我们在实验室规模的垂直流通柱中模拟了一个前寒武纪富铁海洋上升流系统。目的是了解O₂、H₂S和Fe²⁺的地球化学剖面如何在类似前寒武纪海洋的条件下相互作用，并影响微生物群落的结构与功能。2 以及随着蓝细菌产生氧气，Fe(II) 发生演变2结果表明，由于光合作用产生的氧气氧化亚铁离子（Fe(II)），形成了化学跃层。2.
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摘要
摘要
一种关于某些前寒武纪条带状铁建造（BIF）沉积的传统观点认为，来自前寒武纪海洋中热液源的二价铁离子 [Fe(II)] 上涌后，被蓝细菌产生的分子氧 [O2] 氧化。在大约24亿年前的大氧化事件（GOE）之前沉积的最古老BIF，可能是在无氧条件下由不产氧光合铁氧化微生物直接氧化Fe(II)而形成的。为了检验不同生物条件下所形成的地球化学和矿物学模式，我们设计了一个长40 cm的垂直贯通式反应柱，用于在实验室尺度上模拟代表古代海洋环境的无氧富Fe(II)海水上涌系统。该圆柱体填充了多孔玻璃珠基质，以稳定地球化学梯度，并可在整个水柱中采集液体样品用于铁含量测定。通过外部的光学传感器非侵入式检测溶解氧。在生物实验中，Fe(II)从底部向上涌流，顶部提供明确的光照梯度，且水体中存在蓝细菌，实验结果清晰地显示出Fe(III)矿物沉淀物的形成以及Fe(II)与O2之间化学跃迁层（chemocline）的发展。该反应柱系统使我们能够在模拟的前寒武纪海洋条件下培养蓝细菌（未来还可培养光合铁氧化微生物），从而检验BIF形成的各类假说。此外，我们推测该反应柱设计还可用于模拟多种化学与物理环境——包括浅海或湖泊沉积环境。
引言
前寒武纪（46亿至5.41亿年前）大气中光合作用产生的氧气（O2）逐渐积累，这一过程可能在约24亿年前发生过被称为"大氧化事件"（GOE）的阶段性跃变，并在新元古代（10亿至5.41亿年前）再次发生，当时大气O2浓度接近现代水平1。蓝细菌是最早能够进行产氧光合作用的生物在进化上的遗留后代2。地球化学证据和模型研究支持浅海沿岸环境曾孕育着活跃的蓝细菌群落，或具有产氧光合作用能力的生物（即产氧光能自养生物），在主要为缺氧状态的大气下方，于表层海洋中形成局部的富氧绿洲3-5。
在整个前寒武纪时期，条带状铁建造（BIFs）从海水中沉积形成，表明亚铁离子（Fe(II)）至少在局部区域是当时海水中重要的地球化学组分。一些规模最大的BIFs属于深海沉积物，形成于大陆架和大陆坡以外的区域。从质量平衡的角度来看，沉积的铁含量无法主要由陆源（即风化作用）提供。因此，大部分铁必须来源于对镁铁质或超镁铁质洋壳的热液蚀变6。对沿海环境以外区域铁沉积速率的估算结果与通过上升流将Fe(II)输送至表层海洋的通量相一致7。为了使铁能够在上升流中被输送，其必须以还原态、可移动的形式存在——即Fe(II)。BIF中保存的铁的平均氧化态为2.48，通常认为BIF中保存的铁是以Fe(III)形式沉积下来的，这是上升流中的Fe(II)被氧化（可能由氧气介导）后形成的。因此，研究大陆坡环境中可能的Fe(II)氧化机制对于理解BIF的形成过程至关重要。此外，对海洋沉积物更精确的地球化学表征表明，在整个前寒武纪时期，富铁缺氧条件（即水体缺氧且含有Fe(II)）在海洋中普遍存在，并不仅限于BIF沉积发生的特定时间和地点9。因此，在地球历史中至少长达二十亿年的时间里，浅海中Fe(II)与O2之间的氧化还原界面很可能是常见的现象。
许多研究利用现代环境中作为前寒武纪海洋不同特征的化学和/或生物类似物的地点。一个很好的例子是富铁湖泊，其中亚铁离子（Fe(II)）在阳光照射的表层水中保持稳定并大量存在，同时已检测到光合作用活性（包括由蓝细菌介导的光合作用）10-13。这些研究的结果有助于深入了解从含氧到缺氧/富铁化学跃层的地球化学和微生物特征。然而，这些地点通常存在明显的物理分层，垂直混合较弱14，不同于上升流系统中出现的化学界面，而后者被认为在前寒武纪时期支持了最多的氧气生成4。
在现代地球上，尚无合适的天然类似物可用于研究在无氧大气下、富Fe(II)上升流系统及阳光照射的表层海水柱中海洋氧化态绿洲的形成过程。因此，需要建立一种能够模拟富铁上升流区域并支持蓝细菌和光合作用铁氧化微生物生长的实验室系统。深入理解并识别微生物过程及其与代表前寒武纪海水的上升流水体之间的相互作用，有助于增进认识，并可补充从岩石记录中获得的信息，从而全面理解早期地球独特的生物地球化学过程。
