从人类心脏组织血管周围多能前体细胞群的分离

Summary

人体心脏组织窝藏多能血管周围的前体细胞群可能适合于心肌再生。这里描述的技术允许与天然血管， 即 CD146 ⁺ CD34相关联的两个多能基质干细胞群的同时分离和纯化^-周细胞和CD34 ⁺ CD146 ^-外膜细胞，从人的心肌。

Abstract

多能间充质干细胞/基质细胞 （MSC） 通过其塑料粘附性从原代组织消化物中常规分离，而它们的解剖组织位置仍不清楚。我们小组和其他研究人员最近发现血管周围细胞在多个组织中表达明确的血管周围和 MSC 细胞标志物，这为前瞻性分离和纯化多能血管周围前体细胞的特定同质亚群提供了机会。我们之前已经证明了使用荧光激活细胞分选 （FACS） 从人骨骼肌中纯化微血管 CD146⁺CD34^- 周细胞和血管 CD34⁺CD146^- 外膜细胞。在此，我们描述了一种通过 FACS 同时从人心肌中分离这两个血管周围细胞亚群的方法，该方法基于一组确定的细胞表面标志物的阳性和阴性选择表达。因此，该方法提供了多能心脏 MSC 样前体细胞的两个特定亚群，用于基础研究和/或治疗研究。

Introduction

该心脏一直被认为是一个有丝分裂后的器官。然而，最近的研究已经证明有限心肌周转的成年人的心脏¹的存在。原生干/祖细胞，心肌细胞分化的潜能也被认定为成人啮齿动物和人的心，其中的Sca-1 ^{+，C-KIT +，cardiosphere}形成心肌内，以及最近的血管周围前体细胞^2,3。这些细胞代表了旨在通过细胞移植或原位增殖的刺激增强心脏修复/再生疗法具有吸引力的候选者。

间充质干细胞/基质细胞（MSC）已经从几乎每个人组织^4,5的MSC的治疗应用的临床试验已进行了多种病理条件下分离如心血管修补^6，移植物抗宿主病⁷ 和肝硬化^8。有益的作用已被归因于MSCs向的能力:家里炎症⁹的部位;分化成不同细胞类型^10;分泌促修复分子^11;和调节宿主的免疫反应^12。干细胞的分离历来依靠其优惠的坚持塑料基板。然而，所得到的细胞群是典型地显着异质^13。通过使用荧光激活细胞分选（FACS）用的关键血管周围细胞标记物的结合，我们已经能够分离和纯化多能的MSC样前体群体（CD146 ⁺ / CD31 ^- / CD34 ^- / CD45 ....

Protocol

1.人力心脏样品处理

1. 确保所有的液体，容器，仪器，和专用业务区域是无菌的。
2. 放置心脏组织样品含有20％胎牛血清（FBS），并在冰上1％青霉素 - 链霉素（P / S）冷冻Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）的组成，在存储介质（由组织库或外科团队购买）交通^3。
3. 从存储介质中删除心脏样品并用补充有2％FBS和1％P / S的磷酸盐缓冲盐水（PBS）组成的洗涤介质洗涤。当处理样品，用细尖镊子把握大血管或心包和减少心肌的破碎。
4. 淹没在洗涤介质中的样品在培养皿和描述³取出心包，心内膜及大血管用消毒剪刀虹膜和细尖镊子。
5. 切剩下的myocardium成约1mm ³小块使用单一侧刀片或一对锋利的虹膜剪的。注意:如果样品立即处理最高细胞产量将获得。如果延迟是不可避免的，在新鲜的存储介质的存储处理后的心脏组织的（>5毫升每1cm ³组织）于4℃多达72小时是可能的，但是推测可能与在细胞中产量相关联的下降。

2.细胞的组织和隔离消化

1. 新鲜弥补消解液含有1.5-2.4毫升每胶原酶I，II胶原酶，和胶原酶IV（均在DMEM 0.5毫克/毫升），并以温暖的37℃水浴。
   注:音量和胶原酶的浓度是适宜的约1cm ^3个样本。
2. 通过100....

