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方法文章

体外 转录实验及其在药物发现中的应用

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DOI：

10.3791/54256

⸱

2016年9月20日

 , 
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Department of Applied Biology and Chemical Technology, The State Key Laboratory of Chirosciences, The Hong Kong Polytechnic University

本文内容

摘要

在本文中，我们描述了一种用于功能性检测转录过程以及针对细菌转录的抗菌剂抑制活性的实验方案。

摘要

体外转录实验已开发并广泛应用多年，用于研究转录过程中涉及的分子机制。该过程需要多亚基的依赖DNA的RNA聚合酶（RNAP）以及一系列转录因子，这些因子通过调节RNAP在基因表达过程中的活性发挥作用。对放射性标记的转录产物进行测序凝胶电泳，可提供关于转录如何进行以及哪些参数能够影响转录的详细机制信息。本文中，我们描述了一种研究必需的延伸因子NusA如何调控转录暂停的实验方案，以及一种通过抑制RNAP全酶形成来鉴定靶向转录起始的抗菌剂的方法。这些方法可作为平台，用于开发更多研究手段，以探索作用机制尚不明确的转录因子的功能，以及开发靶向转录过程的新抗菌药物——这一靶点在抗生素研发领域尚未得到充分利用。

引言

转录是以特定DNA序列为模板合成RNA的过程。在真核细胞中存在三种不同的RNA聚合酶（RNAP）：RNAP I负责转录rRNA前体，RNAP II负责mRNA及某些小核RNA的合成，而RNAP III则负责5S rRNA和tRNA的合成。在细菌中，仅有一种RNA聚合酶负责所有类型RNA的转录。转录过程包括三个阶段：起始、延伸和终止。转录是细胞内受到高度调控的重要过程之一。 转录循环中的每个阶段均为基因表达调控的关键检查点1。在起始阶段，RNA聚合酶必须与σ因子结合形成全酶，该全酶可引导酶识别并结合到特定的启动子区域，形成开放的启动子复合物2。随后，在延伸和终止阶段，大量转录因子参与调控RNA聚合酶的活性。本文所研究的转录因子是高度保守且必需的蛋白质NusA，其参与调控转录暂停与终止过程，并在rRNA合成过程中发挥抗终止作用3-5。

体外 转录分析实验已被开发为研究转录过程中复杂调控步骤的有力工具6通常需要包含启动子区域的线性DNA片段作为转录的模板。该DNA模板通常通过PCR扩增或质粒线性化获得。随后加入纯化的蛋白质和核糖核苷三磷酸（NTPs，其中一种为放射性标记的NTP用于检测），经一定时间孵育后分析产物。通过使用适当的模板和反应条件，该方法已被用于研究转录的所有阶段，使过去半个世纪以来对转录过程的分子机制实现了深入的表征。7结合RNAP的三维结构信息，还能够探究抗生素及其先导化合物对转录抑制的分子机制，并利用这些信息开发新型且更有效的药物8-10.

在本研究中，我们提供了利用转录实验确定转录延伸/终止因子NusA调控机制的示例，并展示了如何确定一种新型转录起始抑制剂先导化合物的作用机制。

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方案

注意：实验涉及放射性同位素 32P 的使用，必须在满足所有适当的安全条件后方可开展任何操作。通常要求实验人员在使用放射性试剂前参加安全培训课程并接受监督下的实践训练。进行反应时，请穿戴个人防护装备（热释光剂量计、护目镜、手套、放射性实验室专用外套、长裤、封闭式鞋头的鞋子）。

