巨噬细胞是造血系统中具有可塑性的细胞，在保护性免疫和内环境稳态中发挥关键作用。在本报告中，我们描述了优化的 体外 在耐受性条件下，用于表型和功能表征移植器官中积聚的移植物浸润性调节性巨噬细胞的技术。
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本文内容
摘要
摘要
移植器官中巨噬细胞的积聚长期以来被认为是同种异体移植物排斥反应的一个特征1免疫原性单核细胞在移植后早期浸润移植物，对移植器官产生移植物反应性应答，并启动器官排斥反应2最新数据表明，抑制性巨噬细胞有助于实现成功的长期移植3 并且是诱导移植耐受所必需的4这表明巨噬细胞的本体发生、活化和功能具有多维特性，因此需要制定新的研究路线图，以分离和分析巨噬细胞功能5由于巨噬细胞具有可塑性，因此有必要根据组织微环境提供一种分离和表征巨噬细胞的方法，并根据不同情境定义其功能。本文描述了一种用于免疫表征移植物浸润性巨噬细胞的实验方案，以及我们用于功能性评估其抑制CD8⁺ T细胞能力的方法+ T细胞增殖并促进CD4+Foxp3+ Treg 扩增 体外.
引言
本方案描述了 体外 研究心脏同种异体移植物中浸润性巨噬细胞功能的技术，依据其调节T细胞反应的能力。文献中广泛描述的荧光细胞示踪染料结合流式细胞术，是研究特定细胞类型抑制功能的强大工具 体外 和 体内 我们的方案采用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）法来监测淋巴细胞增殖 体外.
当用CFSE标记的细胞分裂时，其子代细胞获得的羧基荧光素标记分子数量减半6。通过流式细胞术检测细胞荧光强度相应降低，可用于评估细胞分裂情况，监测具有抑制功能的巨噬细胞对T细胞免疫应答的调节能力。由于CFSE是一种基于荧光素的染料，可与多种其他荧光染料兼容，因此适用于多色流式细胞术分析。在进行表型鉴定时，合理选择荧光染料也至关重要，以避免过大的光谱重叠，导致难以识别抗体阳性细胞，尤其是在使用CFSE等可见光蛋白染料时尤为明显7。
与测量细胞增殖的其他替代技术（如胸苷掺入法，该方法使用放射性标记的胸苷（TdR）8）相比，荧光染料具有多种优势。胸苷掺入法利用氚标记的胸苷（3H-TdR），在有丝分裂过程中将其掺入染色体DNA的新链中。该方法的一个安全问题是涉及放射性同位素的使用，因为需要使用闪烁计数仪检测从细胞中提取的DNA的放射性，以确定细胞分裂的程度。在方法学上，氚标记胸苷掺入法灵活性不足，难以满足临床实验室的一些重要限制条件，例如细胞数量较少或染色后延迟分析等。相反，CFSE染色已被证明会抑制细胞增殖，并干扰关键的活化标志物（如CD69、HLA-DR和CD25）9。因此，在多色实验中（需使用多种染料追踪不同类型的细胞），了解每种方法的优势与局限性对于获得准确且可重复的结果至关重要。
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方案
本研究中，小鼠的饲养遵循美国农业部指南以及《公共卫生服务实验动物护理与使用指南》的建议。所有涉及动物使用的实验技术均按照西奈山医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
1. 培养基制备
- 使用 2 mM L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM 非必需氨基酸、5 mM HEPES 和 0.05 mM 2-巯基乙醇，配制含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素（10,000 U/mL）的完全 RPMI 1640 培养基。
2. 异体移植物分离与单细胞悬液制备
注意：肺动脉和下腔静脉的移植与吻合技术最初由 Corry 及其同事描述，可在 Liu & Kang10,11 中查看示意图（图 1A）。
- 在诱导室中使用4-5%异氟烷麻醉移植小鼠，通过颈椎脱位处死小鼠。
- 使用标准剪刀进行腹正中切口，移除腹腔内容物以暴露腹主动脉。
