Hormonstörande ämnen (EDC) utgöra en betydande risk för vattenmiljön. Kommunala reningsverk är viktiga bidragsgivare till östrogena potens ytvatten. Den metod som anges i detta dokument medger en bedömning av effektiviteten och lämpligheten rening av avloppsvatten med avseende på EDC borttagning.
Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in a watch list of environmental pollutants under the European Water Framework Directive. Municipal wastewater treatment plants are major contributors to the estrogenic potency of surface waters. Much of the estrogenic potency of wastewater treatment plant (WWTP) effluents can be attributed to the discharge of steroid estrogens including estradiol (E2), EE2 and E1 due to incomplete removal of these substances at the treatment plant. An evaluation of the efficacy of wastewater treatment processes requires the quantitative determination of individual substances most often undertaken using chemical analysis methods. Most frequently used methods include Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GCMS/MS) or Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LCMS/MS) using multiple reaction monitoring (MRM). Although very useful for regulatory purposes, targeted chemical analysis can only provide data on the compounds (and specific metabolites) monitored. Ecotoxicology methods additionally ensure that any by-products produced or unknown estrogenic compounds present are also assessed via measurement of their biological activity. A number of in vitro bioassays including the Yeast Estrogen Screen (YES) are available to measure the estrogenic activity of wastewater samples. Chemical analysis in conjunction with in vivo and in vitro bioassays provides a useful toolbox for assessment of the efficacy and suitability of wastewater treatment processes with respect to estrogenic endocrine disrupting compounds. This paper utilizes a battery of chemical and ecotoxicology tests to assess conventional, advanced and emerging wastewater treatment processes in laboratory and field studies.
Oro över de negativa effekterna av hormonstörande föreningar på djur reproduktiv hälsa har lett Europeiska unionen att placera två östrogena ämnen (estradiol och etinylestradiol) på en "bevakningslista" under ramdirektivet för vatten (WFD). EDC omfattar en mängd olika kemiska klasser, inklusive naturliga och syntetiska steroid östrogener, läkemedel, bekämpningsmedel och industrikemikalier och beståndsdelar i konsumentprodukter med kända skadliga effekter på djurlivet. Vissa av dessa föreningar kan potentiellt påverka människors hälsa 1.
Forskning har visat att avloppsvatten från reningsverk är östrogena att fiska två och som en följd många recipienten är också östrogena för fisk tre. Detta visades först genom nationella undersökningar i Storbritannien som visade ökade vitellogenin koncentrationer (en kvinnlig specifik äggula proteinprekursor 4) i blodet hos vilda manliga fisk och en hög prevalens intersex (utveckla ägg och / eller kvinnliga reproduktiva kanaler i testiklarna hos manliga fisk) i normalt gonochoristic fiskarter 5,6.
Konventionell reningsverk är typiskt en trestegsprocess som består av en preliminär screening följt av primär och sekundär behandling som avlägsnar både upplöst och suspenderat organiskt material. Effekten för avlägsnande av enskilda EDC är beroende av fysikalisk-kemiska egenskaperna hos de ämnen och om effektiviteten i reningsprocessen tillämpas. För många EDC avlägsnas via adsorption och biologisk nedbrytning kan vara betydande men ofullständig. Tertiär behandling, såsom sandfiltrering, kan vara effektivt att öka EDC borttagning 7 medan avancerad behandling med avancerad oxidation (t ex ozon) eller aktivt kol kan vara effektiva för att uppnå nästan fullständig borttagning 7.
Bedömningen av all ny teknik för avloppsvattenrening needs för att bestämma effekten av den föreslagna processen i EDC borttagning. Ett batteri av tester, inklusive riktad kemisk analys tillsammans ekotoxikologi tester med in vivo och in vitro bioanalyser, ger omfattande uppgifter för detta ändamål. Även om mycket användbar för regulatoriska ändamål, kan riktad kemisk analys endast lämna uppgifter om föreningarna (och specifika metaboliter) övervakas. Bioanalyser dessutom låta "upptäckt" av negativa effekter av metaboliter och behandling genererade avloppsvatten omvandling biprodukter som annars skulle oupptäckt 8,9. Detta dokument beskriver användningen av ett batteri av kemiska och ekotoxicitet laboratorieanalyser för att bedöma effekten av ett antal avancerade och framväxande rening av avloppsvatten för att avlägsna den östrogena potens av råolja och renat avloppsvatten och recipienter.
