方法文章

活体人脐静脉内皮细胞中微管动态的高分辨率延时成像与自动分析

DOI：

10.3791/54265

⸱

2016年8月13日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of the Sciences in Philadelphia

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

详细介绍了人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养、微管生长荧光标记物的瞬时转染、活细胞成像以及间期微管生长动态的自动化分析方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由现有血管形成新血管的生理过程需要特定的信号事件，以触发单个内皮细胞（ECs）内部的形态学变化。这些过程对于伤口愈合等稳态维持至关重要，同时也在促进肿瘤生长和转移中发挥关键作用。内皮细胞的形态由细胞骨架的组织结构决定，细胞骨架是一个受到严密调控的系统，包含肌动蛋白和微管（MT）的动态变化，已知其可调控内皮细胞的分支、极性及定向迁移，这些均为血管生成的关键组成部分。为了研究微管动态，我们采用高分辨率荧光显微镜，并结合对荧光标记的微管正端进行计算图像分析，以探究微管生长动态及其对内皮细胞分支形态和定向迁移的调控作用。通过将荧光标记的微管末端结合蛋白3（EB3）以及有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白（MCAK）特异性cDNA构建体转染至活的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，随后进行延时成像，以评估其对微管动态的影响。使用PlusTipTracker软件追踪EB3标记的微管正端，从而在延时图像中测量微管生长速度和微管生长寿命。该方法可实现对微管动态的研究，并有助于揭示细胞内亚区域中微管动态的局部调控如何影响内皮细胞分支与迁移等血管生成过程。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血管生成由细胞外信号刺激触发，这些信号促进内皮细胞（ECs）发生极化，以特定方向迁移，并在需要血液供应的组织中形成新的血管系统。被认为驱动血管生成的因素包括来自细胞外基质（ECM）的信号。响应物理信号，ECs 以特定方向延伸出新的分支，从而引导血管网络形成过程中的定向运动1,2。ECs 的形态结构和分支模式由微管（MT）细胞骨架的局部调控所决定，并与肌动蛋白-肌球蛋白收缩性的调控相协调3。为了形成 EC 分支，肌球蛋白-II 必须在局部下调，从而导致局部细胞膜突起4。与此同时，在细胞的相同区域，微管的生长动态发生改变，表现为缓慢而持续的微管生长，以促进分支的延伸和稳定性5。这种协调的细胞骨架调控使 ECs 能够建立形态极性，从而促进其定向迁移。

极化细胞形态的形成需要微管（MT）的极性组装6。在迁移的上皮细胞中，微管在细胞前缘特异性地缓慢而持续地生长7-9；而在神经元中，轴突或树突的起始与延伸不仅需要微管的存在，还要求微管持续进行动态的组装与解聚过程10-15。因此，微管生长动态的局部调控决定了细胞的结构，并使内皮细胞在穿越其细胞外基质（ECM）时能够快速重塑细胞形态。

微管（MT）的生长动态受到分子马达蛋白家族和非马达蛋白的调控，后者被称为微管相关蛋白或微管相互作用蛋白（下文统称为MAPs）。MAPs可在局部被激活或失活，通常由细胞-细胞外基质（ECM）界面启动的信号级联反应所介导16,17。一旦被激活，MAPs通过结合微管并改变其组装与去组装的动力学，从而在局部调控微管动态，以促进细胞形态和极性的建立18-20。有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白（Mitotic Centromere Associated Kinesin, MCAK）属于Kinesin-13家族的MAP，可结合微管末端，并将ATP水解与微管去组装过程偶联21-23。MCAK的这一功能在有丝分裂纺锤体中具有关键作用24-28，同时在间期也发挥重要功能29,30。在间期的内皮细胞（ECs）中，MCAK介导的微管去组装受到局部Aurora-A激酶磷酸化MCAK的调控，该过程由伤口边缘激活的小GTP酶Rac1所诱导。该信号级联的最终效应是在迁移内皮细胞的前缘抑制MCAK活性，导致微管向细胞前缘极性生长，而在后缘则发生MCAK介导的微管去组装31。

传统测量微管（MT）生长动态的方法通常采用手动追踪荧光标记的微管蛋白，或者近年来更常用的荧光标记微管末端结合蛋白1或3（EB1或EB3）。荧光微管蛋白方法的优势在于能够标记整个微管阵列。然而，由于大多数有丝分裂期细胞类型在间期维持放射状排列的微管阵列8,32,33，中心体附近的微管非常密集，因此使用荧光微管蛋白追踪微管的生长与解聚通常仅限于细胞的周边区域。由于这些局限性，荧光标记EB蛋白（EB1或EB3）的方法已成为测量微管动态更为常用的技术。由于EB蛋白仅标记正在生长的微管正端，因此在显微图像中表现为小而明亮的荧光“彗尾”（1–3 μm），从而提供了一个易于识别的微管聚合标志，且背景荧光极低34–37。尽管EB蛋白仅标记部分微管阵列这一特性是该方法的主要优势之一，但也突显出一个重要局限性，即非生长状态的微管不会被EB3标记。尽管如此，通过随时间测量和追踪EB3彗尾，并可视化亚细胞区域内的微管生长，使该方法成为需要对微管区域组织进行评估的应用的理想选择。