注意：移植的心脏将位于受体腹主动脉的右侧（图1B）。 - 使用精细的尖齿镊子轻轻拉出移植物，并立即放入冰上预冷的RPMI培养基中。
注意：使用手术剪刀分离移植物与主动脉可能会损伤移植物，并导致部分组织残留在受体主动脉上。 - 收集所有移植物后，将其转移至无菌超净台进行组织处理。将移植物置于培养皿中，使用无菌钝头显微手术剪将其剪切成约1 mm的小块。
- 用尖齿镊子将组织块转移至含有5 mL胶原酶A（0.1 mg/mL胶原酶溶于无菌1x PBS）的50 mL离心管中，在37 °C水浴中孵育1小时。
- 加入5 mL RPMI培养基以中和胶原酶活性，并借助1 mL注射器的推杆将悬液通过100 µm细胞筛过滤。
- 在4 °C条件下，以400 × g离心5分钟。
- 将沉淀重悬于1 mL ACK裂解缓冲液中，充分混匀后在4 °C孵育5分钟。
- 加入1 mL RPMI培养基以中和裂解缓冲液，然后在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。
- 将细胞沉淀重悬于200 µL RPMI培养基中，转移至5 mL聚丙烯圆底管。
注意：聚丙烯管表面吸附性较低。此外，将细胞维持在低温（如4 °C）可减少细胞黏附。
3. 使用荧光激活细胞分选法分离移植物浸润性巨噬细胞
- 使用Fc受体阻断单克隆抗体（大鼠抗小鼠CD16/32）阻断髓系细胞上的非特异性结合。每份样本加入1–2 µL，于表面染色前15分钟孵育。
- 使用抗小鼠 CD11b Percp/Cy5.5（终浓度 0.6 µg/µL，溶于 RPMI 培养基）、抗小鼠 CD45 APC/eFluor780（0.6 µg/µL）、抗小鼠 Ly6C APC（2 µg/µL）和抗小鼠 Ly6G Pe/Cy7（2 µg/µL）进行染色。用铝箔包裹管子以避光，防止荧光抗体降解，于 4 °C 冰箱中孵育 45 分钟。
注意：对于单染补偿，需准备一个阴性对照管（不加染料）以及分别用每种荧光染料单独标记细胞的管。为帮助设定门控，可使用同型对照，尤其是针对 Ly6C（IgG2a）和 Ly6G（IgG2b）。 - 用 RPMI 培养基洗涤细胞两次，于 4 °C 以 400 × g 离心 5 分钟。使用台盼蓝和血细胞计数板对细胞进行计数，并将每 1 × 10⁶ 个细胞重悬于 1 mL RPMI 培养基中。6 细胞。分选前，将样品通过5 mL、70 µm细胞滤筛管帽过滤。加入DAPI（1 µg/mL）作为细胞活力标记，随后进行分选。
- 由于巨噬细胞是敏感且脆弱的细胞，分选时应设置压力为20 psi，使用100 µm喷嘴，并采用四路纯度模式以分离巨噬细胞。
- 在5 mL聚丙烯管中加入1 mL RPMI培养基，准备收集管。
- 使用分选仪软件打开新实验，选择带有空白面板的空白实验以定义设置。
- 设置一个点图，显示前向散射光（FSC）与与侧向散射（SSC），并对所有白细胞设门，排除前向散射和侧向散射最低的碎片和细胞团块。在此父门基础上，创建一个新的点图，显示SSC 与 DAPI染色并圈选DAPI阳性细胞。
- 在这一新设门控的细胞群上，创建一个显示 CD11b 的散点图 与 CD45 及双阳性（CD11b+ CD45+巨噬细胞和中性粒细胞。
- 由此创建最终的点图，显示 Ly6C 与 Ly6G 和门控目标细胞群：Ly6C你好 Ly6G-, Ly6CloLy6G-，以及 Ly6C整数Ly6G+ (图2).
- 分选后，检查纯度和细胞活力（>90%）后，在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。使用台盼蓝和血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞重悬至所需浓度（例如， 1 × 106 巨噬细胞/mL）于完全RPMI培养基中。
- 50 x 10 培养板3 每孔加入巨噬细胞，置于96孔圆底培养板中，每孔终体积为100 µL完全RPMI培养基。37 °C、5% CO₂条件下静置培养至少24 h。2.