1. 检测材料的准备

  1. 获取转录实验所需的蛋白质。
    1. 在此实验中，过量表达并纯化 E. coli 实验室中所描述的RNAP11，或从商业来源获取（材料清单）。
      注意：两种方法结果相似。也可采用其他方法纯化天然型或亲和标记的RNAP12,13σ/NusA 因子的获取方法可参见之前的研究工作14,15.
  2. 二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理水的制备
    注意：也可从商业渠道获取无RNase的水（材料列表）。
    1. 向1 L纯化水中加入1 ml焦碳酸二乙酯（DEPC）（0.1% v/v），混匀后过夜。
    2. 将DEPC水和枪头高压灭菌两次。
  3. DNA模板制备
    1. 纯化质粒pSG115416 和/或 pIA22617 使用质粒纯化试剂盒（材料清单），按照制造商说明书进行操作。
    2. 扩增用于加尾转录实验的模板（一个包含360 bp片段的区域） P木糖 启动子区域），在冰上配制PCR反应体系，包含25 μl 2x PCR混合液（材料列表）、各2 μl引物（5 µM）：5′-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3′（正向）和5′-CCCATTAACATCACCATC-3′（反向）、1 μl pSG1154质粒样品（250 µM）以及20 μl纯水。
      1. 或者，对于单轮转录实验，扩增一个包含λ的447 bp片段 PR pIA226的启动子区域17在冰上配制PCR反应体系，包含25 μl 2x PCR混合液、各2 μl引物（5 µM）：5′-GTGCTCATACGTTAAATCT-3′（正向）和5′-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3′（反向），以及1 μl pIA22617 质粒制备（250 µM）和20 μl纯化水。
        注意：该模板在 +26 nt 位置之前缺少胞嘧啶，+26 nt 位置是第 26th 转录起始位点下游的核苷酸。因此，当反应体系中仅存在ATP、UTP和GTP时，以此模板进行转录可实现转录起始、启动子逃逸，并在+26 nt位置停滞，形成稳定的转录延伸复合物（EC）。
    3. 设置PCR反应条件：95 °C 预变性30秒，50 °C 退火30秒，72 °C 延伸30秒，共循环30次。
    4. 使用PCR纯化试剂盒（见材料清单），按照制造商说明书纯化产物，并用100 μl转录缓冲液洗脱，用于转录实验。
    5. 使用荧光分光光度计（见材料清单）测定模板DNA浓度。
  4. NTP 制备
    注意：NTPs 可从不同商业来源获得（材料列表）。
    1. 将NTPs（纯度≥99%）溶解于经DEPC处理的水中，配制成1 M储存液，分装1 ml该溶液至1.5 ml离心管中（每管50 μl），于-20 °C保存。
    2. α-顺序32P UTP（3,000 Ci/mmol）在实验前 32P 的半衰期较短，为 14.29 天。
      注意：使用α标记的UTP可避免比较不同长度条带的强度。
  5. RNA分子量标准物制备
    1. 在室温下配制以下反应体系：0.5 μg RNA模板混合物（材料列表）、80 mM HEPES缓冲液（pH 7.5）、12 mM MgCl₂、1 mM each of ATP、CTP、GTP和UTP、10 mM DTT、40 U RNase抑制剂、20 U T7 RNA聚合酶。2，10 mM NaCl，10 mM DTT，2 mM ATP/CTP/GTP，0.5 mM UTP，2 μl α-32P UTP，0.5 μl T7 RNAP（材料列表），DEPC处理水补至20 μl。
    2. 37 °C 反应 1 小时。立即使用或于 -80 °C 保存。

2. RNA测序凝胶的制备

  1. 凝胶制备
    1. 用70%乙醇和纯化水将测序凝胶装置（材料列表）的玻璃板清洗两次，并用梳子和两个垫片组装成凝胶槽。
      注意：可在其中一块玻璃板上涂覆硅化试剂（材料列表），以便在步骤4.2中更容易取出凝胶。
    2. 使用磁力搅拌器将33.6 g尿素溶解于22 ml水和16.4 ml 5×Tris/硼酸/EDTA（TBE）缓冲液（1 L水中含54 g三（羟甲基）氨基甲烷；27.5 g硼酸；10 ml 1 M乙二胺四乙酸（EDTA），pH 7.4）中。
    3. 向尿素溶液中加入16 ml 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液（19:1），并通过0.45 µm滤膜过滤。
    4. 向滤过的溶液中加入514 µl 10%（w/v）新配制的过硫酸铵水溶液，随后加入51.4 µl N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）。
    5. 轻轻倒置混合液以避免过度起泡，并立即从水平放置的预装测序槽底部的加样孔平缓注入。注胶时应注意避免产生气泡。
    6. 室温静置1–1.5小时，待凝胶完全聚合后即可用于转录实验。若用浸湿的纸巾覆盖测序槽顶部后密封，凝胶可在室温下保存两至三天。