为此目的，设计了一个实验室规模的柱状反应器，将富含 Fe(II) 的海水培养基（中性 pH）从柱底部泵入，并从顶部泵出。在顶部提供光照，以形成约 4 cm 宽的 "透光层" 支持了蓝细菌在顶部3厘米范围内的生长。自然环境通常由物理化学梯度（如盐度或温度）形成分层并保持稳定。为了在实验室尺度上稳定水体柱，柱状容器中填充了多孔玻璃珠基质，有助于维持实验过程中形成的地球化学格局。持续的氮2/CO2 向柱顶空间通入气体流以吹洗，从而维持一个缺氧环境，模拟大氧化事件（GOE）前的海洋状态15在建立稳定的Fe(II)通量后，将蓝细菌接种至整个柱体中，并通过取样口采集样品进行细胞计数以监测其生长情况。同时监测氧气水平。 原位 通过将氧敏感光学传感器薄膜放置在柱体内部壁面上，并从柱体外部使用光纤进行测量。通过从按深度分布的水平取样口取出样品，并采用菲罗嗪（Ferrozine）法分析，以定量水相中铁的形态。非生物对照实验及其结果验证了该方法的概念可行性——即在与大气隔离的条件下，构建一个实验室尺度的古代水柱模拟系统是可行的。实验中，蓝细菌生长并产氧，且Fe(II)与氧气之间的反应过程可被清晰分辨。本文介绍了此类反应柱的设计、制备、组装、运行及取样方法，并展示了接种海洋蓝细菌后连续运行84小时的实验结果。 集胞藻属 sp. PCC 7002
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方案
1. 培养基的制备
注意：培养基制备所需的仪器、化学品和耗材信息列于表1中。括号中的斜体字母数字代码对应表2中列出并在图1中展示的仪器。
- 配制5 L海洋光合生物培养基（Marine Phototroph medium，以下简称MP培养基） "培养基"）按照吴的方案进行 等16. 使用无氧且无菌的 1 M HCl 或 0.5 M NaCO 调节 pH 至 6.83. 作为Fe(II)的来源，加入3.5 ml无氧且无菌的1 M FeCl₂溶液2-溶液，以确保在下一步过滤培养基溶液后，Fe(II) 的终浓度为 500 µM。
- 将培养基溶液在 5 °C 下储存 48 小时，以沉淀 Fe(II) 碳酸盐和磷酸盐矿物。由于 Fe(II) 的添加及铁矿物的沉淀会导致 pH 变化，因此需将 pH 重新调节至 6.8。在无氧（100% N₂）条件下过滤培养基2) 手套箱中，通过0.22 µm滤器过滤。将过滤后的培养基分装至无菌的5 L玻璃瓶中（E.'1在手套箱内进行操作，并用无菌丁基橡胶塞密封。
- 用 N₂ 冲洗培养基瓶的顶空部分2/CO2（v/v，90/10），通过将一根连接气体管路的一次性针头插入胶塞，另一根针头作为通气口。确保置换顶空体积10次。例如，在10 ml/sec的恒定气体流速下，至少吹洗50 ml顶空体积50秒（参见Hungate） & 麦西17).
- 盖上培养基瓶E）现已准备好使用，用铝箔包裹并在避光条件下室温保存，以防止 Fe(II) 光氧化。培养基制备需时 3 天。
2. 培养物的制备
注意：柱实验中使用的集胞藻属（Synechococcus sp. PCC 7002）培养物被描述为单细胞海洋光异养型蓝细菌属18。该菌株由德国杜塞尔多夫大学植物生物化学研究所M. Eisenhut博士提供。本研究中，将原始培养物在无氧MP培养基中培养，且未额外添加Fe(II)。
- 按照吴氏方案配制 100 ml MP 培养基 等16 但用6 mg/ml的柠檬酸铁铵溶液替代氯化铁，添加量为1 ml/L。
- 在无氧条件（手套箱，100% N₂）下2），将培养基分装至一个120 ml无菌血清瓶中，用无菌丁基橡胶塞密封，并用铝盖压紧。将顶空气体置换为N2/CO2（体积比，90/10）（参见 Hungate） & 麦西17）并接种5%的保存菌种。随后将培养物置于25 °C、来自钨丝灯泡的600 Lux光照条件下培养箱中保存。
- 由于 集胞藻属 sp. PCC 7002 具有光敏感性，转移后需在光照培养箱内用薄纸巾覆盖血清瓶前 24 小时。培养物培养 6–8 天。光合作用活性将导致 Fe(II) 氧化，且在细胞生长的时间尺度内 Fe(II) 不会保持稳定，因此应在 7 天后转接培养物，以维持培养基中 Fe(II) 的浓度并使细胞保持对 Fe(II) 的适应状态。
- 通过取样进行光密度（OD）测量来监测细胞密度：在750 nm波长下，利用分光光度计测定细胞悬浮液样品的吸光度，从而确定培养物的细胞密度（cells/ml）。19OD 之间存在线性关系750 对处于对数生长期的培养物进行直接显微镜细胞计数，可确定其绝对细胞密度20.
