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方法文章

从人心脏组织中分离血管周围多能前体细胞群体

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DOI：

10.3791/54252

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2016年10月8日

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1Centre for Cardiovascular Science, Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh, 2Department of Bioengineering and Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 3Research Laboratory of Electronics and Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 5Stem Cell Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 6Department of Orthopaedic Surgery, University of Texas Health Science Center at Houston, 7Department of Orthopaedic Surgery, UCLA Orthopaedic Hospital, David Geffen School of Medicine, University of California at Los Angeles

本文内容

摘要

人类心脏组织中含有多种具有多向分化潜能的血管周围前体细胞群体，这些细胞可能适用于心肌再生。本文所述技术可同时分离和纯化两种与天然血管相关的多能间充质细胞群体， 即 CD146+CD34- 周细胞和CD34+CD146- 来自人心肌的外膜细胞。

摘要

多能间充质干细胞/基质细胞（MSC）传统上通过其贴壁特性从原代组织消化物中分离，但其解剖学组织定位一直不明确。近期，我们课题组及其他研究人员发现，多种组织中的血管周围细胞表达特定的血管周围细胞和MSC细胞标志物，这为前瞻性分离和纯化特定的、均一的多能血管周围前体细胞亚群提供了可能。我们先前已证明，可利用荧光激活细胞分选（FACS）技术从人骨骼肌中纯化出微血管CD146+CD34-周细胞和血管CD34+CD146-外膜细胞。本文中，我们描述了一种基于特定细胞表面标志物表达进行阳性和阴性筛选的FACS方法，用于同时从人心肌组织中分离这两种血管周围细胞亚群。该方法因此可获得两种特定的多能心脏MSC样前体细胞亚群，供基础研究和/或治疗探索使用。

引言

心脏长期以来被认为是一个有丝分裂后器官。然而，近期研究表明，成年人大心肌细胞存在有限的更新现象。1在成年啮齿类动物和人类心脏的心肌中也已鉴定出具有心肌细胞分化潜能的原位干细胞/祖细胞，包括Sca-1+c-kit+，心脏球形成细胞，以及最近发现的血管周围前体细胞2,3这些细胞是通过细胞移植或刺激来增强心脏修复/再生的治疗策略的理想候选者 原位 增殖

间充质干细胞/基质细胞（MSC）已从几乎所有人组织中分离获得4,5。针对MSC治疗应用的临床试验已在多种病理状况下开展，如心血管修复6、移植物抗宿主病7和肝硬化8。其有益作用归因于MSC具有以下能力：趋向迁移至炎症部位9；分化为不同细胞类型10；分泌促修复分子11；以及调节宿主免疫反应12。传统上，MSC的分离依赖于其对塑料基质的优先贴壁特性。然而，由此获得的细胞群体通常具有显著的异质性13。通过结合关键血管周围细胞标志物，利用荧光激活细胞分选技术（FACS），我们已能够从包括成人骨骼肌和白色脂肪在内的多种人体组织中分离并纯化出一种多能的MSC样前体细胞群体（CD146+/CD31-/CD34-/CD45-/CD56-）14。

多种非心脏组织中的血管周细胞群体已被证实具有干细胞/祖细胞特性，并正在被研究用于心血管疾病的临床应用。周细胞是其中最为人熟知的血管周细胞亚群之一，属于异质性细胞群体，参与多种病理生理过程，包括新血管的形成15、血压调节16以及血管完整性的维持17,18。在多种组织中的研究表明，特定的周细胞亚群在体内天然表达间充质干细胞（MSC）抗原，并在经FACS分选后，于原代培养中维持其MSC样表型14。此外，这些细胞在培养过程中能够稳定保持其长期表型，并表现出多向分化潜能，与MSC相似19,20。这些结果提示，周细胞可能是 elusive MSC 的来源之一14。周细胞的治疗潜力已在心肌缺血损伤后的心脏移植实验中得到证实，表现为心肌瘢痕减少以及心脏功能改善21。近期，我们成功从人心肌组织中分离出周细胞，并证实其具有MSC样表型及多能性（可向脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞分化），但不具备骨骼肌生成能力3。此外，与来自其他器官的对应细胞相比，心肌来源的周细胞表现出差异性的心肌生成潜能和血管生成能力。