传统方法在测量微管（MT）生长动态方面另一个关键的局限性在于数据集非常庞大，以及数据分析所需的时间过长。这一局限性源于需要以高时间分辨率手动追踪数百个EB彗星状信号。此外，这些测量必须在具有统计学意义数量的细胞中进行，并且还需在多种对照和实验条件下重复执行。近年来，通过专门针对活细胞中延时显微成像下EB3彗星状信号追踪的计算分析技术，这些限制已得到克服35。当合理使用时，这种计算方法不仅能够减少手动追踪所带来的人为误差，还可实现高通量的微管聚合速率测量。利用基于MatLab的软件包plusTipTracker对微管动态进行计算分析，可通过对荧光标记的EB3彗星状信号的追踪来测量微管的生长过程5,31,35,38。此外，plusTipTracker软件还能根据生长中的微管轨迹内EB3彗星信号的消失，计算微管的灾变事件（a.k.a. 去组装），并支持用户自定义感兴趣区域，实现细胞内（a.k.a. 区域性）微管生长动态的亚细胞水平分析。在我们的研究中，比较了分支区域与非分支区域之间，以及细胞前缘与后缘之间的微管生长动态。plusTipTracker软件输出的数据还可用于生成单个细胞及亚细胞区域的彩色编码轨迹叠加图像。

本文描述了用于研究MCAK在调控微管（MT）生长动态中的作用，以及该微管去聚合酶对内皮细胞（EC）分支形态和定向迁移调控贡献的方法学。本方法采用原代人源细胞系——人脐静脉内皮细胞（HUVECs），该细胞易于培养，并且非常适合通过电穿孔实现质粒cDNA的瞬时转染。随后，我们对转染了微管末端结合蛋白3（EB3）和有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白（MCAK）特异性cDNA构建体的HUVECs进行高分辨率、延时荧光显微成像，以评估其对微管动态的影响。利用基于PlusTipTracker的计算图像分析方法，对EB3标记的微管正端进行分析，测量延时图像中微管的生长速度和生长寿命，从而量化并比较实验干预对微管生长动态的影响。该方法可实现对微管动态的研究，并揭示亚细胞区域中微管动态的局部调控如何影响内皮细胞分支与迁移等血管生成过程。这些技术适用于任何可在活细胞中荧光标记并表达的微管相关蛋白（MAP）的研究。

方案

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1. HUVEC 培养与维持

  1. 通过向不含酚红的内皮基础培养基中加入内皮细胞生长培养基补充剂套装的全部组分以及5%青霉素/链霉素抗生素混合液，配制完全内皮基础培养基（具体信息见材料/设备列表）。将完全内皮基础培养基在水浴中加热至37 °C。
  2. 从液氮中取出一支人脐静脉内皮细胞（HUVEC）冻存管，在37 °C水浴中快速解冻2分钟。当细胞冻存液解冻至约80–90%时，向冻存管中加入500 μl预热的完全内皮基础培养基，用移液器轻轻吹打混匀，然后将细胞均匀接种至含有15 ml预热的完全内皮基础培养基的100 mm塑料细胞培养皿中。
  3. 将细胞放入37 °C、5% CO₂的培养箱中2过夜培养细胞，使其贴壁。期间不要移除或更换细胞培养基。
  4. 当100 mm培养皿 > 90% 汇合度时，将 HUVECs 转移至 75 cm² 培养瓶中2 经组织培养处理的培养瓶，并置于 >始终维持60%融合度（参见步骤1.5）。
    注意：当维持在一定密度时 >60%时，HUVEC的倍增时间稳定在18-20小时。
    1. 对于无需传代细胞的情况（即 密度是 <90%）时，吸除培养基，每48小时更换一次新鲜的完全内皮基础培养基。
  5. 当 HUVECs 达到 >90% 汇合度时，用 10 ml 1×PBS 洗涤 2 次，然后加入 1.5 ml 0.25% 胰蛋白酶，在 37 °C 处理 1–2 分钟，使细胞从培养皿上脱落。注意：延长胰蛋白酶作用时间会显著降低 HUVEC 的存活率。
  6. 通过将8.5 ml完全内皮基础培养基以4:1的比例（完全内皮基础培养基:胰蛋白酶，最低比例）加入胰蛋白酶/HUVEC混合物中来挽救细胞，并收集至15 ml锥形管中。
  7. 以 1,400 × g 离心 4 分钟。吸除上清液。
  8. 将沉淀重悬于2 ml完全内皮基础培养基中，并将细胞接种至新的225 cm²培养瓶中。2 含有25 ml完全内皮基础培养基的组织培养瓶