3. 转录反应

  1. 转录延伸暂停实验
    1. 转录延伸复合物的形成
      1. 向一个1.5 ml离心管中加入1 µl RNAP核心酶（转录缓冲液中1 µM储存液）。
      2. 向RNAP中加入1 µl纯化的σ-70因子（σ70；转录缓冲液中3 µM储存液），冰上孵育10分钟，以形成RNAP全酶。
      3. 向RNAP全酶中加入3 µl纯化的模板DNA（500 nM，转录缓冲液中，来自pIA226 PCR产物的λ PR启动子），37 ºC孵育5分钟，以形成开放复合物。
      4. 在另一个1.5 ml离心管中配制反应组分混合液：加入5 µl 10×转录缓冲液（材料清单：400 mM Tris-HCl、1.6 M KCl、100 mM MgCl2、10 mM DTT、50%甘油，DEPC处理水中配制，pH 7.9），2 µl每种250 µM GTP和UTP，1 µl 1 mM ATP，以及1 µl α-32P UTP（3,000 Ci/mmol）。用DEPC处理水补至41 µl。
        注意：可使用RNase抑制剂（材料清单）以尽量减少RNase污染。
      5. 将上述混合液转移至含有开放复合物的离心管中，37 ºC孵育15分钟，以形成停滞在+26 nt位置的转录延伸复合物。
      6. 将反应体系转移至室温（约21 °C），加入1 µl 2.5 mg/ml利福平，终浓度为50 µg/ml。
      7. 向反应体系中加入1 µl 0.1 mM纯化的NusA蛋白，室温孵育5分钟。
      8. 向反应体系中加入2 µl 250 µM CTP，使终体积为50 µl，并使用计时器记录反应时间。
      9. 在30、60、120、240、480和1,200秒时，分别取5 µl反应液加入2 µl RNA上样缓冲液（95%甲酰胺、0.05%溴酚蓝和0.05%二甲苯蓝）中以终止反应。
      10. 将使用过的含32P UTP的枪头和离心管丢弃至放射性废物容器中。
  2. 转录起始实验
    1. 开放复合物的形成 
      1. 将纯化的σ70稀释至0.5 µM。
      2. 使用0.5 µM（而非3 µM）的纯化σ70以及DNA模板（来自pSG1154 PCR产物的Pxyl启动子区域），重复步骤3.1.1.1至3.1.1.3。
    2. 转录起始抑制实验
      1. 在加入σ70之前（即步骤3.1.1.1之后），将设计用于阻止RNAP全酶形成的抑制剂加入RNAP核心酶中，随后进行步骤3.1.1.2和3.1.1.3，以检测该抑制剂是否能够破坏全酶的形成。
      2. 或者，在步骤3.1.1.2之后加入抑制剂，以检测其是否能够竞争性抑制σ70与RNAP的结合。
      3. 在对照反应中，使用与抑制剂储存液等体积的DMSO（抑制剂溶剂）代替抑制剂。
    3. 反应的完成
      1. 将肝素溶于水中，配制成1 mg/ml的储存液，并于-20 °C保存。
        注意：肝素是一种DNA竞争性分子，可结合未形成开放复合物的RNAP。一旦开放复合物形成，肝素无法进入RNAP的DNA结合位点，因此不能抑制已形成的开放复合物的转录。因此，肝素仅用于单轮转录实验；多轮转录实验中无需使用。
      2. 配制反应混合液：加入5 µl 10×转录缓冲液（材料清单）、1 µl 1 mg/ml肝素溶液、1 µl每种10 mM ATP、GTP和CTP、2.5 mM UTP，以及1 µl α-32P UTP（3,000 Ci/mmol）。用DEPC处理水补至45 µl。
      3. 将反应混合液与转录开放复合物混合，短暂离心后于37 °C孵育20分钟。
      4. 取10 µl反应液加入5 µl RNA上样缓冲液（95%甲酰胺、0.05%溴酚蓝和0.05%二甲苯蓝）中以终止反应。