- 细胞密度达到时 ̴108当达到指定细胞浓度（cells/ml）时，用铝箔包裹血清瓶，以阻止光合作用产生的氧气。
- 移除 O2 使用连接至一次性长针头（100 mm）的0.22 µm无菌注射器滤器，对液体培养基中的细胞悬液进行过滤。用N₂冲洗培养容器顶空并通入气泡以饱和培养物2/CO2 5 分钟（参见 Hungate） & 麦西17将样品避光保存，直至接种到柱中。
3. 实验装置所需物品及各个部件的准备
注意：实验装置所需的设备、数量和规格详见表2。 用于实验装置的部分物品已预先准备，并以单个大写字母（A-G）进行独立标记，列于表2中，同时在图1中以放大图示展示。 实验步骤中括号内的斜体字母数字代码对应表2中所列设备，并在图1中予以标示。
- 为了准备采样口 (D) 对于色谱柱，使用贴合紧密的丁基橡胶塞关闭端口（A.3）。插入一根不锈钢针（D.将针尖插入丁基橡胶塞中，确保针尖位于柱子的中心位置。
- 将针头连接到橡胶管上（D.2）并使用热缩管密封连接处（D.3). 将管子的另一端连接到小型鲁尔锁管接头（D.5），使用热缩管密封连接处（D.3）并用合适的塑料盖盖住管路连接头（D.6).
注意：根据所需的采样口数量，需设置一个主端口并连接多个采样口——因此插入不锈钢针头（D.1以倾斜角度插入丁基橡胶塞中。
- 将针头连接到橡胶管上（D.2）并使用热缩管密封连接处（D.3). 将管子的另一端连接到小型鲁尔锁管接头（D.5），使用热缩管密封连接处（D.3）并用合适的塑料盖盖住管路连接头（D.6).
- 为了将培养基瓶和废液瓶连接到层析柱，请按照以下步骤对丁基橡胶塞进行改造：
- 插入两根不锈钢毛细管（E.3；E.4）插入丁基橡胶塞（E.2）。连接合适的橡胶管（E.6) 连接到这些毛细管上，并使用热缩管密封连接处（E.5).
- 添加一个管路连接器（E.7）连接至较长毛细管另一端的管口（E.3）并使用热缩管固定此连接器（E.5).
- 连接一根不锈钢针头（E.11）连接到较短毛细管的另一根管子的自由端 (E.4)，使用热缩管密封连接处（E.5），并将不锈钢针的另一端插入一个较小的丁基橡胶塞中 (E.10).
- 插入两根不锈钢毛细管（G.3) 插入一个大型丁基橡胶塞中 (G.2) 并连接合适的橡胶管（G.4；G.5）。将较短的橡胶管的自由端（G.4）连接至中等放电瓶毛细管（w2）。将较长管子的自由端连接G.5）与一个小型管路连接器（G.6）。重复上述步骤，为第二个排放瓶制备另一个丁基橡胶塞。
- 准备培养基分配面板的塞子（F）通过插入两根不锈钢针（F.3）插入丁基橡胶塞中（F.2）以制备用于色谱柱的两条培养基供给管线。连接一段橡胶管 (F.4）连接到每根针上，并连接一个培养基瓶毛细管（c1分别连接到其中一根橡胶管上。
- 为了准备腺体以连接培养基供应管路（B), 连接一根培养基供给毛细管（c2）连接至一个小管连接器（B.3）与一根橡胶管（B.4）。对另一个中等大小的腺体重复此步骤。
- 使用较长的中等放电毛细管（w1）以准备腺体连接至培养基排出管路，并按照之前的步骤操作（参见（B) 在 图1).
注意：使用不同颜色的胶带标记入口和出口有助于正确组装。
- 使用较长的中等放电毛细管（w1）以准备腺体连接至培养基排出管路，并按照之前的步骤操作（参见（B) 在 图1).
- 组装顶空气体交换面板的各个部件（C）通过插入两根长的鲁尔锁不锈钢针（C.2）插入一根橡胶管（C.1）并确保针头尖端在软管另一端外侧延伸出4 cm。用聚合物胶填充管子（C.8）并让组件干燥至少6小时。
- 用两个鲁尔锁玻璃注射器松散地填充（C.3）与棉签（cotton）C.4).