2. HUVEC 培养前盖玻片的准备

  1. 用纤连蛋白基质包被盖玻片
    1. 准备洁净无瑕的 22 mm 盖玻片（No. 1.5）39 并在室温（RT）下保存于100%乙醇中。
    2. 使用本生灯灼烧盖玻片，然后用镊子将其放入35 mm培养皿中。
    3. 将10 μl纤连蛋白储备液（1 mg/ml）与990 μl PBS混合，配制纤连蛋白/PBS混合液。
    4. 用移液器将250 μl纤连蛋白/PBS混合液滴加到35 mm培养皿中的盖玻片上，均匀铺展以覆盖盖玻片表面。
    5. 将培养皿在37 °C下孵育至少3小时，使用前用2 ml 1x PBS洗涤3次。
  2. 使用聚丙烯酰胺（PA）基质包被盖玻片
    1. 盖玻片活化
      1. 将22 mm的1.5号盖玻片置于50% 3-aminopropyltrimethyloxysilane溶液中，在搅拌器上孵育10分钟。孵育后，用双蒸水洗涤10次，每次2分钟。2O (ddH₂O)2O
      2. 将盖玻片置于摇床上，加入0.5%戊二醛，孵育30分钟。孵育结束后，用ddH₂O洗涤10次，每次2分钟。2O.
    2. 聚丙烯酰胺凝胶制备
      1. 制备硬度为0.7千帕（kPa）的聚丙烯酰胺（PA）凝胶，加入3.75 ml 40%丙烯酰胺、0.3 ml 2%双丙烯酰胺和0.95 ml ddH₂O2O.
      2. 配制10%的过硫酸铵（APS）工作液，置于冰上保存直至使用。
      3. 为准备1个盖玻片的PA溶液（总体积 = 166.7 μl），加入0.83 μl ddH₂O2O，41.7 μl 双丙烯酰胺溶液（步骤 2.2.2.1 制备），124 μl 10% 过硫酸铵，0.25 μl TEMED。
      4. 立即用移液器将15 μl PA溶液滴加到疏水性玻璃载片上（见试剂列表），并用一张活化的22 mm 1.5号盖玻片覆盖。室温下静置20分钟，使PA聚合。
      5. 移除盖玻片并转移至35 mm培养皿中，用2 ml 1×PBS洗涤3次，储存备用 < 4 °C 下 2 周
      6. 为了将纤连蛋白结合到聚丙烯酰胺凝胶上，将涂有聚丙烯酰胺的盖玻片暴露于2 mM sulfo-SANPAH溶液中，并用7,500 J的紫外光（254 nm）照射。用ddH₂O冲洗一次。2O.
      7. 将10 μl纤连蛋白储备液（1 mg/ml）与990 μl PBS混合，配制纤连蛋白/PBS混合液。
      8. 在35 mm培养皿的盖玻片上加入250 μl纤连蛋白/PBS混合液，均匀铺展以覆盖盖玻片表面。
      9. 在使用前，于37 °C孵育至少3小时，并用2 ml 1x PBS洗涤3次。

3. cDNA 转染及在盖玻片上培养 HUVEC

  1. 完成步骤 1.5–1.6。
  2. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并收集含有100,000个细胞/盖玻片（非迁移实验）或500,000个细胞/盖玻片（迁移实验）的细胞悬液体积。在1,400 × g离心4分钟，使细胞沉淀。
    注：迁移实验方案见下文第9节。
  3. 将待转染的细胞重悬于100 μl电穿孔缓冲液中。加入1 μg cDNA，混匀后转移至电穿孔比色皿中。使用针对HUVEC电穿孔设定的程序进行电穿孔：DNA混合物例如 项目编号：A-034
  4. 用500 μl完全内皮基础培养基重悬转染细胞，并将细胞接种至纤维连接蛋白包被的22 mm 1.5号盖玻片上（见上述方案2.1）。在37 °C孵育3–4小时，以允许cDNA表达载体充分表达。

4. 成像样本的制备

  1. 将双面胶剪成 2.5 cm × 0.65 cm 的条状。
  2. 取一块洁净的载玻片。取两条双面胶带，水平固定在载玻片的顶部和底部边缘。注意：为便于按照步骤 4.5 所述方法密封腔室，胶带与载玻片边缘之间需预留少量空间。
  3. 将盖玻片（来自步骤 3.4；细胞面朝下）放置到位，使其两条边落在胶带上。用镊子轻轻按压，固定盖玻片。
  4. 使用微量移液器，在盖玻片与载玻片之间加入 40 μl 成像培养基（含 25 μM HEPES 的完全内皮基础培养基）。确保盖玻片与载玻片之间的空间完全充满成像培养基。如有必要，吸除多余的成像培养基。
  5. 用温热的 VALAP（1:1:1 石蜡油:羊毛脂:石蜡）密封所有边缘。轻轻按压玻璃盖玻片，检查是否漏液。
  6. 将已安装并密封的盖玻片置于预热（37 °C）的显微镜载物台上。

5. 显微镜观察

  1. 使用配备有60倍、1.40数值孔径（NA）微分干涉差（DIC）油浸物镜、自动聚焦监控系统（PFS）、透射光电子快门、X和Y轴电动载物台、安装在电子滤光轮中的带通滤光片以及单片激光合束模块的转盘共聚焦显微镜，将显微镜聚焦于细胞与盖玻片的界面处，并使用显微镜载物台操纵杆定位单个细胞。
  2. 在图像软件程序中点击"相机设置"面板。在“相机设置”面板的"曝光时间"下拉窗口中，选择400毫秒。
    注意：曝光时间可能有所不同，应通过实验确定。
  3. 在图像软件程序中点击"ND采集"面板。在ND采集面板的λ（lambda）选项卡中，勾选488 nm和561 nm激光器。在ND采集面板的"时间"选项卡中，将采集时间设置为2秒，总时间设置为2分钟。
  4. 点击ND采集面板中的"立即运行"按钮，以400毫秒曝光时间、每2秒采集一次，获取持续2分钟的时间序列图像，使用488 nm和561 nm激光照明。
  5. 在图像软件程序的"光学配置"面板中，使用步骤5.2中描述的相机设置，点击405 nm激光按钮，然后点击"采集"以获取标记蓝色荧光蛋白（BFP）的蛋白的单张图像。
    注意：通常建议限制细胞对405 nm激光照射的暴露（图像采集频率和/或曝光时间），因为该波长长时间照射可能对细胞造成损伤。
    1. 对于MCAK-shRNA研究，采集一张405 nm图像以验证BFP标记的shRNA的表达。
  6. 在图像软件程序的"光学配置"面板中，使用步骤5.2中描述的相机设置，点击DIC按钮，然后点击"采集"以获取用于分支形态学分析的单张DIC图像（见下文第10节）。
  7. 图像采集完成后，使用图像软件程序中的"亮度/对比度"功能对图像信号进行数字增强。
  8. 导出经亮度和对比度调整后的图像。点击"文件"，然后点击"另存为"，然后选择".tif"作为图像文件类型。
    注意：按照步骤5.4所述方式进行采集时，通常会从一次2分钟的时间序列采集生成61个.tif图像文件。