另一种多能性血管周围干细胞/祖细胞——外膜细胞，已根据CD34阳性表达从人隐静脉中分离获得22。静脉来源的外膜细胞已被证实具有克隆形成潜能、中胚层分化能力以及体外促血管生成潜能in vitro。将这些细胞移植至缺血性损伤的小鼠心脏后，可减少间质性纤维化，促进血管生成和心肌血流，减轻心室扩张，并提高心脏射血分数23。有趣的是，脂肪组织来源的外膜细胞在培养中经血管生成素II处理后表现出CD34表达下调和CD146表达上调，提示其在刺激下可获得周细胞表型24。然而，在心脏组织中，外膜细胞群体尚未通过FACS进行前瞻性纯化，也未得到充分表征。利用下述各节所述的细胞分离方法，我们目前正在对心肌外膜细胞进行表征，并研究其在再生医学中的应用潜力。

本文介绍一种从人胎儿或成人心肌中分离和纯化两种血管周干细胞/祖细胞亚群的方法。这种前瞻性细胞分离方法将使研究人员能够从人心肌活检样本中获得同基因型的血管周干细胞/祖细胞亚群，用于比较研究，并进一步探索其在多种心脏病理状态下的治疗潜力。

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方案

1. 人类心脏样本的处理

  1. 确保所有液体、容器、器械和专用操作区域均处于无菌状态。
  2. 将心脏组织样本（由组织库或手术团队获取）置于储存液中，储存液由含20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）的冷改良杜尔贝科最低必需培养基（DMEM）组成，并在冰上保存以用于运输3。
  3. 从储存液中取出心脏样本，用洗涤液冲洗，洗涤液由含2% FBS和1% P/S的磷酸盐缓冲液（PBS）组成。处理样本时，使用尖头镊子夹住大血管或心外膜，尽量减少对心肌的挤压损伤。
  4. 将样本浸入培养皿中的洗涤液内，使用无菌虹膜剪刀和尖头镊子去除心外膜、心内膜及大血管，操作如文献所述3。
  5. 使用单面剃须刀片或锋利的虹膜剪刀将剩余的心肌组织切成约1 mm3的小块。注意：若能立即处理样本，则可获得最高的细胞得率。若不可避免需要延迟处理，可将处理后的组织置于新鲜储存液中（>每1 cm3组织不少于5 ml），在4 °C下保存最多72小时，但细胞得率可能会有所下降。

2. 组织消化与细胞分离

  1. 新鲜配制消化液，包含胶原酶 I、胶原酶 II 和胶原酶 IV 各 1.5 ml（均以 0.5 mg/ml 溶于 DMEM 中），并在水浴中预热至 37 °C。
    注意：胶原酶的体积和浓度适用于约 1 cm3 的样品。
  2. 将悬浮的组织块通过 100 µm 滤网过滤，并用 PBS 洗涤两次。将组织块转移至一个带有严密盖子的无菌 30 ml 容器中。
    注意：使用短而宽的容器比高而窄的管子效果更佳。若无 30 ml 容器，可将组织块置于无菌 50 ml 离心管中并水平放置。
  3. 加入全部消化液（共 4.5 ml），将容器放入密封塑料袋中，置于 37 °C、120 rpm 的摇动水浴中。或者，用封口膜密封容器后，置于设定为 120 rpm 的恒温轨道摇床中。
  4. 15 分钟后取出容器并轻轻颠倒三次，再放回继续孵育 15 分钟。随后取出，加入 5 ml 含 20% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素（P/S）的 DMEM 终止胶原酶反应。
  5. 用 10 ml 移液管轻柔吹打消化产物 10 至 20 次，以分散任何组织团块。将细胞悬液依次通过 100 µm、70 µm 和最终 40 µm 的细胞滤网过滤，去除未消化的组织成分，获得单细胞悬液。
    注意：在不同滤网之间不要冲洗，以避免引入酶消化过程中产生的细胞碎片。
  6. 将细胞悬液在 200 × g 下离心 4 分钟，小心弃去上清液，将沉淀重悬于 1 ml 红细胞裂解缓冲液中，室温孵育 2 分钟，然后加入 4 ml 洗涤液稀释。
  7. 重复离心步骤，将沉淀重悬于 1 ml 洗涤液中。充分混匀后取 10 µl 细胞悬液用于细胞计数。
  8. 将 10 µl 细胞悬液与 10 µl 台盼蓝染液混合，取 10 µl 混合液滴加至标准血细胞计数板上进行细胞计数。计数四个角区大方格（每个大方格分为十六个小方格）中明亮、圆形的细胞数量，求其平均值。将平均值乘以 2 以校正染液稀释倍数，再乘以 104，得到每 1 ml 样品中的总细胞数。