- 分别准备两个丁基橡胶塞（C.5），其中一个插入了不锈钢针头（C.6）以及另一根不锈钢针头（C.7）。暂勿连接玻璃注射器。
- 准备一支玻璃注射器（E.8）内装棉花（E.9）以备后续使用，需与培养基瓶和气体包配套存放gp).
- 组装10 L气体包所需的设备（gp）通过连接一根橡胶管（gp.1）插入气体包的阀门上。插入一个管路连接器（gp.2将第二个10 L气体包的自由端插入橡胶管的自由端。重复此操作。
4. 层析柱和设备的灭菌
注意：根据材料特性，设备可通过以下三种方法之一进行灭菌：
- 使用干热灭菌法对玻璃器皿进行灭菌（180 °C，4.25 小时）：
- 培养基制备用具（见表 1和第 1.2 节）需单独并提前灭菌。准备 2 个 5 L 玻璃瓶，并用铝箔覆盖瓶口和瓶颈。将 4 支 5 ml 和 5 支 2 ml 玻璃移液管装入耐热容器中，与其他设备一同进行干热灭菌。
- 柱系统组装用具在第二步中灭菌。用铝箔包裹玻璃注射器（C.3; E.8; F.1 — 在第 3 节中制备），并确保已移除相应的丁基橡胶塞。
- 将玻璃珠（A.2）放入玻璃烧杯中，并用铝箔覆盖顶部。同时用铝箔覆盖透明玻璃板（A.4）、4 个大管接头（B.2）和三通接头（G.7），然后对所有物品进行干热灭菌。
- 使用高压蒸汽灭菌法对可高压灭菌的塑料制品和液体进行灭菌（120 °C，10 bar，20 分钟）：
- 第一步，对含培养基的Widdel瓶、NaHCO3缓冲液以及用于5 L玻璃瓶的2个丁基橡胶塞进行高压灭菌。
注意：丁基橡胶塞需先在超纯水中煮沸3次，然后放入玻璃烧杯中加少量水，用铝箔覆盖后进行高压灭菌。湿润的橡胶塞更易于插入玻璃瓶中。 - 第二步，对实验用柱系统组件进行高压灭菌。为准备柱系统在高压灭菌器中的灭菌，需在灭菌前用铝箔包裹顶部开口、培养基供给口、培养基排出口以及顶空通气口。
- 用适当的塑料盖（D.'6）盖住取样口（D.'5），并在高压灭菌前确保已移除夹具（D.4）。
- 将用于培养基瓶和排液瓶的丁基橡胶塞及相应毛细管（E.2; 2 x G.2 — 在第 3 节中制备）、玻璃注射器用的小型橡胶塞（2 x C.5; E.'10'; F.'2 — 在第 3 节中制备）以及连接至培养基供给和排出密封装置的毛细管（s2; w1 — 在第 3.4 节中制备）用铝箔包裹，并在高压灭菌器中对所有设备进行灭菌。
- 灭菌后，将灭菌后的柱系统及设备置于60 °C烘箱中再干燥4小时。
- 第一步，对含培养基的Widdel瓶、NaHCO3缓冲液以及用于5 L玻璃瓶的2个丁基橡胶塞进行高压灭菌。
- 由于泵管（pt）不可高压灭菌，需将其在乙醇（EtOH）溶液（80% EtOH，20% 水）中灭菌。将适量乙醇溶液倒入烧杯中，放入泵管，确保管内完全充满乙醇溶液。浸泡3小时后取出，立即用预先灭菌的铝箔（经干热灭菌）包裹，并在室温下干燥2小时。
5. 柱子和设备的组装
- 将柱子放入（A)置于平坦表面，并使用实验架和夹具固定。确保在无菌条件下操作（例如，在距离本生灯40厘米范围内或在层流罩下）小心移除顶部开口的铝箔，加入灭菌的玻璃珠（A.2).
- 准备表面皿（A.4）以聚合物胶水（Polymers glue）紧密封闭柱子A.5将胶水涂于表面接触柱体内部的区域。轻轻按压表面，使其与柱体顶部紧密贴合，以确保两部分牢固粘接。安装后至少静置6小时使其完全干燥。
注意：可在色谱柱边缘与表面皿之间放置一根无菌的细软金属丝，以便实验结束后轻松取下表面皿。
- 准备表面皿（A.4）以聚合物胶水（Polymers glue）紧密封闭柱子A.5将胶水涂于表面接触柱体内部的区域。轻轻按压表面，使其与柱体顶部紧密贴合，以确保两部分牢固粘接。安装后至少静置6小时使其完全干燥。
- 在无菌条件下，将以下部件连接至层析柱：
- 连接橡胶管（B.1）以及相应的管路连接器（B.2) 连接到培养基供应口和排放口（比较 (B) 在 图1).
- 连接腺体的管路接头（B.3用于培养基的供给与排放（预先配制） 第 3.4 节) 连接到柱上相应的接头（比较（B) 在 图1).