6. 微管动力学分析

  1. 对于 EB3 追踪，使用 plusTipTracker 软件35，这是一种开源的、基于 MatLab 的计算软件包，专为荧光标记 EB 的自动检测、追踪、分析和可视化而设计。
  2. plusTipGetTracks 图形用户界面 (GUI)
    1. 要访问 plusTipGetTracks GUI，请输入命令 plusTipGetTracks。
    2. 对于 EB3 彗星检测，使用 GUI 浏览并选择包含 .tif 图像的父目录。
    3. 在 plusTipGetTracks GUI 的追踪参数面板中，输入以下数值：搜索范围半径 = 5 - 10；最小子轨迹长度 = 3；最大间隙长度（帧数）= 12；最大收缩因子 = 1.0；最大前向角度 = 25；最大后向角度 = 10；波动半径（像素）= 2；帧率（秒）= 2；像素大小（µm）= 110。
      注意：首先使用 plusTipParamSweepGUI 在一组具有代表性的 .tif 图像文件上测试最佳追踪参数。所输入的像素大小值取决于用于采集延时图像的物镜（见上述步骤 5.1–5.2）。
    4. 对于感兴趣区域（ROI）的选择，通过使用细胞的 DIC 图像手动描画细胞边缘，形成多边形，从而创建整个细胞的二值掩模。
    5. 对于子感兴趣区域（sub-ROI）的选择，使用改进的 plusTipTracker 子 ROI 选择工具，在目标伤口边缘细胞的伤口边缘处手动绘制一条 2 像素宽的线，以创建前缘和后缘掩模。
      注意：该线应平行于伤口边缘绘制，位置应位于目标细胞超出邻近伤口边缘细胞的延伸处31。
  3. plusTipSeeTracks GUI
    1. 通过点击“Track Overlays”列中的 "Plot Tracks" 按钮，验证并目视检查存储在 "ROI" 文件夹中的 .tif 图像的轨迹叠加图。对所有轨迹叠加图重复此操作。
    2. 通过点击“Optional Settings”列中的 "Create Groups" 按钮进行数据分组。点击数据文件以选择属于同一数据集的实验数据。通过为 "group" 输入一个易于识别的名称（例如，"control group"）来保存选择。
    3. 对于子 ROI 微管生长动态测量，在 GUI 的 "Sub-ROIs" 面板中点击 "manual selection"，输入一个 EB3 彗星轨迹必须在子 ROI 内被检测到的最少图像帧数，以符合 "track" 的标准，并提取前缘和后缘 ROI 内的微管生长事件。
      注意：例如，使用 3 帧（6 秒）作为可被提取为 "track" 的最小检测长度。从子 ROI 提取的轨迹将存储在每个细胞原始 ROI 文件夹内的子项目文件夹中。
    4. 微管生长子轨迹与子群分析
      1. 计算 "group" 数据集（见步骤 6.3.2）、每个 ROI（见步骤 6.2.4）以及每个 sub-ROI（见步骤 6.2.5）的平均微管生长速度和平均微管生长寿命。
    5. 在 plusTipSeeTracks GUI 的 Quadrant Scatter Plots 列中，点击 "Select Groups"，然后点击要比较的组（在步骤 6.3.2 中创建）。
      1. 选择 "Growth speed" 作为 x 轴选项，并将生长速度的平均值（来自步骤 6.3.4）输入框中。选择 "Growth lifetime" 作为 y 轴选项，并将生长寿命的平均值（来自步骤 6.3.4）输入框中。
    6. 勾选 "Remove tracks at start/end" 和 "Batch process on Groups." 旁边的复选框。点击 "Make Plots" 以生成整个细胞、前缘和后缘 sub-ROI 的微管生长轨迹分布图。
      注意：在本研究中，微管生长轨迹被划分为四个子群：慢速且短寿命、慢速且长寿命、快速且短寿命、快速且长寿命。
    7. 将步骤 6.3.4 中的平均值复制到电子表格软件程序中，并将文件保存为 .xls 扩展名。
      1. 点击 "Data"，然后从“Data”下拉窗口中点击 "Data Analysis"。选择 "t-test: two sample assuming equal variances" 以比较平均微管生长速度和微管生长寿命。在电子表格中高亮显示 t 检验比较结果中 p 值 < 0.001 的数据单元格。