Reningsverk är den huvudsakliga vägen för förorening ytvattnet med EDC. En utvärdering av effekten av borttagande av endokrin aktivitet konventionella, avancerade eller nya behandlingsprocesser kräver användning av en mängd olika kemiska och biologiska analyser. Kemisk analys med användning av icke-riktade och målinriktad analys ger kvalitativa eller kvantitativa data om effekten av avlägsnande av enskilda komponenter och därför tillåter en bedömning göras mot miljökvalitetsnormer eller uppskattad nolleffektkoncentrationer för föreningar eller blandningar av föreningar analyseras.
Generering av omvandlingsprodukter som härrör från ofullständig mineralisering av ämnen efter behandling och närvaron av okända biologiskt aktiva komponenter i avloppsvattnet begränsar användbarheten av kemisk testning enbart. En kombination av in vivo och in vitro bioanalyser i kombination med analytisk kemistry screening ger en användbar verktygslåda för att bestämma effekten av EDC avlägsnas genom nya rening av avloppsvatten. Dessa tester, när genomförts tillsammans traditionella vattenkvalitetsparametrar och andra toxikologiska och mikrobiologiska endpoints möjliggöra en kritisk utvärdering av nuvarande och nya avloppsvattenbehandlingsteknik.
Det är viktigt att notera att jäst baserade östrogen skärmar (t.ex. YES) är inte den enda in vitro analyser för att bestämma östrogen potens av kemikalier och avloppsvatten. Ett antal stabilt transfekterade däggdjurs cellbaserade analyser har utvecklats för, till exempel, ER-CALUX 27 och hERa-HeLa-9903 28 med humana bröstcancerceller eller cervikala tumörceller respektive. JA har jämförts med liknande däggdjurs cellbaserade analyser och har visat sig ha en jämförbar hög reproducerbarhet, sant positiva och sant negativa östrogena identifieringspriser 29, althousch det ibland anses vara något mindre känslig 27. En fördel med jäst baserad reporter analyser är att i laboratorier utan betydande erfarenhet med däggdjurscellkultur kan JA lättare antas, eftersom det kräver mindre stränga bio-kontrollåtgärder och steriltekniker (YES kan utföras på bänken topp vid behov) . De humana cell baserade analyser kräver också CO 2 inkubatorer och luminometrar jämfört med standard inkubator och mikroläsare används i JA. Två jäst baserad östrogen reporter analyser (JA, Saccharomyces cerevisiae och A-JA, blastobotrys adeninivorans) är för närvarande genomgår mellan laboratorier spår för validering av ISO 19040 "Water quality – Fastställande av östrogena potential vatten och avloppsvatten" lyfta industrin intresse för dessa tekniker.
Det finns ett antal begränsningar hos de metoder som beskrivits vilka innefattar den potentiella föroreningenprov under provtagning, prov lagring och analys med östrogena ämnen som härstammar från området eller laboratoriemiljö eller av mänsklig smitta (t.ex. mjukgörare, ytaktiva ämnen, personliga hygienprodukter). Denna typ av förorening i JA-analysen (eller andra cellbaserade reporter analyser) kommer att lyfta bakgrunden och påverka användningen av analysen. Vattenprover eller lösningsmedel som lagras i plastflaskor kan lätt orsaka falsklarm. Falska negativa är också av intresse som både LCMS / MS och JA analysen kräver SPE att koncentrera östrogener till detekterbara nivåer. Matrisen, valet av SPE sorbenten och elueringslösningsmedel kan påverka extraktion effektivitet och vilka typer av föreningar elueras. Använda C18 SPE patroner för extraktion med användning av de förhållanden som beskrivs i detta protokoll kan generera en negativ bias, som mycket polära och basiska föreningar skulle vara dåligt behållas av sorbenten. Dessutom kräver beredning av den eluerade JA eluenten från metan detta protokollol till etanol via indunstning till torrhet funder kväve resulterar i förlust av flyktiga föreningar. Som ett resultat protokollet kan ge skattas östrogena aktivitet av testade prover. Dessa begränsningar är särskilt viktigt när man överväger JA analysen som okända eller oväntade föreningar kan missas, eftersom de inte har utvunnits eller de går förlorade på grund av avdunstning. Dessutom gör LCMS / MS teknik användning av märkta interna standarder för att korrigera för återvinning; detta tillvägagångssätt kan inte användas med JA-analysen.
