功能鉴定抑制移植物反应性免疫的调节性巨噬细胞

摘要

巨噬细胞是造血系统中具有可塑性的细胞，在保护性免疫和内环境稳态中发挥关键作用。在本报告中，我们描述了优化的 体外 在耐受性条件下，用于表型和功能表征移植器官中积聚的移植物浸润性调节性巨噬细胞的技术。

摘要

移植器官中巨噬细胞的积聚长期以来被认为是同种异体移植物排斥反应的一个特征¹免疫原性单核细胞在移植后早期浸润移植物，对移植器官产生移植物反应性应答，并启动器官排斥反应²最新数据表明，抑制性巨噬细胞有助于实现成功的长期移植³ 并且是诱导移植耐受所必需的⁴这表明巨噬细胞的本体发生、活化和功能具有多维特性，因此需要制定新的研究路线图，以分离和分析巨噬细胞功能⁵由于巨噬细胞具有可塑性，因此有必要根据组织微环境提供一种分离和表征巨噬细胞的方法，并根据不同情境定义其功能。本文描述了一种用于免疫表征移植物浸润性巨噬细胞的实验方案，以及我们用于功能性评估其抑制CD8⁺ T细胞能力的方法⁺ T细胞增殖并促进CD4⁺Foxp3⁺ Treg 扩增 体外.

引言

本方案描述了 体外 研究心脏同种异体移植物中浸润性巨噬细胞功能的技术，依据其调节T细胞反应的能力。文献中广泛描述的荧光细胞示踪染料结合流式细胞术，是研究特定细胞类型抑制功能的强大工具 体外 和 体内 我们的方案采用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）法来监测淋巴细胞增殖 体外.

当用CFSE标记的细胞分裂时，其子代细胞获得的羧基荧光素标记分子数量减半⁶。通过流式细胞术检测细胞荧光强度相应降低，可用于评估细胞分裂情况，监测具有抑制功能的巨噬细胞对T细胞免疫应答的调节能力。由于CFSE是一种基于荧光素的染料，可与多种其他荧光染料兼容，因此适用于多色流式细胞术分析。在进行表型鉴定时，合理选择荧光染料也至关重要，以避免过大的光谱重叠，导致难以识别抗体阳性细胞，尤其是在使用CFSE等可见光蛋白染料时尤为明显⁷。

与测量细胞增殖的其他替代技术（如胸苷掺入法，该方法使用放射性标记的胸苷（TdR）⁸）相比，荧光染料具有多种优势。胸苷掺入法利用氚标记的胸苷（³H-TdR），在有丝分裂过程中将其掺入染色体DNA的新链中。该方法的一个安全问题是涉及放射性同位素的使用，因为需要使用闪烁计数仪检测从细胞中提取的DN....

方案

本研究中，小鼠的饲养遵循美国农业部指南以及《公共卫生服务实验动物护理与使用指南》的建议。所有涉及动物使用的实验技术均按照西奈山医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。

1. 培养基制备

1. 使用 2 mM L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM 非必需氨基酸、5 mM HEPES 和 0.05 mM 2-巯基乙醇，配制含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素（10,000 U/mL）的完全 RPMI 1640 培养基。

2. 异体移植物分离与单细胞悬液制备

注意：肺动脉和下腔静脉的移植与吻合技术最初由 Corry 及其同事描述，可在 Liu & Kang^10,11 中查看示意图（图 1A）。

1. 在诱导室中使用4-5%异氟烷麻醉移植小鼠，通过颈椎脱位处死小鼠。
2. 使用标准剪刀进行腹正中切口，移除腹腔内容物以暴露腹主动脉。
   注意：移植的心脏将位于受体腹主动脉的右侧（图1B）。
3. 使用精细的尖齿镊子轻轻拉出移植物，并立即放入冰上预冷的RPMI培养基中。
   注意：使用....

结果

代表性结果展示了上述方案中所述的门控策略。结果还显示了T细胞与移植物浸润性巨噬细胞共培养后增殖活性的分析。 体外 巨噬细胞亚群的抑制能力进行了分析 图 4. 结果表明，Ly6C^loLy6G^- 来自耐受受体的巨噬细胞具有抑制性。结果还表明 Ly6C^intLy6G⁺ 细胞表现出适度的抑制能力。仅 Ly6C^loLy6G^- 细胞促进了CD4的扩增⁺Foxp3⁺ 调节性T细胞 体外综合来看，这些数据支持以下结论：移植物浸润性CD11b⁺Ly6C^loLy6G^- 巨噬细胞具有许多已报道与单核细胞来源的抑制性细胞相关的特性¹²，包括其抑制 CD8 T 细胞增殖的能力¹³ 并促进CD4

讨论

本方案描述了我们在小鼠心脏移植实验模型中用于免疫表征移植物浸润性髓系细胞亚群的方法，该方法也可适用于其他小鼠实验模型中的不同组织。我们优先采用20 psi低压细胞分选方法，以获得较高产量的纯细胞亚群。保持各髓系细胞亚群的纯度，对于明确不同髓系细胞群体之间抑制能力的结论至关重要。然而，也可使用其他方法分离各类白细胞群体，例如 commercially enrichment kits（商品化富集试剂盒）。无论目标细胞群体为何，均需从移植组织中获得 viable 单细胞悬液，以确保表面染色和流式细胞术结果的最佳效果。不正确的组织处理可能导致细胞丢失，从而造成髓系细胞亚群产量降低。为提高产量，务必使用预冷缓冲液处理样本，并将细胞置于低细胞黏附性容器（如聚丙烯管）中保存。在本方案中，我们使用了来自 C. histolyticum 的胶原酶A，该酶广泛用于多种组织的解离（例如：肺、心脏、肌肉、骨骼、脂肪、肝脏、肾脏、软骨、乳腺、胎盘、血管、脑组织及肿瘤）。为防止分选过程中细胞丢失，强烈建议优化抗体组合并建立高效的设门策略。在本方案中，我们采用CD11b-Percp/Cy5.5、CD45-APC/eFluor780.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640 培养基	Life Technologies	11875119
10% FBS	Life Technologies	26140-079
1,000倍稀释的2-巯基乙醇	Life Technologies	21985023
100倍青霉素-链霉素溶液	Life Technologies	15140122
100x L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030081
100倍非必需氨基酸	康宁	25025039
1 M HEPES缓冲液	康宁	25060CL
100 mM 丙酮酸钠	赛默飞世尔科技	SH30239.01
青霉素/链霉亲和素	赛默飞世尔科技	15140122
胶原酶A	罗氏	70381322
DPBS（不含钙）&镁	康宁	21031CV
70 µm 细胞滤筛	Fisher	22363548
ACK裂解缓冲液	Life Technologies	A10492-01
DAPI	Sigma	32670-5mg-F
CFSE-FITC	Invitrogen	C34554
Dynabeads 小鼠 T 细胞激活剂 CD3/CD28	Life Technologies	11452D
96 孔  U型底板	康宁	353077
抗体：
抗Ly6C-APC	eBioscience	175932-80
抗-Ly6G-Pe/Cy7	Biolegend	127617
抗CD11b-Percp/Cy5.5	eBioscience	45011282
抗-CD45-APC/Cy7	eBioscience	47045182
抗CD4-APC	eBioscience	17004181
抗-CD8-P/Cy7	eBioscience	25008181
LSRII 流式细胞仪	BD生物科学
FACSDiva 软件	BD生物科学
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J	杰克逊实验室	008374
C57BL/6	杰克逊实验室	000664
Balb/c	杰克逊实验室	000651