7. 共定位分析

  1. 进行背景扣除时，使用成像软件程序中的“线条工具”，在绿色通道图像（488 nm 激发）上无细胞荧光信号的位置（即背景区域），通过点击屏幕绘制一个面积为 10 µm2 的方形感兴趣区域（ROI）。使用第 5.8 步的图像，对红色通道图像（561 nm 激发）重复此操作。
  2. 使用成像软件程序，右键单击第 7.1 步中绘制的 ROI，选择“设为背景 ROI”。点击“图像”，然后在下拉窗口中点击“扣除背景”，以从整幅图像中减去第 7.1 步获得的平均背景值。对共表达 Em-Aurora A 与 mCherry-MCAK、mApple-EB3 或 mApple-微管蛋白的细胞进行背景扣除。
  3. 仅在已扣除背景的红色通道图像中，点击二值化工具栏，选择 "设定阈值"，然后选择 "按通道"功能，以排除指定的荧光标记物。
    注意：阈值设定步骤在 mCherry-MCAK、mApple-EB3 或 mApple-微管蛋白图像上进行，以便绘制专门标记阈值化对象的线条，用于共定位分析（见第 7.4 步）。
  4. 使用成像软件中的线条工具，在阈值化图像内被排除的对象上方绘制一条两点粗细的线条。
  5. 选中第 7.4 步中绘制的线条对象，将红色通道中的线条对象复制并粘贴到对应的绿色通道（Em-Aurora A）图像上。
  6. 在成像软件程序的下拉窗口中选择“测量”，然后选择“强度分布剖面”，测量线条对象下方的灰度像素强度值，以计算每个单个细胞的共定位值和总的 Em-Aurora-A 值。
    1. 将数据按实验处理条件和亚细胞区域进行整理，导出至电子表格软件，并将文件保存为 .xls 类型（例如，“control_grayscale_intensity.xls”）。
      注意：以这种方式呈现的数据表示每个亚细胞区域中测得的 Em-Aurora-A 总量中的共定位比例。
  7. 根据第 7.6 步测得的数值，重复第 6.3.7 步，使用 p <0.05 作为显著性阈值，计算统计学显著性。

8. 免疫荧光

  1. 用多聚甲醛/戊二醛共提取/固定缓冲液（PGF-PHEM；含4%多聚甲醛、0.15%戊二醛、0.2%去垢剂的60 mM PIPES、27.3 mM HEPES、10 mM EGTA和8.2 mM MgSO4，pH 7.0）在室温下固定细胞（见步骤3.4），孵育10分钟。
  2. 用2 ml 1× PBS洗涤3次，每次5分钟。
  3. 用含0.01 g/ml NaBH4的1× PBS溶液处理2次，每次15分钟，以淬灭活性醛基。
    注意：NaBH4会产气形成气泡，可能导致盖玻片漂浮。孵育过程中必须确保盖玻片始终浸没在溶液中。若盖玻片开始上浮，可用镊子轻轻抬起其一端，使气泡逸出。
  4. 用1× PBS洗涤2次，随后在含5%脱脂奶粉的1× PBS溶液中，于室温在摇床上封闭1小时。
  5. 将细胞与一抗（兔抗pT288-Aurora A（1:1,000）和大鼠抗α-微管蛋白（1:500））在1× PBS溶液中孵育，置于4 °C摇床上过夜。
  6. 移除一抗，用1× PBS洗涤3次，每次5分钟，然后加入二抗（驴抗兔（1:1,000）和山羊抗大鼠（1:1,000）），溶于含5%脱脂奶粉的溶液中，在37 °C孵育2小时。
  7. 将盖玻片用适合荧光成像的封片剂封固于载玻片上，用透明指甲油密封盖玻片边缘，避光保存于4 °C。

9. 细胞迁移实验 

  1. 按照上述方法进行HUVEC培养以用于迁移实验（方案3：cDNA转染及盖玻片上的HUVEC培养，步骤3.2–3.3）。
  2. 转染细胞后，用80 μl完全内皮基础培养基对转染细胞进行复苏。将80 μl样品通过移液器以单滴形式加至预先干燥的、经纤连蛋白包被的22 mm圆形1.5号盖玻片中心。切勿摊开该80 μl液滴 滴加。在37 °C孵育3-4小时，以使细胞贴壁形成融合的单层。
    注意：干燥盖玻片是必要的，以防止80 μl液滴在接触盖玻片时扩散。该方法可使HUVECs集中在盖玻片的较小区域内，从而促进细胞快速形成融合单层。
  3. 用完全内皮基础培养基冲洗2次，以去除未贴壁的细胞。
  4. 创建一个 "伤口边缘，" 用无菌手术刀片轻轻刮擦盖玻片，将洁净的刀片沿第9.2步获得的HUVEC单层细胞表面缓慢拖过。用镊子轻轻固定盖玻片，防止刮擦过程中刀片滑动。
  5. 在37 °C培养箱中孵育细胞3小时以使其恢复。组装并安装盖玻片用于成像（见方案4）。
  6. 以10倍0.45 NA相差物镜和0.52 NA长工作距离聚光镜，在显微镜上每隔10分钟采集一次相差图像和488 nm荧光图像，持续12小时 "ND采集" 图像采集软件程序的面板（见步骤5.3）。