Betydande begränsningar av in vivo-testning av avloppsvatten innefattar hög kostnad och tid som krävs för bedömning jämfört med in vitro-metoder. För närvarande användningen av fiskembryo tester för att upptäcka östrogena aktivitet är begränsad. Däremot har det skett en viss framgång med att producera östrogen svarar transgen glödande fiskembryon 30, som skulle kunna få framtida tillämpningar. Fathead minnows (som används i denna protocol) är en vanlig försöksdjur och VTG induktion i manliga fisk är en väldokumenterad bio-markör för östrogen exponering och ett kvantifierbart mått på avloppsvatten som östrogeniciteten 22 eller andra östrogena föreningar eller blandningar 31. OECD riktlinjer för hormonstörande kemikalier har validerats med vuxen amerikansk elritsa, japanska medaka och zebrafisk 32,33, med VTG är en känslig biomarkör för östrogen exponering i alla tre arterna. Däremot VTG induktion inte direkt korrelerar med fortplantningsfunktion och därmed de ekologiska konsekvenserna av avloppsvatten exponering, vilket kan ses i allvarligt inter mört 3. Å andra sidan, mört är inte en klassisk "försöksdjur" för ekotoxikologi forskning på grund av sin storlek, lång generationstid (2-3 år att nå könsmognad), reproduktions stil; grupp lekande (avel) sker en gång om året, och det är svårt att identifiera hanar från honor (andra än underlekperioden). Dock har detta normalt gonochoristic arter varit mycket väl studerade i Storbritannien på grund av upptäckten att nedströms östrogena avloppsvattenutsläpp, hanfiskar uppvisade störningar till deras endokrinologi (t.ex. förekomst av kvinnospecifika vitellogenin i blodet) och histopatologi (ovotestes – utveckling av ägg i testiklarna och / eller kvinnliga reproduktiva kanaler) 5,6. Därför, som en framtida tillämpning av dessa protokoll, kan mört (eller liknande arter) vara ett användbart vilda kontrollarter som visar om verkliga förbättringar av avloppsvatten kvalitet (och minskad östrogenicitet) ses i floder som får avancerade behandlade avloppsvatten. De kan också användas i slutet av rörsystem för att övervaka tekniskt förbättrade utsläpp från pilotskaleanläggningar 7. När man överväger vilka arter ska användas i vid bedömningar vivo avlopps finns en avvägning mellan relativt snabba och kontrollerade tester med försöksdjur jämfört medlängre fält baserad, men mer miljö relevant, testning med inhemska arter. En sådan i bedömningar vivo är höga kostnader och bör endast ses som den sista uppsättningen av testerna bedömningar med hjälp av kemisk analys och in vitro-analyser.
Kritiska steg i protokollen omfattar beredning och hantering av prover och glas (dvs flaskor och provtagningsutrustning bör förbehandlas med lämpligt ytaktivt rengöringsmedel) för att undvika kontaminering av prover från miljöföroreningar, inklusive att begränsa kontakten mellan prover med plast och andra material som kan ge falska positiva. Detta är lika viktigt när man utformar och bygga akvarier och fiskexponeringssystem. Helst akvarier (bostadslager och under exponering) bör byggas av material med låg adsorption 32 med minimal föroreningsrisk. Rostfritt stål kan användas för avloppsvatten eller vattenhållande tankar.Medan tankar i en glaskonstruktion är att föredra för akvarier (som detta ger också lätt observation av fisk). Användningen av låga rör eller slang plast bör undvikas 32, PVC 34 och ABS kan användas om "rätt kryddat", det vill säga vänster att laka ut eventuella föroreningar i rinnande utspädning vatten i minst 12 timmar före användning. Medicinsk kisel slang har använts med framgång i vår anläggning för peristaltisk pump leverans av kemikalier och avloppsvatten / späd vatten tankar. Samt med tanke på östrogena förorening i konstruktion och drift av vattensport systemet, är det också viktigt att tänka på kosten för fisk, många proprietyen fisk livsmedel har visat sig vara östrogena för fisk. Därför är det viktigt att testa alla livsmedel för aktivitet (t.ex. i jäst Östrogen Screen Se Beresford et al. 14) innan du använder dem i den här typen av studier.
Felsökningav den kemiska analysen eller JA analysprotokoll som beskrivs förenklas om kvalitetssäkring prover inklusive flera resor, laboratorium och lösningsmedelsämnen analyseras tillsammans positiva kontroller och verkliga prover för att eliminera falskt positiva och falskt negativa resultat. Positiva (t.ex. EE2) och negativa (utspädning endast vatten) kontroll bör också alltid användas i in vivo-analyser för att bekräfta känslighet förväntad biologisk biomarkör eller slutpunkt (dvs VTG eller histopatologi) och tillåta oväntad förorening som skall detekteras ( t.ex. från experimentell uppsättning upp, kost, eller utspädnings vatten). Eventuella ändringar i protokollet ska valideras innan någon studie.
