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一种快速简化的高通量分离高纯度高密度脂蛋白中miRNA的方法

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DOI：

10.3791/54257

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2016年7月27日

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1Division of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, Virginia Commonwealth University, 2McGuire Veterans Affairs Medical Center, Research BC-101

本文内容

摘要

microRNA 发挥重要的调控作用，并正成为多种人类疾病的新型治疗靶点。已有研究表明，miRNA 可由高密度脂蛋白（HDL）携带。我们开发了一种简化方法，可快速从人血浆中分离出适用于 miRNA 分析的高纯度 HDL。

摘要

小非编码RNA（miRNA）已被发现与多种人类疾病相关，包括代谢综合征。它们可被用作诊断和预后的生物标志物，或作为药物开发的靶点。最近研究表明，miRNA可被脂蛋白（尤其是高密度脂蛋白，HDL）携带，并递送至受体细胞以被摄取。这提示miRNA可能通过调控基因表达，在细胞和器官功能中发挥关键作用，同时也可作为细胞间通讯及器官间相互作用的信使。目前从纯化的HDL中分离miRNA的方法在大规模使用小样本时存在操作上的不实用性，这主要是由于脂蛋白分离过程耗时且劳动强度大。我们已建立一种简化方法，可快速从血浆样本中分离适用于miRNA分析的高纯度HDL。该方法将有助于深入研究miRNA在健康与疾病中的作用，特别是为HDL在胆固醇逆向转运之外所具有的多种生物学功能提供新的见解。此外，HDL中所含的miRNA种类可为多种疾病的诊断提供有价值的临床生物标志物信息。

引言

microRNA（miRNA）是一类内源性非编码的小分子RNA，具有高度保守性，可通过降解或抑制特定靶标信使RNA来调控多种生物学过程，被认为是这些过程中的关键调控因子1。由于miRNA在细胞内发挥作用，因此已被探索作为组织来源的生物标志物，从而揭示了这些miRNA的组织特异性功能。然而，miRNA也存在于细胞外环境中，可与蛋白质结合或存在于外泌体/微囊泡中，从而有效避免被细胞外RNA酶降解2。近期研究表明，高密度脂蛋白（HDL）的保护作用可能与其促进胆固醇外流的能力关系不大，而更可能与其所携带的非胆固醇成分有关，尤其是其作为循环miRNA载体的功能3, 4。这些miRNA不仅可能调节脂质代谢，还与HDL-miRNA复合物的抗炎、抗氧化及抗血栓作用相关5, 6。

为了进一步探索高密度脂蛋白（HDL）颗粒所携带的miRNA的作用，有必要建立一种简单易行的miRNA提取方法，用于从高度纯化的HDL中提取miRNA，以便应用于临床常规检测。目前已报道多种HDL分离方法，但这些方法要么耗时过长，要么需要大量血浆样本，可能需要合并样本，还需进行 extensive 透析以去除分离脂蛋白中的盐分，并且均无法完全去除作为miRNA来源的外泌体3。本文描述了一种简单且快速的方法，可从小体积血液样本中大规模分离高度纯化的HDL并从中提取miRNA。我们相信，该方法可为循环miRNA的研究，特别是HDL在介导不同细胞与器官间通讯作用的研究，提供良好的参考依据。

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方案

1. 血液样本的采集

  1. 在肘前窝处选择明显的静脉，采用标准静脉穿刺法采集空腹外周静脉血，收集至含抗凝剂乙二胺四乙酸（EDTA）的10 ml塑料管中（EDTA与其他抗凝剂相比具有多项优势）。
  2. 在台式离心机中，于 4 °C 以 1,600 x g 离心血液样本 20 分钟，以获得无红细胞且含有少量 RNA 的血浆。
  3. 依次在4 °C下以3,000 g离心上清液10分钟（使用摆桶转子），以去除白细胞 & 血小板，然后额外离心15分钟以分别去除残留的细胞碎片。
  4. 按照制造商说明，在室温下使用密度计测量血浆密度。
    注意：在去除外泌体后、进行密度梯度超速离心前，可能需要使用0.9%生理盐水溶液调整密度（d = 1.023 g/ml）。

2. 血浆中外泌体的去除

  1. 去除与高密度脂蛋白（HDL）密度相似且作为miRNA重要定量来源的循环外泌体3。
    1. 向1 ml血浆中加入252 µl外泌体沉淀液，4 °C孵育30分钟以实现沉淀。随后在4 °C、1,500 g条件下离心30分钟，使外泌体形成沉淀。
    2. 为分离HDL，将所得上清液1 ml转移至聚碳酸酯厚壁超速离心管中，用于后续密度梯度超速离心处理（见下文）。