- 连接顶空气体交换面板（比较（C) 在 图1 — 制备于 第3.5节）连接到柱子的顶空排气口，并连接玻璃注射器（C.3）连接至相应的不锈钢针头（C.2）并插入合适的丁基橡胶塞（C.6；C.7 — 制备于 第 3.5.2 节）注入装有棉花的玻璃注射器（C.3).
- 插入放电瓶的丁基橡胶塞（2 个× G.2 — 制备于 第3.2节) 转移至两个无菌的3 L玻璃瓶中（G.1), 并将瓶子的管路连接器连接起来（G.6）连接至三通接头（G.7).
- 连接中等流速排出管接头毛细管的自由端（w1）连接到放电瓶毛细管的游离端（w2）与泵管（pt）。对第二个介质排放管毛细管和第二个排放瓶重复此操作。
- 连接一个中等瓶盖毛细管的游离端（s1）连接到中等供给腺毛细管的游离端（s2）与泵管（葡萄牙对第二个培养基瓶毛细管和第二个培养基供给腺毛细管重复此操作。
- 通过将带有相应毛细管的塞子插入，组装培养基分配板（F.2 — 制备于 第3.3节）注入介质分配面板的玻璃注射器中（F.1).
- 将培养基分配面板连接至培养基瓶的丁基橡胶塞接口（E.7 — 比较 F 在 图1).
- 连接 N2/CO2 气体管路连接至顶空气体交换面板，再连接至鲁尔锁不锈钢针头（见位置（LLF) 在 图1），并用 N 冲洗柱安装和毛细管系统2/CO2 在低压下（< 10 mbar）。保持中瓶毛细管开口端有气体流出（E.3），三通接头（G.7），以及采样口（D.5）。因此，请确保采样口的盖子（D.6略微开启，以通过向外流动的气体维持正压，从而保持无菌条件。
- 彻底冲洗整个装置至少 20 分钟。
注意：此外，可通过使用合适的橡胶管和夹子关闭顶空气体交换面板的脱气针（C.6），以提高对整个装置进行吹扫的效率。
- 彻底冲洗整个装置至少 20 分钟。
- 同时，填充一个10 L的气体袋（gp) 与 N2/CO2（v/v，90/10），在完成10轮灌注和脱气（使用真空泵）整个体积以确保袋子完全无氧后。最后一次充气后，务必关闭气体包的阀门。用第二个气体包重复此操作，但在脱气后立即关闭阀门即，留空）。
注意：N2/CO2 充满气体的气袋将连接至培养基瓶，以补偿因泵送导致培养基减少而增加的顶空体积。N2/CO2 已排空但留有残余气体的气袋，后续将连接至排液瓶，以允许因液体排出量增加而导致顶空体积增大的气体逸出。 - 插入丁基橡胶塞（E.10 — 制备于 第3.2.3节）注入装有棉花的无菌玻璃注射器中（E.8 — 制备于 第3.6节).
- 将装满并封口的培养基瓶（E — 制备于 第1节）放在实验台上的培养基瓶塞旁边（E.2), 并按照以下步骤准备将塞子连接到培养基瓶上：
- 关闭 N2/CO2 毛细管中的气体流动（E.3）通过闭合相应的橡胶管（E.5用软管夹固定。
- 轻轻提起培养基瓶上的丁基橡胶瓶塞，用N₂冲洗顶空部分2/CO2（50 mbar）通过将一支已灭菌、填充棉花的注射器悬挂于培养基瓶的瓶颈处，注射器上装有一根弯曲的长金属针（1 mm × 140 mm）（参见 Hungate） & 麦西17).
- 迅速从培养基瓶上取下丁基橡胶塞，并插入已准备好的丁基橡胶塞（E.2）加入到培养基瓶中（E).
- 更换注射器的长金属针头（此前用于冲洗顶空），换为一次性针头（0.9 mm × 45 mm；广泛可得），插入胶塞以向培养基瓶顶空注入 N2/CO2.
- 确保气体注射器的开口端有轻微的气体流出E.8 — 组装于 第5.10节）连接至培养基瓶的瓶塞。用气体冲洗培养基瓶的顶空部分（E）以及玻璃注射器（E.8至少 4 分钟。
- 同时，拧紧塑料盖（D.6采样口的）D.'5) 并关闭相应的橡胶管D.2）用一个夹子（D.4).
注意：如有必要，打开脱气针（C.6再次打开顶空气体交换面板，以保持针头开口端的气体流出。 - 将装有 N₂ 的 10 L 气袋2/CO2（配制于 第5.9节），置于实验台上。确保管路连接器位于玻璃注射器开口端旁边（E.8连接至培养基瓶。
- 在冲洗培养基瓶的顶空后（E）至少 4 分钟，关闭 N2/CO2 冲洗注射器的气体管路，并迅速将注射针从胶塞中拔出（E.2）。培养基瓶顶空内残余的气压将通过玻璃注射器释放E.8).
