斑马鱼肾毒素显微注射建立急性肾损伤模型

摘要

由肾毒性物质（包括从抗生素到化疗药物等多种药物）引起的肾脏损伤可导致复杂的疾病，其发病机制尚未完全阐明。本方案展示了如何利用斑马鱼对这些疾病进行建模，进而用于筛选和鉴定具有肾保护作用的干预措施。

摘要

肾脏易受到其从血液中过滤的化学物质的损害，这可能导致器官损伤，伴随肾功能迅速下降，并引发称为急性肾损伤（AKI）的临床综合征。用于治疗从细菌感染到癌症等多种疾病的药物，无论单独使用或与其他药物联用，均可能诱发AKI。斑马鱼是研究化学物质对肾功能影响的有用动物模型。 体内，因为它们会形成由肾单位功能单元组成的胚胎肾脏，这些结构在包括人类在内的高等脊椎动物中具有保守性。此外，斑马鱼可用于开展遗传学和化学筛选，有助于揭示急性肾损伤（AKI）的细胞与分子机制，并推动治疗策略的开发，例如鉴定具有肾保护作用的分子。本文中，我们展示了如何将显微注射技术应用于斑马鱼胚胎，作为研究肾毒素作用的范式。

引言

急性肾损伤（AKI）是一种肾功能突然丧失的疾病，可能导致严重的健康后果¹。由于其在住院患者中的发病率高达约20%，在重症监护和老年患者中更达到30-50%，且死亡率高达50-70%，AKI已成为全球范围内重要的医疗健康问题^1-3。不幸的是，AKI的患病率正在不断上升，预计在未来十年内将进一步加剧，部分原因在于可诱发AKI的因素多种多样，包括术后应激、缺血以及接触抗生素和化疗药物等肾毒性物质⁴。

急性肾损伤（AKI）涉及肾脏内突然发生的细胞损伤，通常发生在肾单位中，肾单位是肾脏的基本功能单位，由一个血液滤过器和一段分节的肾小管组成，后者将尿液引流至中央集合管¹。当AKI期间大量肾单位受损时，立即产生的效应包括血液循环中废物清除受阻，以及由于死亡和濒死细胞造成的阻塞，导致流经肾单位的液体减少或完全中断¹。随着时间推移，肾小管阻塞可导致整个肾单位退化，从而永久性地降低肾功能¹。AKI后肾脏的生理改变还涉及复杂的炎症反应，可能引发慢性瘢痕形成¹。

尽管存在这些结果，肾单位在急性肾损伤（AKI）后仍具备一定的再生能力，可重建肾小管上皮^5,6。尽管人们对肾单位再生的分子机制的理解日益深入，但在许多方面其机制仍不明确，需要进一步研究⁷。急性....

方案

本方案中所述的斑马鱼胚胎操作程序已获得圣母大学机构动物护理与使用委员会的批准。

1. 溶液的配制

1. 通过混合73.0 g NaCl、3.15 g KCl、9.15 g CaCl₂·2H₂O和4.85 g MgSO₄·7H₂O，用去离子水定容至1 L，配制E3胚胎培养基的50倍浓缩母液₂，以及 9.95 g MgSO₄₄ 在5 L蒸馏水中溶解，并于室温保存。
2. 为培养斑马鱼胚胎，将50倍浓缩的E3胚胎培养基原液用蒸馏水稀释至1倍工作浓度，然后每1 L 1倍E3培养基中加入200 μl 0.05%亚甲蓝以发挥抑菌作用，室温保存。
3. 将40 ml的50倍浓缩E3培养基与0.06 mg 1-苯基-2-硫脲（PTU）混合，配制含0.003% PTU的E3胚胎培养基色素抑制溶液，再用蒸馏水定容至总体积2 L。
4. 在室温下将 E3/PTU 搅拌过夜，使 PTU 粉末充分溶解。随后将 E3/PTU 储存于室温条件下。
   注意：E3/PTU 溶液的有效期约为一周，过期溶液在抑制斑马鱼幼鱼色素发育方面的效果会降低。
5. 将1 g Tricaine加入500 ml蒸馏水中，配制0.2%的Tricaine（MS-222）麻醉溶液，并用1 M Tris（pH 9.5）调节pH至7.2。
6. 准备制备用于成像的2%甲基纤维素溶液：取1x E3溶液（不含亚甲蓝），并加入1/10体积的溶....

结果

显微注射工作站的设置包括体视显微镜、显微操作器和压力调节器图1A）。建议在操作过程中使用透射照明观察注射板上的样本（图1B）。注射针的制备包括拉制合适的硼硅酸盐玻璃毛细管，随后通过切割处理针尖，并最终进行后装填。理想情况下，针尖应为斜面，而非平头。图1C一种在切割过程中通过将切割器械（如精细镊子）的边缘以锐角倾斜而形成的切口 (图1D）。这个斜面边缘非常关键，会极大影响将针头轻柔插入斑马鱼的能力。

注射当天，使用坚固且柔韧的胚胎操作工具对胚胎进行定位（图1E）。进行注射时，应移动胚胎，使其躯干沿注射托盘侧边放置，以便为后续注射步骤提供支点（图1F）。注射过程中，应将观察平面聚焦于胚胎躯干，以看清针头插入的血管目标位置，.......

讨论

多种治疗药物均与急性肾损伤（AKI）相关²⁹。目前在理解许多单一化合物所诱导的肾损伤方面已取得显著研究进展，例如氨基糖苷类抗生素庆大霉素³⁰以及广泛使用的化疗药物顺铂^31,32。然而，这些疾病过程中涉及的一些病理变化仍处于持续研究之中。当前一个新兴的挑战在于理解多种药物如何对患者产生不利影响，尤其是重症监护环境中的患者和老年人等高风险人群²⁹。因此，能够进一步开展基于细胞的药物诱导AKI效应研究的模型，在提高该疾病检出率以及深入认识药物间动态相互作用方面具有重要作用。

利用小鼠和大鼠等哺乳动物模型在建立急性肾损伤（AKI）后肾脏细胞变化的研究中发挥了重要作用，但这些模型存在一个局限性：由于肾脏结构复杂且位于体内深处，难以进行直接的实时观察。简而言之，肾脏无法直接被观察，因此必须通过处死实验个体来分析肾脏。这一限制可通过使用斑马鱼胚胎加以克服，斑马鱼可形成由两个肾单位组成的简单肾脏，其肾单位具有与其他脊椎动物（包括人类）保守的节段结构³³。斑马鱼的发育在体外（ex u.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	American Bioanalytical	AB01915
氯化钾	American Bioanalytical	AB01652
氯化钙	American Bioanalytical	AB00366
N-苯基硫脲（PTU）	Aldrich Chemistry	P7629
乙基-3-氨基苯甲酸酯（Tricaine）	Fluka Analytical	A5040
硼硅酸盐玻璃	Sutter Instruments Co.	BF100-50-10
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪	Sutter Instruments Co.	Mo. P097
UltraPure 琼脂糖	Invitrogen	15510-027
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M7506
亚甲蓝	Sigma-Aldrich	M9140
Falcon 一次性培养皿，无菌，Corning：
60 mm × 15 mm	VWR	25373-085
100 mm × 15 mm	VWR	25373-100
（显微注射托盘）150 mm × 15 mm	VWR	25373-187
低温培养箱	Fischer Scientific	11 690 516DQ
微型解剖镊	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010
千分尺	Ted Pella, Inc.	2280-24