4. RNA 凝胶电泳与显影

  1. 运行变性聚丙烯酰胺凝胶
    1. 在50 ºC和50 W条件下，使用1x TBE缓冲液运行凝胶约1.5小时，直至凝胶和缓冲液的温度稳定在50 ºC。
    2. 将样品在90 ºC加热30秒，然后立即置于冰上，再上样至凝胶。
    3. 将样品加载到凝胶顶部的加样孔中，同时设置一泳道加入2 µl RNA分子量标记物（1:100稀释）。
    4. 在50 W和50 ºC条件下，使用1x TBE缓冲液继续电泳，直至溴酚蓝染料迁移至凝胶约2/3处。
  2. 凝胶处理
    1. 缓慢而小心地打开测序装置，将上层玻璃板与下层分离。操作时需格外注意，避免凝胶破裂。
    2. 将层析滤纸（见材料列表）裁剪至与凝胶大小一致，从凝胶顶部至溴酚蓝染料位置。使用盖革计数器确认放射性标记RNA转录本的大致位置。
    3. 小心地将滤纸覆盖在凝胶表面，并用力按压，使凝胶牢固粘附于滤纸上。将凝胶底部切下并作为放射性废物丢弃，因为未掺入的NTP会迁移至凝胶底部，可能具有高放射性。
    4. 将一块大小相似的滤纸放置在真空干燥仪的加热板上，然后小心地将带有凝胶的一面朝上平铺于其上。
    5. 用塑料膜覆盖凝胶表面，在60 °C下干燥1.5小时。
    6. 将带有凝胶的滤纸另一面也用塑料膜包裹，然后放入成像盒中的光激发荧光成像板上，根据反应效率选择适当的曝光时间，通常为1小时至过夜。
    7. 按照制造商说明，使用成像仪扫描荧光成像板，并依据软件手册使用ImageJ软件分析条带相对强度。
    8. 使用盖革计数器检测工作区域是否存在放射性污染，对可疑物品和区域用纸巾和清洁剂擦拭，并将纸巾丢弃至指定废物容器中。

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结果

通过测量不同时间点条带中的放射性水平，可以确定转录效率。用于检测 NusA 因子功能的暂停实验能够可视化暂停、终止和通读产物（图 1A）。在存在 NusA 的 N 端结构域（NusA NTD；氨基酸残基 1-137）时，与缺乏 NusA 的对照实验相比，RNA 产物的出现显著延迟。当 NusA 片段中缺失氨基酸残基 104-137（螺旋 3），或一系列氨基酸残基（K36、K37、R104、Q108、K111、Q112、Q116 和 R119）被突变为丙氨酸时，NusA 的暂停活性完全丧失。螺旋 3 中的残基 R104 和 K111 被证明对 NusA NTD 的暂停活性至关重要，且 R104A 和 K111A 突变体产生的暂停半衰期值与未添加 NusA NTD 的对照组相似（图 1B）。值得注意的是，缺失螺旋 3 或突变这两个氨基酸残基对 NusA 与 RNAP 的结合无影响15。该结果表明，R104 和 K111 是调控 NusA 暂停活性所必需的关键氨基酸残基。