3. 细胞标记与分选

  1. 向细胞悬液中加入 50 µl 小鼠血清，在 4 °C 下孵育 20 分钟，以阻断非特异性抗体结合。
  2. 将含小鼠血清的细胞悬液在 200 × g 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，并用洗涤液重悬，调整细胞浓度为每 100 µl 含 1 × 106 个细胞。
  3. 取 50 µl 细胞悬液分别加入两个聚苯乙烯圆底流式细胞仪管中，用于同型对照和未染色对照；将剩余体积加入第三个管中，用于多色染色。
  4. 向单细胞悬液中加入 CD34-PE、CD45-APC-Cy7、CD56-PE-Cy7、CD144-PerCP-Cy5.5 和 CD146-AF647 抗体（均为 1:100 稀释），进行多色染色。对于同型对照，加入等体积的 PE-、APC-Cy7-、PE-Cy7-、PerCP-Cy5.5- 和 AF647-偶联的同型对照抗体。轻轻吹打混匀抗体与细胞，所有管在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
  5. 通过在五个聚苯乙烯圆底流式细胞仪管中各加入一滴阳性补偿微珠至 100 µl 洗涤液中，制备补偿对照微珠。分别向这 5 个管中单独加入 CD34-PE、CD45-APC-Cy7、CD56-PE-Cy7、CD144-PerCP-Cy5.5 和 CD146-AF647 抗体（均为 1:100 稀释）。所有管在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
  6. 在孵育期间，准备细胞收集管，每管加入 500 µl 内皮细胞生长培养基-2（EGM-2）培养液，并置于 4 °C 预冷。
  7. 抗体孵育结束后，向所有管中加入 5 ml 洗涤液，洗涤细胞和微珠以去除未结合的抗体。在 200 × g 条件下离心 4 分钟。重复洗涤和离心步骤一次。弃去上清液时需小心，重悬细胞时应轻柔吹打。
  8. 用洗涤液重悬细胞，浓度约为每 250 µl 含 1 × 106 个细胞；将微珠用 100 µl 洗涤液重悬。
  9. 将所有细胞和微珠悬液置于冰上避光运输至细胞分选仪。向阳性微珠补偿对照管中各加入一滴阴性微珠，用于设定荧光补偿。
  10. 根据制造商说明书运行未染色对照细胞，以确定背景荧光，并将电压设定如下：FSC 150V；SSC 290V；V450/50 350V；V710/50 620V；B530/30 400V；B710/50 530V；YG780/60 460V；R670/30 480V；R780/60 460V。运行同型对照以确定与非特异性结合相关的背景荧光阈值。运行多色染色样本，并将周细胞和外膜细胞群体收集至收集管中（图 1）。
    注意：周细胞的活细胞回收率约为总活细胞解离数的 3%，外膜细胞约为 4%。

4. 细胞培养

  1. 根据FACS分选结果选择合适尺寸的培养板。每平方厘米加入100 µl无菌的0.2%明胶溶液2 生长区域并手动振荡以覆盖整个孔壁。将培养板在4 °C孵育10分钟，随后彻底去除明胶溶液。在准备培养板的同时，将收集的细胞置于冰上保存。
    注意： freshly sorted pericytes 和 adventitial cells 在接种密度为 30,000 至 40,000 个细胞/cm² 时生长良好。2 在明胶包被的培养表面
  2. 将新收集的细胞在200 × g下离心4分钟，并用适量EGM-2轻柔重悬细胞沉淀。将细胞接种至明胶包被的培养板中。
    注意：每孔接种的细胞实际数量及添加的EGM-2体积取决于所选培养板的类型。例如，48孔板和24孔板每孔分别需要添加0.5 ml和1 ml的EGM-2。
  3. 将周细胞和外膜细胞的培养基从EGM-2更换为周血管细胞生长培养基（DMEM添加20% FBS和1% P/S），更换时间点为细胞沉降并贴壁后（至少72小时后）。此后每72小时更换一次培养基。所有初始及后续孵育均在5% CO₂条件下进行。2 37 °C下
  4. 当周细胞和外膜细胞达到80%至90%融合时，使用0.05%胰蛋白酶EDTA消化细胞。用含20%胎牛血清的PBS终止反应，200 × g离心4分钟，用血管周围细胞生长培养基重悬细胞，按1:3比例传代至未包被的聚苯乙烯培养板中。从第2代开始，按1:5比例（或约7,000个细胞/cm²）进行传代。2) 加入未包被的聚苯乙烯培养板或培养瓶中。