4. 使用荧光激活细胞分选法分离T细胞
注意：C57BL/6-Foxp3tm1Flv/Jn 是一种X连锁的靶向敲入小鼠品系，可利用单体红色荧光蛋白（mRFP）共标记表达 Foxp3（forkhead box P3）基因的细胞。
- 按照步骤2.1所述方法麻醉并处死C57BL/6和C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J（H-2b）小鼠。取出脾脏和淋巴结（LN：腹股沟、腰部、腋窝、臂部和颈部），并迅速置于冰上预冷的RPMI培养基中。
- 为分离淋巴结，将小鼠仰卧放置，从下至上沿中线切开皮肤，小心切开腹膜并轻轻分开皮肤。收集所有腹股沟、腰部、腋窝、臂部和颈部淋巴结（图1C，以红色标示）后，剪开腹膜，在肠道左上方取出脾脏。
- 使用置于50 mL离心管上的100 µm细胞筛对脾脏和淋巴结组织进行机械分散。用1 mL注射器的推杆轻轻按压组织，并用RPMI培养基冲洗细胞筛，直至筛网清洁。
注意：每只小鼠的淋巴结和脾脏组织可合并至同一离心管中。 - 在4 °C条件下，以400 × g离心5分钟。
- 将沉淀重悬于2 mL ACK裂解缓冲液中，充分混匀，并在4 °C孵育5分钟。
- 加入2 mL RPMI培养基以中和裂解缓冲液，在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。
- 将细胞沉淀重悬于200 µL RPMI培养基中，并转移至5 mL聚苯乙烯圆底流式管中。
- 使用抗小鼠CD4 APC抗体（0.6 µg/µL）和/或抗小鼠CD8 PeCy7抗体（2 µg/µL）进行染色。用铝箔包裹流式管以避光，于4 °C冰箱中避光孵育45分钟。
注意：为进行单染色补偿，需准备阴性对照管（不加染料）以及分别单独标记每种荧光染料的细胞管。 - 用RPMI培养基洗涤细胞两次，在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。使用台盼蓝和血细胞计数板对细胞进行计数。
注意：CFSE染料通常以50 µg的羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯粉末形式提供。向CFSE小瓶中加入18 µL DMSO，配制成5 mM的储存液，可于-20 °C保存数月。 - 进行CFSE标记时，将CD8染色后的细胞以最高106个细胞/mL的浓度重悬于PBS中，并从储存液中加入CFSE至终工作浓度为5 µM。如前所述6，在20 °C水浴中孵育5分钟。
注意：（关键步骤）对于低浓度细胞（≤106个/mL），必须在添加蛋白质的条件下进行标记，以缓冲CFSE的细胞毒性作用。因此，PBS中可含5% FBS。需注意，若使用培养基，其中的游离氨基酸可能与CFSE竞争，从而降低标记效率。 - 加入2 mL RPMI培养基以中和CFSE，在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。每1 × 106个CD8 T细胞加入1 mL RPMI培养基。
- 分选前，将样品通过置于5 mL流式管盖上的70 µm细胞筛。加入50 µL 1x DAPI（1 µg/mL）作为细胞活力标记物，随后进行分选。
注意：1x表示试剂与其他组分按1:1比例混合。 - 设置分选条件为20 psi压力和100 µm喷嘴，以分离CD8+CFSE+双阳性T细胞（图3A）。
- 在5 mL聚丙烯管中预先加入1 mL RPMI培养基作为收集管，开始分选。
- 在分选仪软件中新建实验，选择空白实验模板和空白面板以设定参数。
- 对于CD4+ T细胞的分离，设置FSC与SSC的散点图，并圈选淋巴细胞门，排除碎片及树突状细胞等大颗粒细胞。
- 在此父代门内，新建SSC与DAPI的散点图，并圈选DAPI阴性细胞。
- 在新圈选的细胞群中，建立SSC与CD4的散点图，以分离所有CD4+细胞（图3B）。也可使用抗CD3单克隆抗体，以确保获得纯度较高的T细胞群体。
注意：所有CD4+ T细胞中应有少量比例（5–10%）为Foxp3+mRFP+细胞。
- 分选完成后，检测细胞纯度和活力（>90%），并在4 °C条件下以400 × g离心收集管5分钟。使用台盼蓝和血细胞计数板计数细胞，按每2×106个T细胞加入1 mL完全RPMI培养基进行重悬。
- 通过将T细胞与先前分选的巨噬细胞共培养，建立抑制实验。在同一孔中接种10 × 104个CD4+ T细胞和10 × 104个CD8+CFSE+ T细胞，终体积为100 µL完全RPMI培养基。在37 °C、5% CO2条件下孵育96小时。
注意：巨噬细胞与T细胞的共培养比例为1:4。 - 为刺激T细胞增殖，使用前需将T细胞激活磁珠（CD3/CD28）用2 mL PBS洗涤，以去除含叠氮化钠的缓冲液。每孔加入5 µL小鼠T细胞激活磁珠（CD3/CD28）。
注意：磁珠大小与抗原呈递细胞相似，偶联有抗CD3和抗CD28单克隆抗体，可简便地实现T细胞的激活与扩增。
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结果