Med striktare reglering av östrogena föreningar kommer ut i miljön via WWTP avloppsvatten är det förutse att effektivare avloppsvattenbehandlingsteknik kommer att behöva utvecklas. Batteriet i tester som beskrivs i detta manuskript komplimangekotoxikologiska och kemiska tester utvärderings tillämpas normalt reningsverket utsläpp av avloppsvatten. Därför framtida tillämpning av denna typ av helhets batteri av tester bör göra det möjligt avloppsvatten teknikutvecklare och anläggningsoperatörer, genomföra de mest ekologiskt säkra konstruktioner överväger de bästa metoderna för att ta bort både specifika reglerade östrogena kemikalier och totala biologiska aktivitet.
The authors have nothing to disclose.
Projects presented in this paper were funded by Severn Trent Water and Brunel University London. The authors would like to thank Alan Henshaw and John Churchley for providing field and laboratory assistance. T.J.C. thanks the Heinz Endowments for support. M.R.M. thanks the Steinbrenner Institute for a Steinbrenner Doctoral Fellowship and Carnegie Mellon University for a Presidential Fellowship.
Wellwash Versa plate washer | Thermo Scientific | 5165010 | |
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax 340PC | |
Incubator | Memmert | INB 400 | 37oC incubation required for carp assay |
Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
Icemaker | Scotsman | AF80 | |
12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
ELISA kits | Biosense Laboratories | V01018401-096 (Fathead minnow) V01003402-096 (Carp) |
|
Microfuge tubes, 0.5ml | Alpha labs | LW2372 | |
Microfuge tubes, 1.5ml | Alpha labs | LW2375 | |
Sulphuric acid, 95-98% | Sigma-Aldrich | 258105 | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Histology | |||
Tissue processor | Leica Biosystems | TP1020 | |
Wax dispenser | Thermo Scientific Raymond Lamb | E66HC | |
Metal embedding mold | Leica Biosystems | Various | |
Hot plate | Thermo Scientific Shandon | 3120063 | |
Cold plate (EG1150 C) | Leica Biosystems | 14038838037 | |
Heated forceps (EG F) | Leica Biosystems | 14038835824 | |
Microtome | Leica Biosystems | RM2235 | |
Paraffin section floatation bath | Electrothermal | MH8517 | |
Slide drying bench | Electrothermal | MH6616 | |
Stainmate automated stainer | Thermo Scientific Shandon | E103/S10L | |
Cassettes, Histosette II, biopsy | Simport | M493 | |
Paraffin wax | Thermo Scientific Raymond Lamb | W1 | |
Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | |
IMS (ethanol mix), IDA99 | Tennants | ID440 | |
Polysine adhesion slides | Thermo Scientific Gerhard Menzel | J2800AMNZ | |
Cover slips, 22x50mm | VWR | 631-0137 | |
Histomount | National Diagnostics | HS-103 | |
Haematoxylin Harris GURR | VWR | 351945S | |
Eosin, 1%, aqueous | Pyramid Inovation | S20007-E | |
Fisherbrand slide boxes | Fisher Scientific | 11701486 | |
Microtome blades, MB35 | Thermo Scientific Shandon | 3050835 | |
Bouin’s solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Yeast screen | |||
Flow cabinet | Labcaire Systems Ltd | SC12R | |
Cooled incubator | LMS Cooled Incubator | 303 | |
Incubator | Memmert | INB 400 | |
Shaker | Grant | PSU-10i | |
Fisherbrand whirlimixer | Fisher Scientific | 13214789 | |
Plate shaker | Heidolph Titramax 100 | 544-11200-00 | |
12-Channel F1 digital multichannel pipette | Thermo Scientific Finnpipette | 4661070 | |
12-channel pipette, electronic | Sartorius | 735441 | |
96-well flat-bottom microplates | MP Biomedicals Thermo Scientific Nunc Sarstedt |
76-232-05 260860 82.1581.001 |
We have found that these multiwell plates all produce low backgrounds |
HPLC grade water | Rathburn | RH1020 | |
Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
Potassium phosphate monobasic anhydrous | Sigma-Aldrich | P-5655 | |
Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A-2939 | |
Potassium hydroxide, pellets | Sigma-Aldrich | P-1767 | |
Magnesium sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | M-2643 | |
Iron (III) sulfate | Sigma-Aldrich | 307718 | |
