从人心脏组织中分离血管周围多能前体细胞群体

摘要

人类心脏组织中含有多种具有多向分化潜能的血管周围前体细胞群体，这些细胞可能适用于心肌再生。本文所述技术可同时分离和纯化两种与天然血管相关的多能间充质细胞群体， 即 CD146⁺CD34^- 周细胞和CD34⁺CD146^- 来自人心肌的外膜细胞。

摘要

多能间充质干细胞/基质细胞（MSC）传统上通过其贴壁特性从原代组织消化物中分离，但其解剖学组织定位一直不明确。近期，我们课题组及其他研究人员发现，多种组织中的血管周围细胞表达特定的血管周围细胞和MSC细胞标志物，这为前瞻性分离和纯化特定的、均一的多能血管周围前体细胞亚群提供了可能。我们先前已证明，可利用荧光激活细胞分选（FACS）技术从人骨骼肌中纯化出微血管CD146⁺CD34^-周细胞和血管CD34⁺CD146^-外膜细胞。本文中，我们描述了一种基于特定细胞表面标志物表达进行阳性和阴性筛选的FACS方法，用于同时从人心肌组织中分离这两种血管周围细胞亚群。该方法因此可获得两种特定的多能心脏MSC样前体细胞亚群，供基础研究和/或治疗探索使用。

引言

心脏长期以来被认为是一个有丝分裂后器官。然而，近期研究表明，成年人大心肌细胞存在有限的更新现象。¹在成年啮齿类动物和人类心脏的心肌中也已鉴定出具有心肌细胞分化潜能的原位干细胞/祖细胞，包括Sca-1⁺c-kit⁺，心脏球形成细胞，以及最近发现的血管周围前体细胞^2,3这些细胞是通过细胞移植或刺激来增强心脏修复/再生的治疗策略的理想候选者 原位 增殖

间充质干细胞/基质细胞（MSC）已从几乎所有人组织中分离获得^4,5。针对MSC治疗应用的临床试验已在多种病理状况下开展，如心血管修复⁶、移植物抗宿主病⁷和肝硬化⁸。其有益作用归因于MSC具有以下能力：趋向迁移至炎症部位⁹；分化为不同细胞类型¹⁰；分泌促修复分子¹¹；以及调节宿主免疫反应¹²。传统上，MSC的分离依赖于其对塑料基质的优先贴壁特性。然而，由此获得的细胞群体通常具有显著的异质性¹³。通过结合关键血管周围细胞标志物，利用荧光激活细胞分选技术（FACS），我们已能够从包括成人骨骼肌和白色脂肪在内的多种人体组织中分离并纯化出一种多能的MSC样前体细胞群体（CD146⁺/CD31^-/CD3....

方案

1. 人类心脏样本的处理

1. 确保所有液体、容器、器械和专用操作区域均处于无菌状态。
2. 将心脏组织样本（由组织库或手术团队获取）置于储存液中，储存液由含20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）的冷改良杜尔贝科最低必需培养基（DMEM）组成，并在冰上保存以用于运输³。
3. 从储存液中取出心脏样本，用洗涤液冲洗，洗涤液由含2% FBS和1% P/S的磷酸盐缓冲液（PBS）组成。处理样本时，使用尖头镊子夹住大血管或心外膜，尽量减少对心肌的挤压损伤。
4. 将样本浸入培养皿中的洗涤液内，使用无菌虹膜剪刀和尖头镊子去除心外膜、心内膜及大血管，操作如文献所述³。
5. 使用单面剃须刀片或锋利的虹膜剪刀将剩余的心肌组织切成约1 mm³的小块。注意：若能立即处理样本，则可获得最高的细胞得率。若不可避免需要延迟处理，可将处理后的组织置于新鲜储存液中（>每1 cm³组织不少于5 ml），在4 °C下保存最多72小时，但细胞得率可能会有所下降。

2. 组织消化与细胞分离

1. 新鲜配制消化液，包含胶原酶 I、胶原酶 II 和胶原酶 IV 各 1.5 ml（均以 0.5 mg/ml 溶于 DMEM 中），并在水浴中预热至 37 °C。
   注意：胶原酶的体积和浓度适用于....