- 快速打开气体包的阀门，并轻轻按压袋子以保持氮气持续流出2/CO2 以冲洗气体包的管路和连接器。
- 一旦释放培养基瓶中的正压，立即连接气体包的接头（gp.3）连接至玻璃注射器的相应接头（E.8).
- 连接一个空的10 L气体发生包（gp) 之前已用 N 冲洗 10 次2/CO2 （在第5.9节中制备）至三通接头的自由端口G.7连接到排气瓶。确保气体包的阀门处于关闭状态。
- 降低氮气的压力2/CO2 气体管路（<0.1 mbar）在顶空气体交换面板中（C 在 图1；将LLF置于适当位置）以维持排气针的气体流出C.6).
- 插入泵管（pt）注入泵中（P）并从相应的橡胶管上取下软管夹E.6) 培养基瓶中的E).
- 打开气体包的阀门（gp）连接至排放瓶 (G）以使气体包中的空气在排出瓶被流出液充满时得以释放。
- 启动泵并监测培养基分配面板（参见（F）用培养基填充。当培养基注入时，将装置倒置以排尽面板中残留的气体。气体通过与泵相连的毛细管排出。
- 监测柱体填充培养基的过程，并调节泵至适当的泵送速率0.45 L/天，该速率可换算为10 mM Fe(II)/m的垂直通量2/d，以模拟感兴趣的化学通量。
- 安装光源（L在柱子上端上方2 cm处，并用深色胶带和/或铝箔包裹柱子上部约10 cm的区域，以防止光线从柱子顶部逸出并照射到柱子的下部。用深色织物罩将整个装置完全覆盖，以避免外部光源对柱子的照射。
6. 将细菌接种至色谱柱中
注意：进行非生物对照实验时，跳过此步骤。
- 由于细胞培养物将通过柱体侧面主采样口的丁基橡胶塞直接注入柱内，因此需提前准备好六支带有足够长针头的注射器，以确保能够到达柱体中心位置。
- 使用80%乙醇溶液对柱体上的六个主采样口（A.3）的丁基橡胶塞外部进行灭菌处理。
- 准备好用于接种的血清瓶（按第2节方法制备），并通过灼烧数滴乙醇溶液对丁基橡胶塞进行灭菌。在吸取培养液前，先用无菌N2/CO2冲洗注射器。吸取1 ml厌氧细胞溶液，并通过主采样口的丁基橡胶塞将其注入柱体中心位置（A.3）。
注意：根据细菌生长情况，在迟滞期的最初几天内，可能需要调整泵流速率（甚至暂停泵流），以防止培养物被冲出柱体。
7 . 取样
注意：为了采集柱内形成的化学梯度中的样品，必须先从顶部的采样口开始采样，再采集较深层的采样口，以避免因体积损失而影响结果。确保维持无菌条件（例如， 在距离本生灯40厘米范围内操作或在层流罩下进行工作。
- 接种后24小时采集第一批样品。用于取样的注射器需用无菌的N2/CO2冲洗，以避免将氧气注入取样口（D）。取样前务必先用N2/CO2充满注射器。
- 迅速取下塑料帽（D.6），将取样注射器插入管路连接器（D.5）。注射器与管路连接器之间应保持微小间隙。释放注射器中的气体，用N2/CO2冲洗管路连接器。
- 将注射器牢固连接至管路连接器。取下夹子（D.4），开始采集约1 ml的样品。
- 吸取样品后、拔出注射器前，先装上夹子（D.4）。然后拔出取样注射器，并用相应的塑料帽（D.6）牢固地封闭管路连接器（D.5）。
- 立即重复步骤7.1–7.3，对每个取样口进行取样。
- 每隔24小时采集下一组样品。
注意：若需在不同时间点采集额外样品，首次取样前应先排出少量液体（例如，0.2–0.4 ml），以清除取样管内的残留培养基，确保所取样品能代表柱内实际环境。
8. 分析方法
- 氧气定量：
注意：使用粘附在柱内玻璃壁上的0.5 × 0.5 cm大小的光学氧气传感器和氧敏感荧光箔片（称为optodes，采用硅胶粘合，A.6），可对流经培养基及柱顶空中的氧气浓度进行非侵入性、非破坏性测定。已确保所用氧敏感箔片对铁（Fe）物种不敏感，以获得可靠的读数。- 务必使用适用于柱中所用optodes的校准参数，对计算机软件进行校准。光学氧气传感器配套有专用校准参数，用于与相应的PC控制光纤氧气测定仪配合测量。
- 开始测量时，注意将氧气测定仪的聚合物光纤垂直对准粘附在透明玻璃柱壁内侧的氧敏感箔片。
- 对柱内每一个O2测量点逐一重复测量。
- 水相样品中Fe(II)和总铁的分析：
- 由于Fe(II)在中性pH条件下会迅速被空气中的氧气氧化，因此应立即将液体样品加入1 M HCl溶液中以稳定Fe(II)用于定量。对于最终体积为1 ml的样品，将0.5 ml液体样品与0.5 ml 2 M HCl混合。
- 取一份经1 M HCl稳定的样品，加入盐酸羟胺（10% w/v，溶于1 M HCl）后孵育30分钟，以测定总铁含量。该试剂可将所有Fe(III)还原为Fe(II)，随后可通过Ferrozine法进行定量21。
- 使用微量板读数仪进行Ferrozine测定，在562 nm波长下测量吸光度。确保所用标准品涵盖可检测的Fe(II)和总铁浓度范围。
注意：若液体样品中铁浓度超出标准校准范围，则需用1 M HCl稀释稳定后的样品。 - 通过总铁与Fe(II)浓度之差计算Fe(III)浓度。
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结果
对照实验
非生物对照实验（10天）始终显示低氧浓度（O₂）2 <0.15 mg/L），在整个上升水体中Fe(II)剖面无显著波动。培养基储液器中沉淀物（可能为Fe(III)(氧氢)氧化物）的形成，以及10天内总Fe(II)浓度从500 µM轻微下降至440 µM，表明通过橡胶连接处存在一定程度的氧气扩散例如, E.6；gp.1 在 图 1)22. 在本实验中，可合理达到的最低氧浓度为≤0.15 mg/L，该范围适用于对氧气进行敏感定量检测，且高于0.03 mg/L的检测限。在本文其余部分，低于0.15 mg/L的氧气值均称为“无氧”（anoxic）。
