从人类心脏组织血管周围多能前体细胞群的分离

摘要

人体心脏组织窝藏多能血管周围的前体细胞群可能适合于心肌再生。这里描述的技术允许与天然血管， 即 CD146 ⁺ CD34相关联的两个多能基质干细胞群的同时分离和纯化^-周细胞和CD34 ⁺ CD146 ^-外膜细胞，从人的心肌。

摘要

多能间充质干细胞/基质细胞 （MSC） 通过其塑料粘附性从原代组织消化物中常规分离，而它们的解剖组织位置仍不清楚。我们小组和其他研究人员最近发现血管周围细胞在多个组织中表达明确的血管周围和 MSC 细胞标志物，这为前瞻性分离和纯化多能血管周围前体细胞的特定同质亚群提供了机会。我们之前已经证明了使用荧光激活细胞分选 （FACS） 从人骨骼肌中纯化微血管 CD146⁺CD34^- 周细胞和血管 CD34⁺CD146^- 外膜细胞。在此，我们描述了一种通过 FACS 同时从人心肌中分离这两个血管周围细胞亚群的方法，该方法基于一组确定的细胞表面标志物的阳性和阴性选择表达。因此，该方法提供了多能心脏 MSC 样前体细胞的两个特定亚群，用于基础研究和/或治疗研究。

引言

该心脏一直被认为是一个有丝分裂后的器官。然而，最近的研究已经证明有限心肌周转的成年人的心脏¹的存在。原生干/祖细胞，心肌细胞分化的潜能也被认定为成人啮齿动物和人的心，其中的Sca-1 ^{+，C-KIT +，cardiosphere}形成心肌内，以及最近的血管周围前体细胞^2,3。这些细胞代表了旨在通过细胞移植或原位增殖的刺激增强心脏修复/再生疗法具有吸引力的候选者。

间充质干细胞/基质细胞（MSC）已经从几乎每个人组织^4,5的MSC的治疗应用的临床试验已进行了多种病理条件下分离如心血管修补^6，移植物抗宿主病⁷ 和肝硬化^8。有益的作用已被归因于MSCs向的能力:家里炎症⁹的部位;分化成不同细胞类型^10;分泌促修复分子^11;和调节宿主的免疫反应^12。干细胞的分离历来依靠其优惠的坚持塑料基板。然而，所得到的细胞群是典型地显着异质^13。通过使用荧光激活细胞分选（FACS）用的关键血管周围细胞标记物的结合，我们已经能够分离和纯化多能的MSC样前体群体（CD146 ⁺ / CD31 ^- / CD34 ^- / CD45 ^- / CD56 ^{- ）}从多种人体组织包括成人骨骼肌和白色脂肪^14。

在各种非心脏组织的血管周围细胞群已被显示出具有干/祖细胞特性的第二正在研究在心血管设置临床使用。周细胞，最知名的血管周围细胞亚群之一，是一个异质人口玩几个病理生理作用，包括在新船¹⁵的发展，血压¹⁶和血管完整性^17,18的维护管理。由于在多种组织所示，周细胞的特定子集本身表达MSC抗原和FACS纯化后¹⁴维持在原代培养的MSC样表型。此外，这些细胞稳定地维持培养于他们的长期的表型，并表现出多谱系分化潜能，类似的MSCs ^19,20。这些结果表明，周细胞是难以捉摸的MSC ¹⁴的起源地之一。周细胞的治疗潜力已经证明在心肌疤痕的减小和增强移植后的心脏功能到缺血性损伤心^21。最近，我们成功地从人类心肌纯化周细胞和无骨骼肌肉发生³展示了他们MSC样表型和多能（脂肪形成，软骨和骨）。此外，心肌当周细胞与其他器官纯化的同行相比表现差心肌潜力和血管生成能力。