3. 密度梯度超速离心（图1）。

  1. 采用配备固定角转子的落地式超速离心机，在448,811 × g和8 °C条件下，通过三步法分离高密度脂蛋白（HDL）。
  2. 每次分离时需依次配制三种不同密度的溶液，且均为现用现配。
    1. 配制溶液A（用于极低密度脂蛋白VLDL的分离，密度d = 1.006 g/ml）：将11.4 g氯化钠（NaCl：0.195 mol）、0.1 g乙二胺四乙酸二钠（EDTA2Na）和1 ml 1N氢氧化钠（NaOH）溶于1,000 ml经高压灭菌的蒸馏水中，再额外加入3 ml高压灭菌蒸馏水。
    2. 配制溶液B（用于低密度脂蛋白LDL的分离，密度d = 1.182 g/ml）：将25.2 g溴化钠（NaBr）加入100 ml溶液A中（NaCl 0.195 mol，NaBr 2.44 mol）。
    3. 配制溶液C（用于高密度脂蛋白HDL的分离，密度d = 1.470 g/ml）：将78.8 g溴化钠（NaBr）与100 ml溶液A混合（NaCl 0.195 mol，NaBr 7.7 mol）。使用密度计在室温下确认其密度是否准确。所有溶液在使用前均保存于4 °C环境中。

4. VLDL 的分离

  1. 在6.5 ml聚碳酸酯厚壁超速离心管中，混合1 ml血浆（平均密度 = 1.023 g/ml）和200 µl无核酸酶的Fat Red 7B。
  2. 然后小心地将5 ml溶液A加至混合物上方。如有需要，可在溶液A上方额外添加Fat Red 7B以平衡各管重量。以加速度5、减速度7离心2小时。
    注意：离心过程中，脂蛋白将在其平衡密度区域形成条带状聚集。
  3. 离心结束后可见两层。吸取顶部的1.5 ml VLDL组分（代表上层），并于4 °C保存。
  4. 最后，用移液器从管底转移4 ml含有LDL、HDL、白蛋白及脂肪酸组分的液体至新的聚碳酸酯管中，用于LDL的分离。

5. 低密度脂蛋白的分离

  1. 分别将2 ml溶液B和100 µl无核酸酶的Fat Red 7B加入含有LDL和HDL组分的试管中（第4节）。
  2. 然后以加速度9、减速度7离心3小时。之后，移除代表上层的1.5 ml LDL组分，并在4 °C保存或于-80 °C储存。最后，将含有HDL组分的试管底部的4 ml转移至新的聚碳酸酯管中。

6. 高密度脂蛋白的分离

  1. 将2 ml溶液C、100 µl无核酸酶的Fat Red 7B和15 µl 98%的β-巯基乙醇分别加入含有HDL组分的试管中。
  2. 离心3小时（加速度9，减速度7）。随后移除代表上层的2 ml HDL组分，并于4 °C保存或储存于-80 °C。

7. 脂蛋白组分的脱盐与浓缩

  1. 为避免对后续琼脂糖凝胶电泳和 PCR 造成干扰，需使用适当分子量截留值的离心过滤装置（VLDL 用 3K 管，LDL/HDL 用 10K 管），按照制造商说明书去除密度梯度超速离心过程中添加的过量盐分。
    1. 简言之，在加入 2.5 ml 冷 PBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na₂HPO₄、2 mM KH₂PO₄；pH 7.4）后，将密度梯度超速离心收集的全部 VLDL 组分于 4 °C 下，使用水平转子离心 60 分钟。
    2. 用 10 ml 冰冷 PBS 对 LDL 组分进行两次脱盐处理，每次 30 分钟。接着，对 HDL 组分使用 13 ml 冰冷 PBS 进行两次脱盐处理。较高的 PBS 体积有助于提高琼脂糖凝胶电泳中的迁移率。离心后，移除含有脂蛋白的溶液，并于 4 °C 保存或置于 -80 °C 储存。

8. 琼脂糖凝胶电泳

  1. 采用试剂盒进行脂蛋白琼脂糖凝胶电泳，对生产商提供的说明书进行如下微小修改。
    注意：此步骤仅用于评估浓缩脂蛋白样品的质量和纯度。
    1. 简言之，取6 µl经密度梯度超速离心法脱盐后的脂蛋白组分，加样至预制脂蛋白凝胶中。使用VLDL、LDL和HDL的人脂蛋白标准品作为分子大小参照。在室温下用Rep Prep缓冲液以100 V电泳60 min。
    2. 将凝胶干燥10 min，然后在室温下用Fat Red 7B染色10 min。用甲醇-水（75:25，v/v）混合液脱色，并再次干燥5 min。

9. RNA 提取与纯化

  1. 使用血清/血浆miRNA分离纯化试剂盒，通过纯化的人HDL进行miRNA的分离。
    1. 简言之，向200 µl纯化的HDL中加入1 ml RNA裂解试剂，涡旋混匀后于室温孵育5分钟，以确保核蛋白复合物完全解离并灭活RNase。
    2. 然后向混合物中加入3.5 µl合成的秀丽隐杆线虫microRNA（cel-miR-39；1.6 x 108 拷贝/µl）。随后按照制造商说明书进行RNA提取。
  2. 按照制造商说明书，使用洗脱离心柱对提取的miRNA进行纯化。用分光光度计测定来自纯化HDL的miRNA浓度。
    注：从离心柱上洗脱miRNA时使用了16 µl无RNase的水。