10. HUVEC 支化与迁移的定量分析

  1. 为了进行分支分析并确保细胞光照均匀及无偏倚的定量，获取已转染（参见步骤 3.3）并表达 mApple-C1 cDNA 构建体（一种细胞体积标记物）的 HUVEC 的显微图像。
  2. 使用成像软件程序打开 mApple-C1 图像，并在分支两侧膜曲率角度最大的位置进行标记。用一条直线连接这两个点。该直线即为 "分支起源"
  3. 使用成像软件的线条工具，目视识别长度符合要求的分支 >10 μm，从其长度来看 "分支起源" 在步骤10.2中确定。通过测量从分支起点到终点的距离来计算分支长度 "分支起源" 至分支尖端的最远端点（参见 图4).
  4. 计数长度为的分枝状突起的数量 >10 μm 的长度以获得 "细胞分支数量。"
  5. 对于迁移分析，使用步骤9.6中采集的图像，根据物理位置目视识别一个伤口边缘的HUVEC（即 位于伤口边缘的细胞）以及表达谱（即选择表达GFP的实验中的绿色伤口边缘细胞。
  6. 利用细胞的相差图像，在延时成像的第一个时间点，先目视识别细胞核（位于细胞中央附近的半透明球形结构），再目视识别核仁（位于细胞核内部的小型深色球形结构）。点击核仁所在位置，以标记其 x 和 y 坐标。
  7. 使用成像软件，在连续的时间序列图像中手动追踪核仁：通过点击核仁的位置，标记其在时间序列视频每一帧中的 x 和 y 坐标（图4).
  8. 使用成像软件，点击“File”，然后点击“Save As”，再选择图像文件类型“.xls”。
  9. 使用电子表格软件打开手部追踪数据文件（来自步骤 10.8），计算平均迁移速度和到原点的平均迁移距离。
  10. 使用电子表格软件程序，单击 "数据，" 然后点击 "数据分析" 从数据下拉窗口中选择经邦弗罗尼校正的单因素方差分析检验 >以95%置信度作为统计学显著性的临界值。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

用于活细胞显微镜观察的 HUVEC 培养
对表达荧光蛋白的 HUVEC 进行活细胞成像时，必须将 HUVEC 维持在适合细胞正常生长与维持、以及蛋白质正常表达和功能的环境中。图1 示意性地展示了用于制备缓冲且封闭系统的方法流程，该系统可保持优化的光学特性，以采集活细胞的延时图像。将双面胶带切成细条并粘贴到载玻片上（图1A），然后将含有培养 HUVEC 的盖玻片倒置在胶带上，使细胞面向载玻片（图1B）。通过这种方式，胶带在两片玻璃表面之间形成微小间隙，从而为细胞提供一个可浸润于适当细胞培养基中的空间（图1C；见上述方案4）。最后一步，使用凡士林：羊毛脂：石蜡（1:1:1 混合物，VALAP；图1D）将盖玻片密封至载玻片，以建立一个封闭系统。该细胞培养方法既可用于较短时间序列的 EB3 星状结构成像，也可用于较长时间序列的分支形成与迁移实验。此外，VALAP 类似蜡质的一致性使得在成像实验结束后可轻松将其从载玻片和盖玻片上去除，从而可在同一盖玻片及细胞样本上进一步进行其他补充性操作，例如固定和免疫标记（见方案8），这些操作均基于先前使用活细胞成像方法观察过的样本。

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图1：用于活细胞显微成像的HUVEC培养方法。（A）将两段双面胶带裁剪成0.65 cm × 2.50 cm的矩形条状，将其中一段水平贴在载玻片的上边缘，另一段贴在载玻片的下边缘。注意在胶带与载玻片边缘之间预留少量空间，以便后续如（D）所述密封成像腔室。（B）用镊子取出含有HUVEC的盖玻片，并将其倒置（细胞面朝下）放置在两段胶带之上。（C）使用微量移液器在盖玻片与载玻片之间加入40 μl成像培养基（补充有25 μM HEPES的完全内皮基础培养基）。确保盖玻片与载玻片之间的空间完全充满成像培养基，并避免产生气泡。如有必要，可沿盖玻片边缘使用吸液装置去除多余液体。（D）使用温热的VALAP（1:1:1 石蜡 : 羊毛脂 : 凡士林）沿盖玻片边缘进行密封。轻轻按压盖玻片以检查是否有培养基泄漏，如有泄漏则补充VALAP进行修补。请点击此处查看该图的放大版本。

通过自动追踪荧光标记的EB3，可对整个细胞及特定区域的微管（MT）生长动态进行综合分析。要分析EB3蛋白在细胞内的运动情况，必须获取清晰、分明且具有高时空分辨率的EB3显微图像。HUVEC细胞中荧光标记EB3的表达在不同细胞间差异显著，且同一细胞内的荧光强度通常在数小时内逐渐增强。因此，必须考虑并监测表达水平的这些变化，以识别EB3表达增加对微管生长动态可能产生的影响。最佳方法是对每张图像中细胞的灰度荧光强度分布进行评估，然后将数据分析限定于具有特定灰度表达范围的细胞。初始阶段对表达谱数据集的评估至关重要，应将其与plusTipTracker软件获得的各细胞微管生长动态数据进行比较。可通过将每个实验组中各细胞的表达谱分别与微管生长速度和微管生长寿命作图，以确定理想的灰度表达范围，并识别潜在的异常值。

图2展示了一张在纤连蛋白基质上培养的人脐静脉内皮细胞（参见上述方案2.1），该细胞表达接近最佳水平的mApple标记EB3蛋白。荧光EB3彗星结构在12秒的时间序列图像中被显示（图2A）。使用plusTipTracker软件对EB3彗星进行分析时，首先通过自动逐帧检测EB3彗星（绿色和黄色圆点，图2B）实现。随后，根据每帧之间彗星位置的变化，将各帧中检测到的彗星连接起来，生成EB3轨迹，并形成可视化的EB3轨迹叠加图像（图2C–F）。轨迹叠加图采用颜色编码，颜色差异由用户输入的参数决定。通常，这些参数基于微管生长速度和微管生长寿命的全局均值5,31，从而将数据分为四组：慢速且短寿命（红色）、慢速且长寿命（黄色）、快速且短寿命（绿色）以及快速且长寿命的微管生长（蓝色；图2G）。通过plusTipTracker对EB3标记的微管生长动态进行追踪，还可支持用户自定义感兴趣区域（ROIs）。plusTipTracker可提取用户定义的感兴趣区域内（图2A、图2B 和 图2F）的微管生长轨迹数据，从而实现对同一细胞内不同区域微管生长动态的比较。

