125 µl mMRS培养基的1.7 ml微量离心管中。使用组织匀浆器以4.0 M/sec的速度匀浆30秒。
- 可选方案：省略陶瓷珠，使用塑料研磨杵在微量离心管中手动匀浆1分钟。
- 若需定量肠道微生物群，应对果蝇进行表面灭菌以去除外源微生物22。将果蝇转移至含有100 µl 70%乙醇的微量离心管中处理1分钟，吸除乙醇后，将果蝇转移至新的微量离心管中进行匀浆。若需测定肠道DNA含量，则在乙醇洗涤前用0.6%次氯酸钠冲洗1分钟。
- 用875 μl mMRS稀释匀浆液，涡旋振荡5秒，然后将120 µl匀浆液移入微孔板的第一个孔中。
- 在接下来的两个孔中，使用10 µl匀浆液和70 µl MRS进行两次连续的1:8稀释。
- 从第一孔中取出10 µl加入第二孔（含70 µl MRS），充分混匀；再从第二孔中取出10 µl转移至第三孔（含70 µl MRS），并充分混匀。由此可获得原始1,000 μl匀浆液的三种总浓度：未稀释、1:8和1:64。
- 将每种稀释液各10 µl转移至mMRS平板（可根据需要使用多通道移液器）。轻微倾斜培养皿，使液滴沿琼脂表面向下扩散数毫米，待液体干燥后再移动平板。若平板已存放2天，则液体干燥较快，可减少相邻液滴间的混合。
- 在30 °C下培养1–2天。当观察到明显且独立的菌落时，从具有10–100个独立菌落的稀释度平板上进行计数。
- 使用公式 E = C × D / P × V / F 计算每只果蝇的CFU，其中E为每只果蝇的CFU，C为计数的菌落数，D为稀释倍数，P为点样体积（µl），V为果蝇匀浆总体积，F为匀浆所用果蝇数量。
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结果
通过无菌蝇全虫匀浆后未分离出任何CFU来确认无菌蝇的成功培育 D. melanogaster 成人（图1）。或者，如果涂布的匀浆产生菌落，则说明冻存管已被污染，应予以丢弃。对于已知菌群果蝇，四种细菌分离株均分离自5只成年雄蝇的混合样本，表明与成年果蝇相关的可存活菌落总数（CFU）存在差异图1）。每种细菌具有独特的形态，可通过视觉加以区分（图2）。如果未检测到一种或多种菌落类型，则可能在制备细菌接种物时出现错误（例如， 洗涤、标准化、混合）或相应物种可能与培养条件不兼容（例如, 果蝇 密度23 或基因型24）。为排除技术误差，建议在接种果蝇培养瓶后立即取部分细菌混合物进行平板接种（步骤 6.2）。
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讨论
本文所述方法是胚胎去壳的多种方法之一8,11,18,25,26,27，此外还有其他无菌果蝇培养方法，包括无菌成虫的连续传代18,27或抗生素处理13,18。其他去壳方法包括乙醇洗涤，以及缩短11,25,26或延长8次氯酸盐处理时间。不同的洗涤步骤可能有助于培养不同基因型的果蝇：在之前的一项研究中，约100种黑腹果蝇（Drosophila）基因型中大多数在采用本文所述方法（不使用乙醇洗涤）培养时可获得无菌个体，但部分品系受到污染而被弃用24。或许若采用乙醇洗涤或更长时间的次氯酸盐处理，这些受污染的品系也能成功获得无菌个体。如果按照本文所述方法无法为特定宿主基因型获得无菌果蝇，我们建议采用乙醇冲洗或延长次氯酸盐处理时间以解决该问题。
当进行连续传代时 黑腹果蝇 使用时，通过此处所述的去卵壳方法获得无菌的亲代，后续世代在生物安全柜中通过无菌转移进行维持，可选择是否添加抗生素18,27连续传代比每代重新...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本方案的部分细节在 Adam Dobson 博士的协助下进行了优化，他同时还对稿件提出了有益的修改意见。本研究工作由美国国立卫生研究院基金会（FNIH）资助，资助编号 R01GM095372（JMC、A(CN)W、AJD 和 AED）；FNIH 资助编号 1F32GM099374-01（PDN）；以及杨百翰大学启动资金（JMC、MLK、MV）。出版费用由杨百翰大学生命科学学院及植物与野生动物科学系提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 啤酒酵母 | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312 |
| 葡萄糖 | Sigma Aldrich | 158968-3KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US |
| 琼脂 | Fisher--Lab Scientific | fly802010 | https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177 |
| Welch's 100% 葡萄汁浓缩液 | 沃尔玛或其他杂货店 | 9116196 | http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406 |
| 饲养瓶：32 盎司半透明圆形熟食容器 | Webstaurant Store | 999L5032Y | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html |
| 半透明圆形熟食容器盖 | Webstaurant Store | 999YNL500 | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html |
| 储存瓶 | Genesee Scientific | 32-130 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130 |
| Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101 |
| 尼龙筛网 | Genesee Scientific | 57-102 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102 |
| 塑料衬套 | Home Depot | 100404002 | http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002 |
| 塑料衬套盖 | Home Depot | 100153897 | http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897 |
| 样本杯 | MedSupply Partners | K01-207067 | http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html |
| 50 ml 离心管 | TrueLine Centrifuge Tubes | TR2003 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003 |
| 食物盒 | USA Scientific | 2316-5001 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001 |
| Lysing Matrix D 散装 | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search |
| 滤芯吸头，300 μl | USA Scientific | 1120-9810 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 |
| 培养皿 | Laboratory Product Sales | M089303 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 |
| 乙醇 | Decon Laboratories, INC. | 2701 | http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 |
| 画笔 | 沃尔玛 | 5133 | http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005 |
| 镊子 | Fisher | 08-882 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693 |
| 家用漂白剂（6-8% 次氯酸盐） | 沃尔玛 | 550646751 | http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295 |
| 通用蛋白胨 | Genesee Scientific | 20-260 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260 |
| 酵母提取物 | Fisher Scientific | BP1422-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500 |
| 磷酸氢二钾 | Sigma Aldrich | P3786-1KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All& N=0&mode=match%20partialmax&lang= en®ion=US&focus=product |
| 柠檬酸铵 | Sigma Aldrich | 25102-500g | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N =0&mode=match%20partialmax&lang= en®ion=US&focus=product |
| 乙酸钠 | VWR | 97061-994 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994 |
| 硫酸镁 | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500 |
| 硫酸锰 | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match %20partialmax&lang=en®ion =US&focus=product |
| MRS 粉末 | Sigma Aldrich | 69966-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en®ion=US |
| 96 孔板读板仪 | BioTek (Epoch) | NA | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_ spectrophotometer.html |
| 1.7 ml 离心管 | USA Scientific | 1615-5500 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500 |
| 滤芯吸头，1,000 μl | USA Scientific | 1122-1830 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830 |
| 96 孔板 | Greiner Bio-One | 655101 | https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/ 13243/ |
| 陶瓷珠 | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434 |
| 组织匀浆器 | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500 |
| 一级生物安全柜 | Thermo Scientific | Model 1395 | http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html |
参考文献
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勘误
Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 8/18/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.
Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
to:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).