Results

单细胞从碎片和双峰正向和侧向散射分布的基础上区别。活细胞被他们未能采取了DAPI染料标识。选通策略被选择这个活，全心脏细胞的解离（ 图1）的同种型对照标记的基础上。从活细胞，CD45 ⁺细胞被第一选通出来，接着CD56 ⁺细胞。 CD144 ⁺内皮细胞然后从CD56取出^-级分。从这个最后的人口，CD146 ⁺ / CD34 ^-被选择/ CD34 ⁺外膜细胞和随后收集（ 图2） ^-周细胞和CD146。细胞收集后立即，每个亚群的一个小样本（500-1000细胞）是通过分选器重新运行，以确认细胞分布为记录在初始排序。 FACS纯化心肌佩里奇 ytes和外膜细胞都显示出主轴星状在培养细胞的形态（ 图3）。

Discussion

越来越多的证据支持成人心脏损伤后有限的再生能力。负责受伤的心如再生反应本土前体细胞的识别和鉴定是相关的机制和信号通路双方的理解和制定办法来治疗利用这些细胞的关键。

先前协议已经从人骨骼肌^25中所述的血管周围的前体细胞亚群的分离。然而，这些技术对心脏组织的直接应用经常导致非常差的细胞产量。因此，我们以丰富血管周围的前体细胞，即周细胞和外膜细胞，从人心肌活组织检查的两个分立的亚群并促进两个子集的同时纯化作出协议重大调整。从S两种细胞群的分离AME样品不仅优化了使用珍贵的心脏组织活检也可以让不同的血管周细胞亚群的直接比较。

为了获得细胞的最大产率，组织样品的新鲜度是至关重要的。对于周细胞和外膜细胞最大活细胞产量是大约3％和总活细胞解离的4％。产率可以从每子集约30,000至400,000细胞变化很大，并且高度依赖于许多因素，包括量和起始组织的质量和保存期限。周围细胞都比较细腻;自溶显示出变化的证据样本FACS后总是产生较低的细胞数量。类似地，血管周围细胞对苛刻消化技术敏感，和过消化也将导致降低活细胞的产率。的消.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AbC 抗小鼠微珠试剂盒	分子探针	A-10344
胶原酶 I	Gibco	17100-017	根据需要复溶粉末并过滤灭菌
胶原酶 II	Gibco	17101-015
胶原酶 IV	Gibco	17104-019
抗人 CD34-PE	BD 药学	555822	保持无菌
抗人 CD45-APC-Cy7	BD 药	557833	保持无菌
抗人 CD56-PE-Cy7	BD 药	557747	保持无菌
抗人 CD144-PerCP-Cy5.5	BD 药	561566	保持无菌
抗人 CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	保持无菌
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	用于收集细胞和培养直至粘附
DMEM、高葡萄糖、不含丙酮酸钠的 GlutaMAX	ThermoFischer Scientific	10566-016
胎牛血清	ThermoFischer Scientific	10500-064	分装冷冻并保持无菌
明胶	Sigma Aldrich	G1393	用无菌水稀释
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	保持无菌
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873	保持无菌
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	557872	保持无菌
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	保持无菌
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	保持无菌
小鼠血清	Sigma Aldrich	M5905	保持无菌无菌
石蜡膜 - Parafilm M	Sigma Aldrich	P7793
青霉素-链霉素	Gibco	15979-063	分装冷冻并保持无菌
磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4	ThermoFischer Scientific	10010-023	保持无菌
红细胞裂解缓冲液 Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757	保持无菌
台盼Blue Solution	Sigma Aldrich	T8154
胰蛋白酶-EDTA 0.5%（10x）	Invitrogen	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		荧光激活细胞分选仪