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讨论
前寒武纪海洋中的微生物群落受到其自身活动及当时地球化学条件的调控，或因这些因素而发生改变。在解释条带状铁建造（BIF）成因时，研究人员通常依据BIF的沉积学特征或地球化学特征来推断微生物的存在或活动。 例如，Smith 等23 和约翰逊 等24在具有与古代环境地球化学相似的现代环境中，对现代生物体进行研究也是一种有价值的方法， 例如， Crowe 等11 和 Koeksoy 等14第三种方法是利用经过设计的实验室系统中的生物体，模拟前寒武纪海洋中发生的过程， 例如， Krepski 等25这种方法可用于检验特定假设，并去除现代系统中可能存在但并非前寒武纪海洋组成部分的化学或生物因素。例如， 水生植物和动物）。因此，我们提出一种动态实验室上升流系统的概念验证方法，可在受控的实验室条件下评估（蓝）细菌的活性及其对形成地球化学剖面的影响。该柱状系统可用于检验关于参与条带状铁建...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Mark Nordhoff 协助设计和实施管路连接。Ellen Struve 协助选择并获取所用设备。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 维德尔烧瓶（5 L） | Ochs | 110015 | labor-ochs.de |
| 玻璃瓶（5 L） | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com |
| 玻璃移液管（5 ml） | 51714 | labor-ochs.de | |
| 0.22 µm Steritop 滤器单元（0.22 µm 聚醚砜膜） | Millipore | X337.1 | carlroth.com |
| 铝箔 | |||
| 无菌鲁尔锁紧玻璃注射器，内填棉花 | C681.1 | carlroth.com | |
| 鲁尔锁紧不锈钢针头（150 mm，1.0 mm 内径） | 201015 | labor-ochs.de | |
| NaCl | Sigma | 433209 | sigmaaldrich.com |
| MgSO4 | Sigma | 208094 | sigmaaldrich.com |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | sigmaaldrich.com |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | sigmaaldrich.com |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | sigmaaldrich.com |
| KBr | Sigma | P3691 | sigmaaldrich.com |
| KCl | Sigma | P9541 | sigmaaldrich.com |
| 玻璃量筒 | Y310.1 | carlroth.com | |
| 玻璃棉 | 7377.2 | carlroth.com | |
| 玻璃珠（ø 0.55 - 0.7 mm） | 11079105 | biospec.com | |
| 丁基橡胶塞（ø 1.2 cm） | 271024 | labor-ochs.de | |
| 玻璃培养皿（ø 8.0 cm） | T939.1 | carlroth.com | |
| 聚合物胶水 | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |
| 光学氧传感器膜片（用于氧气分析，见下文） | – 按需提供 – | presens.de | |
| 橡胶管（35 mm，7 mm 内径） | 770350 | labor-ochs.de | |
| 鲁尔锁紧管接头（3.0 mm，鲁尔锁公头 = LLM） | P343.1 | carlroth.com | |
| 鲁尔锁紧管接头（3.0 mm，鲁尔锁母头 = LLF） | P335.1 | carlroth.com | |
| 橡胶管（25 mm，0.72 mm 内径） | 2600185 | newageindustries.com | |
| 橡胶管（50 mm，7 mm 内径） | 770350 | labor-ochs.de | |
| 鲁尔锁紧不锈钢针头（150 mm，1.0 mm 内径） | 201015 | labor-ochs.de | |
| 鲁尔锁紧玻璃注射器（10 ml） | C680.1 | carlroth.com | |
| 松散棉花 | – | ||
| 丁基橡胶塞（ø 1.75 cm） | 271050 | labor-ochs.de | |
| 不锈钢针头（40 mm，1.0 mm 内径） | Sterican | 4665120 | bbraun.de |
| 鲁尔锁紧不锈钢针头（150 mm，1.5 mm 内径） | 201520 | labor-ochs.de | |
| 位置：C.7 处的鲁尔锁母头连接件部分 | |||
| 聚合物胶水 | OTTOSEAL S68 | adchem.de | |
| 不锈钢针头（120 mm，0.7 mm 内径） | Sterican | 4665643 | bbraun.de |