代表性结果展示了上述方案中描述的设门策略。结果还显示了T细胞与移植物浸润性巨噬细胞共培养后的增殖活性分析。体外巨噬细胞亚群的抑制能力在图4中进行了分析。结果表明，来自耐受受体的Ly6CloLy6G-巨噬细胞具有抑制功能。结果还显示，Ly6CintLy6G+细胞表现出较弱的抑制能力。只有Ly6CloLy6G-细胞能够在体外促进CD4+Foxp3+调节性T细胞（Treg）的扩增。综上所述，这些数据支持以下结论：移植物浸润的CD11b+Ly6CloLy6G-巨噬细胞具有许多已被报道与单核细胞来源的抑制性细胞相关的特性12，包括其抑制CD8 T细胞增殖的能力13以及促进CD4
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讨论
本方案描述了我们在小鼠心脏移植实验模型中用于免疫表征移植物浸润性髓系细胞亚群的方法，该方法也可适用于其他小鼠实验模型中的不同组织。我们优先采用20 psi低压细胞分选方法，以获得较高产量的纯细胞亚群。保持各髓系细胞亚群的纯度，对于明确不同髓系细胞群体之间抑制能力的结论至关重要。然而，也可使用其他方法分离各类白细胞群体，例如 commercially enrichment kits（商品化富集试剂盒）。无论目标细胞群体为何，均需从移植组织中获得 viable 单细胞悬液，以确保表面染色和流式细胞术结果的最佳效果。不正确的组织处理可能导致细胞丢失，从而造成髓系细胞亚群产量降低。为提高产量，务必使用预冷缓冲液处理样本，并将细胞置于低细胞黏附性容器（如聚丙烯管）中保存。在本方案中，我们使用了来自 C. histolyticum 的胶原酶A，该酶广泛用于多种组织的解离（例如：肺、心脏、肌肉、骨骼、脂肪、肝脏、肾脏、软骨、乳腺、胎盘、血管、脑组织及肿瘤）。为防止分选过程中细胞丢失，强烈建议优化抗体组合并建立高效的设门策略。在本方案中，我们采用CD11b-Percp/Cy5.5、CD45-APC/eFluor780...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢西奈山研究卓越中心的流式细胞术、显微外科以及生物样本库/病理学中心提供的技术贡献。本工作得到COST行动BM1305“聚焦与加速耐受性细胞治疗行动”（A FACTT）、西奈山雷卡纳蒂/米勒移植研究所发展基金、西班牙科学与创新部项目SAF2013-48834-R和SAF2016-80031-R（J.O.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 培养基 | Life Technologies | 11875119 | |
| 10% FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1,000倍稀释的2-巯基乙醇 | Life Technologies | 21985023 | |
| 100倍青霉素-链霉素溶液 | Life Technologies | 15140122 | |
| 100x L-谷氨酰胺 | Life Technologies | 25030081 | |
| 100倍非必需氨基酸 | 康宁 | 25025039 | |
| 1 M HEPES缓冲液 | 康宁 | 25060CL | |
| 100 mM 丙酮酸钠 | 赛默飞世尔科技 | SH30239.01 | |
| 青霉素/链霉亲和素 | 赛默飞世尔科技 | 15140122 | |
| 胶原酶A | 罗氏 | 70381322 | |
| DPBS（不含钙）&镁 | 康宁 | 21031CV | |
| 70 µm 细胞滤筛 | Fisher | 22363548 | |
| ACK裂解缓冲液 | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads 小鼠 T 细胞激活剂 CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 孔 U型底板 | 康宁 | 353077 | |
| 抗体： | |||
| 抗Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| 抗-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| 抗CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| 抗-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| 抗CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| 抗-CD8-P/Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII 流式细胞仪 | BD生物科学 | ||
| FACSDiva 软件 | BD生物科学 | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | 杰克逊实验室 | 008374 | |
| C57BL/6 | 杰克逊实验室 | 000664 | |
| Balb/c | 杰克逊实验室 | 000651 |
参考文献
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