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图2： EB3彗星的检测、追踪及plusTipTracker数据分析输出。 （A）表达mApple EB3的HUVEC细胞的时间推移成像视频。左侧面板显示整个细胞的视野及全细胞掩膜（白色线条），用于界定细胞边界。红色框表示右侧时间推移图像中放大的区域。右侧面板显示连续成像帧中EB3彗星的原始灰度时间推移图像（t = 0 秒 - t = 12 秒）。（B）基于（A）中图像，plusTipTracker对EB3彗星的检测结果。左侧面板显示检测到的彗星整体分布（黄色圆点）。红色框表示右侧时间推移图像中放大的区域。右侧面板突出显示五个被检测到的EB3彗星（红色箭头），并追踪这五个彗星在12秒成像期间的运动轨迹。绿色圆点表示在前一时间间隔中不存在（或未被检测到）的EB3彗星。（C）（A）中EB3彗星61帧图像（2分钟视频）的最大强度投影。（D）与（C）相同的61帧（2分钟视频）的plusTipTracker微管轨迹叠加图。（E）最大强度投影的放大区域（C中的红色框）。（F）最大强度投影上plusTipTracker微管轨迹叠加图的放大区域（D中的红色框）。（G）（D）和（F）中轨迹叠加图的颜色编码图例。慢速、快速、短寿命或长寿命的分类依据来自十组表达mApple-EB3的HUVEC细胞中所有生长轨迹测量值的平均值。为便于可视化，（D）和（F）中的轨迹叠加图使用了（A）中细胞图像的反相像素强度生成。比例尺 = 20 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

HUVEC 的分支和迁移模式对来自细胞外基质的力学物理信号敏感。

人脐静脉内皮细胞（HUVECs）能够响应多种类型的信号刺激，并在此过程中发生形态学改变，从而决定细胞对特定信号刺激的适当反应36,40-42。在纤维连接蛋白包被的玻璃基质上培养的 HUVECs（图 3A），或在较硬的二维聚丙烯酰胺细胞外基质（55 kPa）上培养时，通常呈现圆形或伸长形态，分支状突起较少且不明显（图 3B）。然而，当培养于非常柔软的二维聚丙烯酰胺细胞外基质（0.7 kPa）上时，HUVECs 则表现出高度分支的形态，这种形态已知是由基质顺应性诱导的肌球蛋白-II 收缩力下调所致4,5,31（图 3C）。因此，HUVECs 通过细胞外基质的力学感知来调控其细胞形态，这一过程依赖于微管动力学和肌动球蛋白收缩力的局部调节。

由于HUVECs表现出多种形态学特征，为了测量HUVECs的分支情况，首先必须明确定义何为分支突起，然后定义如何客观地测量分支突起。一种技术采用四步法，即通过手绘表达荧光体积标记物的细胞图像边缘来生成细胞边界或“掩模”（图3D）。在生成掩模后，通过确定分支突起与细胞体之间曲率最大的位置来定义分支起点。绘制一条线以标示“分支起点”（紫色斜线；图3E）。分支数量通过计数具有明确定义分支起点的分支数目来测量（图3F）。分支长度定义为从分支起点到远端分支尖端的距离（图3G）。为了避免将微小的片状伪足突起纳入数据分析，额外设定标准：分支的长度（“分支长度”）必须大于其在“分支起点”处的宽度，并且分支长度至少需达到10微米5,31。

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图3： 人脐静脉内皮细胞分支形态分析 (A-C) 在纤连蛋白包被的玻璃细胞外基质上培养的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的微分干涉差（DIC）图像示例A) 坚硬（55 kPa）聚丙烯酰胺细胞外基质（ECMs）B）和软质（0.7 kPa）聚丙烯酰胺细胞外基质（ECMs）C）。在0.7 kPa聚丙烯酰胺细胞外基质上培养的HUVEC中，分支显著增加（C) 与较硬的ECM相比（A, B). (D). 转染表达mApple-C1 cDNA质粒（一种细胞体积标记物）的HUVEC的DIC显微图像（左图）与荧光图像（右图）。(E) 通过寻找曲率最大的位置来确定分支起点（即 膜曲率最大的位置（两侧分支处的紫色线条），然后用一条直线连接这两个角度（蓝色线条）。(F) 识别并选择延伸的分支状突起 >10 μm 从 "分支起源" （在E中定义）。计数分支突起的数量以获得 "分支数量。" (G) 测量从中心到 "分支起源" 使用 NIS Elements 软件的注释与测量工具中的直线工具，测量至分支最远端点，以获得 "分支长度" 比例尺 = 20 μm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

除了感知细胞外基质的顺应性外，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）还能感知并响应由划痕损伤所诱导的相邻细胞接触的消除。在迁移实验中，将单层培养的 HUVECs 进行划痕处理，并测量其迁移特征（见上述方案9）。在通过划伤单层细胞诱导损伤后，位于伤口边缘的 HUVECs 会极化，形成向前突出的前缘并伸入伤口区域（图4A，t = 0 小时）。在10–12小时的时间过程中，极化的伤口边缘 HUVECs 迁移进入伤口区域，填补伤口，重建一个新的汇合单层（图4A，t = 11 小时）。与 HUVEC 分支类似，现有证据表明，极化和迁移过程关键依赖于微管（MT）和肌动蛋白细胞骨架的协调性重组43-49。这一过程部分通过在伤口边缘 HUVECs 的前缘而非后缘局部抑制 MCAK 介导的微管解聚来实现31。微管动态对伤口诱导极化的敏感性由 Rac1 GTP酶启动，Rac1 可靶向多种下游调节蛋白，包括 Aurora-A 激酶，后者可磷酸化并在前缘抑制 MCAK，以及其他能够抑制或激活微管相关蛋白（MAPs）以局部调控微管生长与缩短的激酶18,31,36,48,50-53。大量实验证据支持如下观点：前缘突出与后缘收缩的协调是通过 Rac1 激活促进前缘微管组装、RhoA 激活促进后缘肌动球蛋白收缩力的循环机制所调控的，从而驱动定向运动9,41,51,52,54-58。