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结果

根据前向散射和侧向散射分布，将单个细胞与碎片及双联体区分开来。活细胞因其不摄取DAPI染料而被识别。门控策略的选择基于对该活细胞全心脏细胞悬液的同型对照标记结果（图1）。在活细胞中，首先排除CD45+细胞，随后排除CD56+ 细胞。然后从CD56- 组分中去除CD144+内皮细胞。在此最终细胞群中，选择并收集CD146+/CD34- 周细胞和CD146-/CD34+外膜细胞（图2）。细胞收集后立即对每种亚群取少量样本（500–1,000个细胞）重新上样至分选仪，以确认细胞分布与初次分选记录一致。经FACS纯化的心肌周细胞和外膜细胞在体外培养中均呈现由梭形至星形的细胞形态（图3）。

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讨论

越来越多的证据表明，成年 人心脏在损伤后具有有限的再生能力。鉴定并表征损伤心脏中负责此类再生反应的内源性前体细胞，对于理解相关机制和信号通路，以及开发利用这些细胞进行治疗的策略至关重要。

既往方案已描述了从人骨骼肌中分离血管周围前体细胞亚群的方法25。然而，将这些技术直接应用于心脏组织时，往往导致细胞得率极低。因此，我们对方案进行了重大调整，旨在从人心肌活检组织中富集两种不同的血管周围前体细胞亚群，即周细胞和外膜细胞，并实现这两个亚群的同步纯化。从同一样本中同时分离这两种细胞群体，不仅能够最大限度地利用珍贵的心脏组织活检样本，还可实现对不同血管周围细胞亚群的直接比较。

为了获得最大细胞产量，组织样本的新鲜程度至关重要。周细胞和外膜细胞的最大活细胞得率分别约为总活细胞解离数的3%和4%。每种细胞亚群的得率可能差异较大，大约在30,000至400,000个细胞之间，且高度依赖于多种因素，包括起始组织的数量和质量以及保存时间。血管周围细胞相对脆弱，显示自溶变化迹象的样本在流式细胞分选（FACS）后 invari...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨此感谢爱丁堡大学的 Shonna Johnston、Claire Cryer、Fiona Rossi 和 Will Ramsay，以及匹兹堡大学的 Alison Logar 和 Megan Blanchard 在流式细胞术方面提供的专业协助。我们还要感谢 Anne Saunderson 和 Lindsay Mock 在获取人类组织方面的帮助。人类成人心脏和胎儿心脏组织样本的获取均已获得苏格兰 NHS Tayside 医学研究伦理委员会和 NHS Lothian 研究伦理委员会（REC08/S1101/1）的正式伦理批准。本研究得到了医学研究理事会（BP）、英国心脏基金会（BP）、宾夕法尼亚州联邦（BP）、匹兹堡儿童医院（BP）、美国国立卫生研究院 R01AR49684（JH）和 R21HL083057（BP）以及匹兹堡大学 Henry J. Mankin 讲席基金的资助。JEB 获得了英国心脏基金会研究中心卓越中心博士培训项目（RE/08/001/23904）的支持。WC 部分得到了美国心脏协会博士前奖学金（11PRE7490001）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AbC 小鼠抗体磁珠试剂盒Molecular ProbesA-10344
胶原酶 IGibco17100-017根据需要将粉末重悬并过滤除菌
胶原酶 IIGibco17101-015
胶原酶 IVGibco17104-019
抗人 CD34-PEBD Pharmingen555822保持无菌
抗人 CD45-APC-Cy7BD Pharmingen557833保持无菌
抗人 CD56-PE-Cy7BD Pharmingen557747保持无菌
抗人 CD144-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566保持无菌
抗人 CD146-AF647AbD SerotecMCA2141A647保持无菌
EGM2-BulletKitLonzaCC-3162用于细胞收集及贴壁前的培养
DMEM，高糖，含 GlutaMAX，不含丙酮酸钠ThermoFischer Scientific10566-016
胎牛血清ThermoFischer Scientific10500-064分装冻存并保持无菌
明胶Sigma AldrichG1393用无菌水稀释
IgG1k-PEBD Pharmingen559320保持无菌
IgG1k-APC-Cy7BD Pharmingen557873保持无菌
IgG1k-PE-Cy7BD Pharmingen557872保持无菌
IgG1k-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566保持无菌
IgG1k-647AbD SerotecMCA1209A647保持无菌
小鼠血清Sigma AldrichM5905保持无菌
石蜡膜 - Parafilm MSigma AldrichP7793
青霉素-链霉素Gibco15979-063分装冻存并保持无菌
磷酸盐缓冲液，pH 7.4ThermoFischer Scientific10010-023保持无菌
红细胞裂解缓冲液 Hybri-MaxSigma AldrichR7757保持无菌
台盼蓝溶液Sigma AldrichT8154
胰蛋白酶-EDTA 0.5% (10倍浓缩液)Invitrogen15400-054
 FACSARIA FUSIONBD Pharmingen荧光激活细胞分选仪

参考文献

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