L-Leucine | Sigma-Aldrich | L-8912 | |
L-Histidine | Sigma-Aldrich | H-6034 | |
Adenine | Sigma-Aldrich | A-2786 | |
L-Argenine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | A-6969 | |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M-5308 | |
L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T-8566 | |
L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I-7403 | |
L-Lysine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | L-8662 | |
L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P-5482 | |
L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G-8415 | |
L-Valine | Sigma-Aldrich | V-0513 | |
L-Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | |
Thiamine, hydrochloride | Sigma-Aldrich | T-1270 | |
Pyridoxine | Sigma-Aldrich | P-5669 | |
D-Pantothenic acid, hemicalcium salt | Sigma-Aldrich | P-5155 | |
Inositol | Sigma-Aldrich | I-5125 | |
d-Biotin | Sigma-Aldrich | B-4639 | |
D-(+)-Glucose anhydrous; mixed anomers | Sigma-Aldrich | G-7021 | |
L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A-4534 | |
L-Threonine | Sigma-Aldrich | T-8441 | |
Copper (II) sulfate, anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1297 | |
Chlorophenolred-b-D galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 10884308001 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G-2025 | |
17 β-Estradiol | Sigma-Aldrich | E-8875 | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Steroids | |||
Acetone | Rathburn | ||
Acetonitrile | Rathburn | ||
Ammonia solution | Rathburn | ||
Ethylacetate | Rathburn | ||
Copper(II) nitrate. | Sigma-Aldrich | ||
Acetone | Rathburn | ||
Dichloromethane | Rathburn | ||
2, 4, 16, 16-d4-17b-estradiol | CDN Isotopes | ||
2, 4, 16, 16-d4-estrone | CDN Isotopes | ||
2, 4, 16, 16-d4-17a-ethynyl oestradiol. | CDN Isotopes | ||
17b-estradiol | Sigma-Aldrich | ||
Estrone | Sigma-Aldrich | ||
17a-ethynyl oestradiol. | Sigma-Aldrich | ||
Hexane | Rathburn | ||
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | ||
Methanol | Sigma-Aldrich | ||
Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | ||
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | ||
Styrene divinyl benzene cartridge (Isolute ENV+) solid phase extraction cartridge (200 mg/6 ml) | Biotage | ||
Isolute aminopropyl solid phase extraction cartridge (500 mg/6 ml) | Biotage | ||
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Fish study | |||
orange-white silicon manifold tubing 0.63 bore pk 6 | watson marlow | 982.0063.000 | |
straight connectors for 0.5/0.8 bore pk 20 | watson marlow | 999.2008.000 | |
pumsil silicon tubing 0.8 bore 15m | watson marlow | 913.A008.016 | |
200 series multi-channel persitaltic pump | watson marlow | 205CA | |
Silicone tubing x15m (dosing tanks) | vwr | SFM1-3250 | |
silicone tubing x 15m (large for inflow/outflow) | vwr | SFM1-5450 | |
2.5L glass winchester pk 4 | Fisher Scienctific | BTF-505-050B | |
magnetic stir bar 51x8mm pk 10 | Fisher Scienctific | FB55595 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) | sigma aldrich | E10521-10G | |
17α-Ethynylestradiol | sigma aldrich | E4876-100MG | |
Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SPE | |||
1/8 inch PTFE tubes 'straws' colour coded pk4 | sigma aldrich | 57276 | |
disposable liners for manifold | sigma aldrich | 57059 | |
filtration tubes without frits 6ml pk 30 | sigma aldrich | 57242 | |
reservior adaptors pk 12 | sigma aldrich | 57020-U | |
stainless steel weight for manifold pk 4 | sigma aldrich | 57278 | |
male luer plug for manifold pk12 | sigma aldrich | 504351 | |
SPE Vacuum Manifold | sigma aldrich | 57265 | |
stop cocks for extraction mainfold (supelco) pk 12 | waters | WAT054806 | |
Sep-Pak Plus C18 cartridge box 50 | waters | WAT020515 | |
Methanol HPLC grade 2.5L | fisher scientific | M/4056/17 | |
7ml glass vials with lids (58x17mm) pk 399 | fisher scientific | TUL-520-031K | |
Absolute ethanol | Hayman Kimia | F200238 | |
vacuum pump e.g. VP Series Vacuum Pump | Camlab | 1136915 |