多能血管周围干/祖细胞，外膜细胞的第二群体，已经从人隐静脉分离阳性CD34的表达²²的基础上的。静脉外膜细胞已被证明具有克隆的潜力，中胚层分化能力和体外促血管生成潜力。这些细胞注入小鼠的缺血性损伤的心移植导致间质纤维化的减少，增加血管生成和心肌血流量，减少心室稀通货膨胀，而增加心脏射血分数^23。有趣的是，脂肪外膜细胞已被证明失去CD34的表达和上调响应于血管生成素II治疗中培养CD146表达，提示通过一个周细胞表型与刺激^24。内的心脏，然而，外膜细胞群体尚未前瞻性通过FACS和/或良好表征纯化。利用在以下各节中描述的细胞分离方法，我们目前正在表征心肌外膜细胞和调查其对再生的应用潜力。

这里我们描述了分离和从人胎儿或成年心肌纯化血管周围干/祖细胞的两个亚群的方法。本前瞻性细胞分离方法将使研究人员能够从人的心脏活检的比较研究和furthe获得等基因血管周围干/祖细胞亚群- [R探讨其在各种心脏病理状态的治疗潜力。

方案

1.人力心脏样品处理

1. 确保所有的液体，容器，仪器，和专用业务区域是无菌的。
2. 放置心脏组织样品含有20％胎牛血清（FBS），并在冰上1％青霉素 - 链霉素（P / S）冷冻Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）的组成，在存储介质（由组织库或外科团队购买）交通^3。
3. 从存储介质中删除心脏样品并用补充有2％FBS和1％P / S的磷酸盐缓冲盐水（PBS）组成的洗涤介质洗涤。当处理样品，用细尖镊子把握大血管或心包和减少心肌的破碎。
4. 淹没在洗涤介质中的样品在培养皿和描述³取出心包，心内膜及大血管用消毒剪刀虹膜和细尖镊子。
5. 切剩下的myocardium成约1mm ³小块使用单一侧刀片或一对锋利的虹膜剪的。注意:如果样品立即处理最高细胞产量将获得。如果延迟是不可避免的，在新鲜的存储介质的存储处理后的心脏组织的（>5毫升每1cm ³组织）于4℃多达72小时是可能的，但是推测可能与在细胞中产量相关联的下降。

2.细胞的组织和隔离消化

1. 新鲜弥补消解液含有1.5-2.4毫升每胶原酶I，II胶原酶，和胶原酶IV（均在DMEM 0.5毫克/毫升），并以温暖的37℃水浴。
   注:音量和胶原酶的浓度是适宜的约1cm ^3个样本。
2. 通过100微米滤网过滤悬浮组织碎片，用PBS洗两次。转移组织块到无菌30毫升容器一个密封的盖子。
   注:短而宽的盆，而不是高的细管给出更好的结果。可替代地，把组织片段在无菌50ml管中，如果在30ml容器不可用水平放置。
3. 添加全部消化解决方案（4.5毫升总数）并放置一个密封的塑料袋内的容器设置为120转一个37℃摇动的水浴。另外，与封蜡膜和地方的容器中加热轨道摇床设置为120 RPM。
4. 15分钟后，取出和更换再15分钟前三次颠倒了锅。除去和淬火用5ml的DMEM补充有20％FBS和1％P / S的胶原酶。
5. 用10毫升血清吸管，打破了任何组织团块轻轻吹打十到二十次磨碎的摘要。通过100微米过滤悬浮液顺序地，70μm和最后40微米的细胞滤网以除去未消化的物质，将获得单细胞悬浮液。
   注意:不细胞滤网之间冲洗，以避免被酶消化过程debrisgenerated细胞。
6. 离心机在200×g离心4分钟的细胞悬浮液，小心地倒出上清液并用4ml洗涤介质的稀释前重新悬浮在1ml红细胞裂解缓冲液，在室温下2分钟的沉淀。
7. 重复离心步骤和重新悬浮在1ml洗涤培养基的沉淀。拌匀取10微升细胞悬浮液为细胞计数。
8. 混合10微升细胞悬浮液与10微升台盼蓝染色，并放置10微升该混合物的对细胞计数标准血细胞计数器。算上明亮，圆形细胞存在于四角方块（每个细分成十六小方块）的数量除以4，让每角方的平均值。乘以2的平均值以帐户为污渍稀释因子，然后通过10 ^4，得到每1ml样品中的细胞的总数。