结果

根据前向散射和侧向散射分布，将单个细胞与碎片及双联体区分开来。活细胞通过其不摄取DAPI染料的特性进行鉴定。门控策略基于对该活细胞全心脏细胞解离样本的同型对照标记结果确定（图1）。在活细胞中，首先排除CD45⁺细胞，随后排除CD56⁺细胞。接着从CD56^-细胞群中去除CD144⁺内皮细胞。在此最终细胞群体中，选择并收集CD146⁺/CD34^-周细胞和CD146^-/CD34⁺外膜细胞（图2）。细胞收集后立即取每种亚群的小量样本（500–1,000个细胞），重新上分选仪检测，以确认细胞分布与初始分选记录一致。经FACS纯化的心肌周细胞和外膜细胞在培养中均呈现纺锤形至星形的细胞形态（图3）。

讨论

越来越多的证据表明，成年 人心脏在损伤后具有有限的再生能力。鉴定并表征损伤心脏中负责此类再生反应的内源性前体细胞，对于理解相关机制和信号通路，以及开发利用这些细胞进行治疗的策略至关重要。

既往方案已描述了从人骨骼肌中分离血管周围前体细胞亚群的方法²⁵。然而，将这些技术直接应用于心脏组织时，往往导致细胞得率极低。因此，我们对方案进行了重大调整，旨在从人心肌活检组织中富集两种不同的血管周围前体细胞亚群，即周细胞和外膜细胞，并实现这两个亚群的同步纯化。从同一样本中同时分离这两种细胞群体，不仅能够最大限度地利用珍贵的心脏组织活检样本，还可实现对不同血管周围细胞亚群的直接比较。

为了获得最大细胞产量，组织样本的新鲜程度至关重要。周细胞和外膜细胞的最大活细胞得率分别约为总活细胞解离数的3%和4%。每种细胞亚群的得率可能差异较大，大约在30,000至400,000个细胞之间，且高度依赖于多种因素，包括起始组织的数量和质量以及保存时间。血管周围细胞相对脆弱，显示自溶变化迹象的样本在流式细胞分选（FACS）后 invari.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AbC 小鼠抗体磁珠试剂盒	Molecular Probes	A-10344
胶原酶 I	Gibco	17100-017	根据需要将粉末重悬并过滤除菌
胶原酶 II	Gibco	17101-015
胶原酶 IV	Gibco	17104-019
抗人 CD34-PE	BD Pharmingen	555822	保持无菌
抗人 CD45-APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	保持无菌
抗人 CD56-PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	保持无菌
抗人 CD144-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	保持无菌
抗人 CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	保持无菌
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	用于细胞收集及贴壁前的培养
DMEM，高糖，含 GlutaMAX，不含丙酮酸钠	ThermoFischer Scientific	10566-016
胎牛血清	ThermoFischer Scientific	10500-064	分装冻存并保持无菌
明胶	Sigma Aldrich	G1393	用无菌水稀释
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	保持无菌
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873	保持无菌
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	557872	保持无菌
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	保持无菌
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	保持无菌
小鼠血清	Sigma Aldrich	M5905	保持无菌
石蜡膜 - Parafilm M	Sigma Aldrich	P7793
青霉素-链霉素	Gibco	15979-063	分装冻存并保持无菌
磷酸盐缓冲液，pH 7.4	ThermoFischer Scientific	10010-023	保持无菌
红细胞裂解缓冲液 Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757	保持无菌
台盼蓝溶液	Sigma Aldrich	T8154
胰蛋白酶-EDTA 0.5% (10倍浓缩液)	Invitrogen	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		荧光激活细胞分选仪