| 橡胶管（40 mm，0.74 mm 内径） | 2600185 | newageindustries.com | |
| 热缩管（35 mm，收缩后内径 3 mm） | 541458 - 62 | conrad.de | |
| 管夹 | STHC-C-500-4 | tekproducts.com | |
| 鲁尔锁紧管接头（1.0 mm，LLF） | P334.1 | carlroth.com | |
| 鲁尔锁紧塑料帽（LLM） | CT69.1 | carlroth.com | |
| 玻璃瓶（5 L） | Rotilabo | Y682.1 | carlroth.com |
| 丁基橡胶塞（适用于 GL45） | 444704 | labor-ochs.de | |
| 不锈钢毛细管（300 mm，0.74 mm 内径） | 56736 | sigmaaldrich.com | |
| 不锈钢毛细管（50 mm，0.74 mm 内径） | 56737 | sigmaaldrich.com | |
| 热缩管（35 mm，收缩后内径 3 mm） | 541458 - 62 | conrad.de | |
| 橡胶管（100 mm，0.74 mm 内径） | 2600185 | newageindustries.com | |
| 鲁尔锁紧管接头（1.0 mm，LLF） | P334.1 | carlroth.com | |
| 鲁尔锁紧玻璃注射器（10 ml） | C680.1 | carlroth.com | |
| 松散棉花 | – | ||
| 丁基橡胶塞（ø 1.75 cm） | 271050 | labor-ochs.de | |
| 不锈钢针头（40 mm，0.8 mm 内径） | Sterican | 4657519 | bbraun.de |
| 鲁尔锁紧玻璃注射器（5 ml） | C679.1 | carlroth.com | |
| 丁基橡胶塞（ø 1.75 mm） | 271050 | labor-ochs.de | |
| 橡胶管（40 mm，0.74 mm 内径） | 2600185 | newageindustries.com | |
| 玻璃瓶（2 L） | Rotilabo | X716.1 | carlroth.com |
| 丁基橡胶塞（适用于 GL45） | 444704 | labor-ochs.de | |
| 不锈钢毛细管（50 mm，0.74 mm 内径） | 56736 | sigmaaldrich.com | |
| 橡胶管（30 mm × 0.74 mm 内径） | 2600185 | newageindustries.com | |
| 橡胶管（100 mm × 0.74 mm 内径） | 2600185 | newageindustries.com | |
| 鲁尔锁紧管接头（1.0 mm，LLF） | P334.1 | carlroth.com | |
| 鲁尔锁紧三通接头（LLF，2×LLM） | 6134 | cadenceinc.com | |
| 光源 | Samsung | SI-P8V151DB1US | samsung.com |
| 蠕动泵 | Ismatec | EW-78017-35 | coleparmer.com |
| 泵用管（0.89 mm 内径） | EW-97628-26 | coleparmer.com | |
| 不锈钢毛细管（200 mm，0.74 mm 内径） | 56736 | sigmaaldrich.com | |
| 不锈钢毛细管（400 mm，0.74 mm 内径） | 56737 | sigmaaldrich.com | |
| Supel-Inert 膜袋（Tedlar - PFC）气体采样袋（10 L） | 30240-U | sigmaaldrich.com | |
| 橡胶管（30 mm，6 mm 内径） | 770300 | labor-ochs.de | |
| 鲁尔锁紧管接头（3.0 mm，LLM） | P343.1 | carlroth.com | |
| 鲁尔锁紧管接头（3.0 mm，LLF） | P335.1 | carlroth.com | |
| 气密注射器（20 ml） | C681.1 | carlroth.com | |
| 本生灯 | – | ||
| 光纤氧测定仪，用于氧气定量 | Presens | TR-FB-10-01 | presens.de |
| 真空泵 | – | ||
| 用于氧光学传感器的硅胶 | Presens | PS1 | presens.de |
参考文献
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- Czaja, A. D., Johnson, C. M., Beard, B. L., Roden, E. E., Li, W. Q., Moorbath, S. Biological Fe oxidation controlled deposition of banded iron formation in the ca. 3770 Ma Isua Supracrustal Belt (West Greenland). Earth. Planet. Sci. Lett. 363 (1), 192-203 (2013).
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