3。电池标签和排序

1. 加入50μl的小鼠血清对细胞悬浮液，并在4℃下孵育20分钟以阻断非特异性抗体结合。
2. 离心机在200×g离心4分钟小鼠血清的细胞悬浮液，取出上清液，并在洗涤介质中以每100微升1×10 ⁶个细胞的浓度重悬。
3. 等分每个细胞悬浮液的同种型和未染色对照的50微升成两个聚苯乙烯圆底流式细胞管然后将剩余体积为第三管为多色染色。
4. CD34-PE，CD45-APC-Cy7的，CD56-PE-Cy7的，CD144-PerCP-经Cy5.5，和CD146 - AF647抗体添加（总共1:100）的单细胞悬浮液用于多色染色。对于同种型对照，加入PE-，APC-Cy7-，PE-Cy7-，PerCP-Cy5.5-和AF647共轭合同种型抗体的等效容积。轻轻移液管混合与细胞抗体，并在4℃下孵育所有试管20分在黑暗中。
5. 通过在五个聚苯乙烯圆底流式细胞仪管加入正珠一滴100微升洗涤介质的准备补偿控制珠。添加的CD34-PE，CD45-APC-Cy7的，CD56-PE-Cy7的，CD144-PerCP-经Cy5.5，和CD146 - AF647抗体（所有1:100）分别到每个5管子。孵育所有试管于4℃在黑暗中20分钟。
6. 在温育，制备各用500μl内皮生长培养基-2在4℃（EGM-2）培养基和地点的细胞收集管中。
7. 以下抗体孵育，添加5毫升洗涤介质洗涤的细胞和小珠以除去未结合的抗体。离心机在200 XG 4分钟都管。重复洗涤和离心步骤。小心倒出上清，轻轻吸管重新悬浮细胞时。
8. 在洗涤介质中以每250微升约1×10 ⁶个细胞的浓度重悬。重悬在100μl的洗涤微米珠edium。
9. 交通建设在暗处的冰所有细胞和珠悬浮液的细胞分选仪。负珠1滴添加到正珠补偿控制管，并使用这些设置荧光补偿。
10. 运行，根据制造商的说明来建立背景荧光和电压设置为以下未染色的对照细胞:FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V。根据制造商的说明运行同种型对照以建立与非特异性结合背景荧光阈值。运行多色染色样品和收集周细胞和外膜细胞群进入收集管（ 图1）。
    注:最佳可行的细胞产量是周细胞的总活细胞解离的大约3％和外膜细胞的4％。

4.细胞培养

1. 根据FACS分选的结果，选择合适的尺寸培养板中。加入100微升无菌0.2％的明胶溶液的每生长面积的^平方厘米和手动搅动涂覆整个孔中。在4℃下进行10分钟孵育板和完全除去明胶溶液。保持收集的细胞在冰上而制备培养板。
   注:当在30,000到40,000细胞/ cm ²的明胶包被培养表面的密度接种新鲜整理周细胞外膜和细胞生长良好。
2. 离心新鲜采集的细胞以200×g离心4分钟，并在EGM-2.Seed适量在明胶包被的平板的细胞轻轻重悬浮细胞沉淀。
   注意:每孔和待添加的EGM-2的量被接种的细胞的实际数量取决于板的选择。例如加入0.5ml和1ml EGM-2则分别需要每孔为48和24孔板中。
3. 交换EGM-2为血管周围细胞生长培养基（的DMEM补充有20％FBS和1％P / S）为周细胞和外膜细胞一次细胞已（后至少72小时）定居并粘附到板上。从此改变介质每72小时。进行初次和所有后续的孵育在5％CO _2，并在37℃。
4. 使用0.05％胰蛋白酶的EDTA当周细胞和外膜细胞达到80〜90％汇合解离的细胞。用在PBS中的20％的FBS，离心机在200×g离心4分钟淬火，以1重悬浮在血管周围细胞的生长培养基中，然后通过将细胞:3的比例到未涂覆聚苯乙烯培养板中。从通道2开始，传代细胞以1:5的比例（或在约7000名细胞/ cm ^2），以未涂覆的聚苯乙烯培养板或烧瓶中。