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讨论

在所有生物体中，转录是一个受到严密调控的过程。In vitro 转录实验已被开发出来，用于测试转录因子、小分子以及转录抑制剂的作用效果。本文介绍了一种通用的细菌转录实验方法。将转录实验与转录产物的测序凝胶电泳相结合，对于机制研究具有重要意义，因为它能够沿时间线可视化所有转录产物。因此，该方法能够识别反应条件中微小变化所产生的影响，并揭示可能的作用机制。此外，针对作用机制未知的转录因子，设计特定的转录实验也成为可能。

本文还描述了一种用于验证RNAP全酶形成抑制剂作用机制的方法。此处所述方法能够展示每种RNA转录本随时间的变化，经过适当修改后，还可用于针对转录各阶段测试抗菌剂的作用效果。多轮转录实验可作为相对简便的筛选方法，用于发现新的靶向转录过程的抑制剂；而单轮转录实验则可用于研究抑制剂的作用机制，例如判断其为竞争性或非竞争性抑制。需要注意的是，在药物发现过程中，小分子聚集可能导致假阳性结果，表现为非竞争性抑制剂，而单轮实验的机制研究可为从苗头化合物到先导化合物的评估提供全面的分析手段。因此，该受控的转录体系能够精确揭示抑制剂对转录过程的影响，有助于合理化

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了纽卡斯尔大学教师职业早期资助（CM）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
获得转录实验所需的蛋白质
大肠杆菌 RNAPEpicentreS90250
DEPC处理水的制备
焦碳酸二乙酯（DEPC） Sigma-Aldrich D5758
无RNase水 
Ambion 无核酸酶水ThermoFisherAM9937
DNA模板的制备
向导 加 SV Minipreps DNA 纯化系统PromegaA1330
ACCUZYME MixBiolineBIO-25028
PCR 引物
Wizard SV 凝胶与 PCR 纯化系统 PromegaA9281
NanoDrop 3300 荧光分光光度计Thermo ScientificND-3300
NTP 制备
ATPSigma-Aldrich A6559
UTPSigma-Aldrich U1006
GTPSigma-Aldrich G3776
CTPSigma-Aldrich C9274
高纯度rNTPsGE Healthcare27-2025-01
α-32P UTP PerkinElmer  BLU007C001MC放射性化合物
RNA分子量标准物制备 
Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kbMillipore69003
HEPESSigma-Aldrich H7006
氯化钠Sigma-Aldrich S7653
氯化镁Sigma-Aldrich M8266
DTTSigma-AldrichDTT-RO
T7 RNAPPromegaP2075
凝胶制备
Sequi-Gen GT 核酸测序胶板系统 Bio-Rad  165-3804
Sigmacote  Sigma-Aldrich SL2
尿素  Sigma-Aldrich U6504
三(羟甲基)氨基甲烷  Sigma-Aldrich 154563
硼酸 Sigma-Aldrich B7901
乙二胺四乙酸 Sigma-Aldrich ED
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 Sigma-Aldrich A9926
过硫酸铵 Sigma-Aldrich A3678
N,N,N',N'四甲基乙二胺（TEMED）Sigma-Aldrich T9281
转录实验
氯化钾Sigma-Aldrich P9541
甘油  Sigma-Aldrich G5516
利福平  Sigma-Aldrich R3501
甲酰胺  Sigma-Aldrich F9037
溴酚蓝 Sigma-Aldrich B0126
二甲苯青 Sigma-Aldrich X4126
肝素 Sigma-Aldrich 84020
RNasin 核糖核酸酶抑制剂PromegaN2511
转录缓冲液 
Tris 碱Sigma-Aldrich T1503
氯化钾Sigma-Aldrich P9541
氯化镁Sigma-Aldrich M2393
DTT  Sigma-Aldrich DTT-RO
甘油  Sigma-Aldrich G5516
滤纸
沃特曼 3MM Chr 层析纸Fisher Scientific05-714-5
放射性去污剂
Decon 90去污decon90
凝胶处理
Typhoon Trio+ 成像仪GE Healthcare Life Sciences63-0055-89

参考文献

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