10. 逆转录（RT-PCR）

  1. 从加入合成miRNA（cel-miR-39）的HDL中提取100 ng miRNA，并使用逆转录试剂盒按照制造商说明书在20 µl反应体系中进行逆转录。
  2. 设置无模板miRNA的阴性对照（NTC）和无逆转录酶混合液的对照（NRT）。

11. 实时荧光定量PCR（qRT-PCR） 

  1. 在20 µl总反应体系中进行实时PCR，体系包含2 µl cDNA（1:2稀释）、10 µl PCR混合液、2 µl通用引物、2 µl miRNA特异性引物以及4 µl无RNase的水。
  2. 在96孔板中运行反应：95 °C预变性15 min，随后进行45个循环（94 °C变性15 sec，55 °C退火30 sec），最后在70 °C延伸30 sec。所有反应均设三个重复。
  3. 随后，根据制造商说明书，以合成的内参基因进行标准化，采用2-ΔΔCt法计算miRNA的相对表达量。

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结果

去除外泌体后高密度脂蛋白的分离
为了从高度纯化的高密度脂蛋白（HDL）中获取miRNA，必须去除作为miRNA污染来源的外泌体7此操作在使用市售试剂盒进行密度梯度超速离心之前完成。出于实际需要，对某商业公司开发的三步标准密度梯度超速离心方案进行了修改（图1）。该方案需要使用固定角转子以140,000 rpm的速度进行离心，这一速度显著快于常用方案中最高为54,000 rpm的离心速度3、8、9 和 10使用广泛可用的T-1270转子（最高转速70,000 rpm）进行离心时，最初采用聚烯烃管，但其无法承受离心力而发生破裂。为避免管体塌陷，成功改用聚碳酸酯管。离心时间对脂蛋白氧化及可能的miRNA降解具有关键影响11因此，测试了多种不同的离心时间，总时长范围为8至96小时。此外，根据离心时间和离心力，分别调整了离心过程中的温度。

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讨论

从血液中鉴定新的生物标志物将有助于多种疾病的临床诊断和预后评估。微小RNA（microRNA）已知具备生物标志物的所有特性，并已在多项研究中得到证实14-17。在本研究中，我们展示了一种快速且简便的方法，用于从血浆高密度脂蛋白（HDL）中分离miRNA。传统的通过密度梯度超速离心法分离极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）的方法依赖于准确的血浆取样、缓冲液的精确配制、密度测定以及底部脂蛋白组分的定量转移8。已有多种方法被用于HDL的分离8-11，但这些方法往往非常繁琐，或需要大量血浆样本，并对分离的脂蛋白进行长时间透析以去除盐分，且无法完全排除外泌体和脂蛋白作为miRNA来源的干扰3。为克服这些不足，我们建立了一种简单快速的从血浆HDL中分离miRNA的方法。

本研究的关键目标和主要目的是通过超速离心法分离和纯化高密度脂蛋白-微小RNA（HDL-miRNA）复合物，避免红细胞（RBCs）、白膜层、外泌体、分泌性囊泡、极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（L...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作全部或部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为R01 AA 020758-04、U01DK 061731-13 和 T32 DK 007150-38（授予AJS），以及T32 DK 007150-38（授予AA）。此项工作为原创性研究，未同时在其他期刊投稿或考虑发表。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
塑料真空采血管，紫色头盖，含K2EDTA Becton, Dickinson and Company366643
离心Thermo Scientific，Sorvall Legend X1R 75004261
Densito 30PX 密度计Mettler ToledoMT51324450
ExoQuick 溶液 Invitrogen4484451
聚碳酸酯厚壁超速离心管赛默飞世尔科技O3237
Sorvall WX100 超速离心机 赛默飞世尔科技46902
脂肪红 7B Sigma-Aldrich201618
β-巯基乙醇 Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 离心滤过装置 10KMilliporeUFC901008
Amicon Ultra 离心滤过装置 3KMilliporeUFC800308
QuickGel Lipo试剂盒 Helena Laboratories 3344,3544T
用于VLDL、LDL和HDL的人类脂蛋白标准品LipoTrol；Helena 实验室5069
Rep Prep 缓冲液 Helena Laboratories 3100
RNeasy MinElute 离心柱 Qiagen
NanoDrop 1000 分析仪赛默飞世尔科技
miScript II RT试剂盒 Qiagen218161
CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统BioRad
miRNeasy 血清/血浆试剂盒QIAGEN217184
miScript 引物检测试剂盒QIAGEN141078139
miScript SYBR Green PCR 试剂盒 QIAGEN218073
miRNeasy 血清/血浆内参对照QIAGEN219610
NaOHSIGMA-ALDRICH480878
0.20 µM 无菌注射器滤器SIGMA-ALDRICHZ227536

参考文献

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