结果

单细胞从碎片和双峰正向和侧向散射分布的基础上区别。活细胞被他们未能采取了DAPI染料标识。选通策略被选择这个活，全心脏细胞的解离（ 图1）的同种型对照标记的基础上。从活细胞，CD45 ⁺细胞被第一选通出来，接着CD56 ⁺细胞。 CD144 ⁺内皮细胞然后从CD56取出^-级分。从这个最后的人口，CD146 ⁺ / CD34 ^-被选择/ CD34 ⁺外膜细胞和随后收集（ 图2） ^-周细胞和CD146。细胞收集后立即，每个亚群的一个小样本（500-1000细胞）是通过分选器重新运行，以确认细胞分布为记录在初始排序。 FACS纯化心肌佩里奇 ytes和外膜细胞都显示出主轴星状在培养细胞的形态（ 图3）。

讨论

越来越多的证据支持成人心脏损伤后有限的再生能力。负责受伤的心如再生反应本土前体细胞的识别和鉴定是相关的机制和信号通路双方的理解和制定办法来治疗利用这些细胞的关键。

先前协议已经从人骨骼肌^25中所述的血管周围的前体细胞亚群的分离。然而，这些技术对心脏组织的直接应用经常导致非常差的细胞产量。因此，我们以丰富血管周围的前体细胞，即周细胞和外膜细胞，从人心肌活组织检查的两个分立的亚群并促进两个子集的同时纯化作出协议重大调整。从S两种细胞群的分离AME样品不仅优化了使用珍贵的心脏组织活检也可以让不同的血管周细胞亚群的直接比较。

为了获得细胞的最大产率，组织样品的新鲜度是至关重要的。对于周细胞和外膜细胞最大活细胞产量是大约3％和总活细胞解离的4％。产率可以从每子集约30,000至400,000细胞变化很大，并且高度依赖于许多因素，包括量和起始组织的质量和保存期限。周围细胞都比较细腻;自溶显示出变化的证据样本FACS后总是产生较低的细胞数量。类似地，血管周围细胞对苛刻消化技术敏感，和过消化也将导致降低活细胞的产率。的消...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AbC 抗小鼠微珠试剂盒	分子探针	A-10344
胶原酶 I	Gibco	17100-017	根据需要复溶粉末并过滤灭菌
胶原酶 II	Gibco	17101-015
胶原酶 IV	Gibco	17104-019
抗人 CD34-PE	BD 药学	555822	保持无菌
抗人 CD45-APC-Cy7	BD 药	557833	保持无菌
抗人 CD56-PE-Cy7	BD 药	557747	保持无菌
抗人 CD144-PerCP-Cy5.5	BD 药	561566	保持无菌
抗人 CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	保持无菌
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	用于收集细胞和培养直至粘附
DMEM、高葡萄糖、不含丙酮酸钠的 GlutaMAX	ThermoFischer Scientific	10566-016
胎牛血清	ThermoFischer Scientific	10500-064	分装冷冻并保持无菌
明胶	Sigma Aldrich	G1393	用无菌水稀释
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	保持无菌
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873	保持无菌
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	557872	保持无菌
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	保持无菌
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	保持无菌
小鼠血清	Sigma Aldrich	M5905	保持无菌无菌
石蜡膜 - Parafilm M	Sigma Aldrich	P7793
青霉素-链霉素	Gibco	15979-063	分装冷冻并保持无菌
磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4	ThermoFischer Scientific	10010-023	保持无菌
红细胞裂解缓冲液 Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757	保持无菌
台盼Blue Solution	Sigma Aldrich	T8154
胰蛋白酶-EDTA 0.5%（10x）	Invitrogen	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		荧光激活细胞分选仪