体外 转录实验及其在药物发现中的应用

摘要

在本文中，我们描述了一种用于功能性检测转录过程以及针对细菌转录的抗菌剂抑制活性的实验方案。

摘要

体外转录实验已开发并广泛应用多年，用于研究转录过程中涉及的分子机制。该过程需要多亚基的依赖DNA的RNA聚合酶（RNAP）以及一系列转录因子，这些因子通过调节RNAP在基因表达过程中的活性发挥作用。对放射性标记的转录产物进行测序凝胶电泳，可提供关于转录如何进行以及哪些参数能够影响转录的详细机制信息。本文中，我们描述了一种研究必需的延伸因子NusA如何调控转录暂停的实验方案，以及一种通过抑制RNAP全酶形成来鉴定靶向转录起始的抗菌剂的方法。这些方法可作为平台，用于开发更多研究手段，以探索作用机制尚不明确的转录因子的功能，以及开发靶向转录过程的新抗菌药物——这一靶点在抗生素研发领域尚未得到充分利用。

引言

转录是以特定DNA序列为模板合成RNA的过程。在真核细胞中存在三种不同的RNA聚合酶（RNAP）：RNAP I负责转录rRNA前体，RNAP II负责mRNA及某些小核RNA的合成，而RNAP III则负责5S rRNA和tRNA的合成。在细菌中，仅有一种RNA聚合酶负责所有类型RNA的转录。转录过程包括三个阶段：起始、延伸和终止。转录是细胞内受到高度调控的重要过程之一。 转录循环中的每个阶段均为基因表达调控的关键检查点¹。在起始阶段，RNA聚合酶必须与σ因子结合形成全酶，该全酶可引导酶识别并结合到特定的启动子区域，形成开放的启动子复合物²。随后，在延伸和终止阶段，大量转录因子参与调控RNA聚合酶的活性。本文所研究的转录因子是高度保守且必需的蛋白质NusA，其参与调控转录暂停与终止过程，并在rRNA合成过程中发挥抗终止作用^3-5。

体外 转录分析实验已被开发为研究转录过程中复杂调控步骤的有力工具⁶通常需要包含启动子区域的线性DNA片段作为转录的模板。该DNA模板通常通过PCR扩增或质粒线性化获得。随后加入纯化的蛋白质和核糖核苷三磷酸（NTPs，其中一种为放射性标记的NTP用于检测），经一定时间孵育后分析产物。通过使用适当的模板和反应条件，该方法已被用于研究转录的所有阶段，使过去半个世纪以来对转录过程的分子机制实现了深入的表征。⁷结合....

方案

注意：实验涉及放射性同位素 ³²P 的使用，必须在满足所有适当的安全条件后方可开展任何操作。通常要求实验人员在使用放射性试剂前参加安全培训课程并接受监督下的实践训练。进行反应时，请穿戴个人防护装备（热释光剂量计、护目镜、手套、放射性实验室专用外套、长裤、封闭式鞋头的鞋子）。

1. 检测材料的准备

1. 获取转录实验所需的蛋白质。
   1. 在此实验中，过量表达并纯化 E. coli 实验室中所描述的RNAP¹¹，或从商业来源获取（材料清单）。
      注意：两种方法结果相似。也可采用其他方法纯化天然型或亲和标记的RNAP^12,13σ/NusA 因子的获取方法可参见之前的研究工作^14,15.
2. 二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理水的制备
   注意：也可从商业渠道获取无RNase的水（材料列表）。
   1. 向1 L纯化水中加入1 ml焦碳酸二乙酯（DEPC）（0.1% v/v），混匀后过夜。
   2. 将DEPC水和枪头高压灭菌两次。
3. DNA模板制备
   1. 纯化质粒pSG1154¹⁶ 和/或 pIA226¹⁷ 使用质粒纯化试剂盒（材料清单），按照制造商说明书进行操作。
   2. ....

结果

通过测量不同时间点条带中的放射性水平，可以确定转录效率。用于检测 NusA 因子功能的暂停实验能够可视化暂停、终止和通读产物（图 1A）。在存在 NusA 的 N 端结构域（NusA NTD；氨基酸残基 1-137）时，与缺乏 NusA 的对照实验相比，RNA 产物的出现显著延迟。当 NusA 片段中缺失氨基酸残基 104-137（螺旋 3），或一系列氨基酸残基（K36、K37、R104、Q108、K111、Q112、Q116 和 R119）被突变为丙氨酸时，NusA 的暂停活性完全丧失。螺旋 3 中的残基 R104 和 K111 被证明对 NusA NTD 的暂停活性至关重要，且 R104A 和 K111A 突变体产生的暂停半衰期值与未添加 NusA NTD 的对照组相似（图 1B）。值得注意的是，缺失螺旋 3 或突变这两个氨基酸残基对 NusA 与 RNAP 的结合无影响¹⁵。该结果表明，R104 和 K111 是调控 NusA 暂停活性所必需的关键氨基酸残基。

讨论

在所有生物体中，转录是一个受到严密调控的过程。In vitro 转录实验已被开发出来，用于测试转录因子、小分子以及转录抑制剂的作用效果。本文介绍了一种通用的细菌转录实验方法。将转录实验与转录产物的测序凝胶电泳相结合，对于机制研究具有重要意义，因为它能够沿时间线可视化所有转录产物。因此，该方法能够识别反应条件中微小变化所产生的影响，并揭示可能的作用机制。此外，针对作用机制未知的转录因子，设计特定的转录实验也成为可能。

本文还描述了一种用于验证RNAP全酶形成抑制剂作用机制的方法。此处所述方法能够展示每种RNA转录本随时间的变化，经过适当修改后，还可用于针对转录各阶段测试抗菌剂的作用效果。多轮转录实验可作为相对简便的筛选方法，用于发现新的靶向转录过程的抑制剂；而单轮转录实验则可用于研究抑制剂的作用机制，例如判断其为竞争性或非竞争性抑制。需要注意的是，在药物发现过程中，小分子聚集可能导致假阳性结果，表现为非竞争性抑制剂，而单轮实验的机制研究可为从苗头化合物到先导化合物的评估提供全面的分析手段。因此，该受控的转录体系能够精确揭示抑制剂对转录过程的影响，有助于合理化

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
获得转录实验所需的蛋白质
大肠杆菌 RNAP	Epicentre	S90250
DEPC处理水的制备
焦碳酸二乙酯（DEPC）	Sigma-Aldrich	D5758
无RNase水
Ambion 无核酸酶水	ThermoFisher	AM9937
DNA模板的制备
向导 加 SV Minipreps DNA 纯化系统	Promega	A1330
ACCUZYME Mix	Bioline	BIO-25028
PCR 引物
Wizard SV 凝胶与 PCR 纯化系统	Promega	A9281
NanoDrop 3300 荧光分光光度计	Thermo Scientific	ND-3300
NTP 制备
ATP	Sigma-Aldrich	A6559
UTP	Sigma-Aldrich	U1006
GTP	Sigma-Aldrich	G3776
CTP	Sigma-Aldrich	C9274
高纯度rNTPs	GE Healthcare	27-2025-01
α-32P UTP	PerkinElmer	BLU007C001MC	放射性化合物
RNA分子量标准物制备
Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb	Millipore	69003
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
DTT	Sigma-Aldrich	DTT-RO
T7 RNAP	Promega	P2075
凝胶制备
Sequi-Gen GT 核酸测序胶板系统	Bio-Rad	165-3804
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL2
尿素	Sigma-Aldrich	U6504
三(羟甲基)氨基甲烷	Sigma-Aldrich	154563
硼酸	Sigma-Aldrich	B7901
乙二胺四乙酸	Sigma-Aldrich	ED
40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺	Sigma-Aldrich	A9926
过硫酸铵	Sigma-Aldrich	A3678
N,N,N',N'四甲基乙二胺（TEMED）	Sigma-Aldrich	T9281
转录实验
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9541
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
利福平	Sigma-Aldrich	R3501
甲酰胺	Sigma-Aldrich	F9037
溴酚蓝	Sigma-Aldrich	B0126
二甲苯青	Sigma-Aldrich	X4126
肝素	Sigma-Aldrich	84020
RNasin 核糖核酸酶抑制剂	Promega	N2511
转录缓冲液
Tris 碱	Sigma-Aldrich	T1503
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9541
氯化镁	Sigma-Aldrich	M2393
DTT	Sigma-Aldrich	DTT-RO
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
滤纸
沃特曼 3MM Chr 层析纸	Fisher Scientific	05-714-5
放射性去污剂
Decon 90	去污	decon90
凝胶处理
Typhoon Trio+ 成像仪	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-89