迄今为止，尚无公认的自动化细胞迁移追踪方法。这主要是由于在计算上难以分析细胞-细胞外基质（ECM）边界，这些边界会随着伤口边缘细胞的极化和迁移而持续变化。尽管许多软件程序能够追踪荧光标记的细胞59-64，但在伤口边缘迁移实验中，荧光标记的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）仅占总HUVEC群体的约30-40%，因此大多数伤口边缘细胞必须通过相差或微分干涉差（DIC）成像进行观察。此外，在测量伤口边缘迁移时，重要的是在同一伤口内同时评估荧光标记和非荧光标记的细胞，以便在实验组内及实验组之间识别表达载体的特异性效应。目前，测量HUVEC迁移的最佳方法是采用手动追踪法：首先识别一个伤口边缘细胞，然后确定其细胞核和核仁（图4B）。核仁因其较高的光散射密度和相对较小的尺寸而被用作细胞追踪的位置判定依据。这两个特征使得核仁更易于识别，并通过限制操作者放置单个追踪点的区域来减少测量误差。HUVEC的迁移轨迹通过在连续的时间推移图像帧中点击核仁位置生成。最后，对对照组和实验组细胞的迁移速度及迁移距离原点进行测量和分析（图4B）。

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图4： 伤口边缘HUVECs分析及迁移追踪 (A) 11小时延时成像序列中划痕伤口边缘HUVECs的20倍相差图像（又称为 "迁移实验"）。伤口位置及细胞迁移方向在 t = 0 hr 图中标出。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）跨越伤口边缘并向伤口内迁移，直至形成单层细胞（t = 3.5 hr – t = 11 hr）。B) 迁移实验延时成像分析（如A所示）首先需要根据细胞位置确定一个可追踪的伤口边缘HUVEC即 位于伤口边缘的细胞）及其表达谱（即， 如果实验涉及GFP表达，则选择绿色伤口边缘的细胞。利用相差图像识别细胞核和核仁。使用NIS Elements软件中的注释与测量功能，在连续的时间序列图像中手动追踪核仁，以确定其迁移速度和距起点的距离。比例尺 = 100 μm  （A）， 20 μm (B)。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在形态学与迁移实验中使用 HUVEC。
为了测量和评估微管生长及 HUVEC 形态的变化，并将这些变化归因于细胞外基质（ECM）信号刺激，对表达 EB3 标记微管的 HUVEC 进行活细胞成像时，需要具备适当且可重复的细胞培养条件。HUVEC 是研究细胞形状与运动性的理想模型。它们易于转染荧光标记的 cDNA，对可溶性及物理性信号刺激均表现出显著的形态变化，并且在适当的细胞培养条件下能够自我组织形成血管样管状结构65-70。原代细胞培养物（如 HUVEC）需要谨慎操作，并密切监测细胞传代次数，以确保细胞处于健康状态，并在实验过程中表现正常。例如，在开展研究细胞骨架和/或细胞形态的实验时，HUVEC 的传代次数不应超过第十代，因为通常在第十二至十五代时，HUVEC 开始出现形态不均一的现象。

细胞密度也是调节 HUVEC 健康和增殖的关键因素。在 HUVEC 分支研究（见上述方案 10.1-10.4）中，采用相对较低的细胞密度培养，以提供细胞足够的物理空间，使其能够与细胞外基质（ECM）相互作用并延伸出分支状突起。相比之下，在伤口边缘迁移研究（见方案 10.5-10.8）中，HUVEC 在划痕前以单层形式培养。因此，伤口边缘的 HUVEC 呈现相对非分支的形态，伸出前缘突起，并在迁移进入伤口区域时与其相邻细胞发生细胞-细胞相互作用。

在活体 HUVEC 中追踪微管动态的注意事项与优势。
转盘共聚焦显微镜是一种理想的方法，适用于需要在高时间分辨率下获得共聚焦图像清晰度的实验假设验证。配合适当的相机和激光模块，该显微技术对低强度荧光发射具有高灵敏度，相较于其他类型的荧光显微镜，有助于减少光漂白。尤为重要的是，该方法同样适用于中等到高时间分辨率的成像，这对于利用 EB3 标记方法在多种不同细胞类型中全面测量微管生长动态至关重要。

尽管利用EB3标记微管（MT）生长正端的方法相较于其他荧光标记MT的方法具有明显优势，但也存在独特的局限性。例如，在任何给定时间，部分MT阵列并不处于活跃生长状态，其中包括正在解聚的MT群体以及稳定、非动态的MT群体71-74。EB3无法标记这两类MT群体，因此它们在实验数据分析中所起的作用将不会被纳入。评估完整MT阵列的替代方法主要依赖于表达荧光标记的微管蛋白（tubulin），该蛋白可掺入所有类型的MT中，从而能够识别出正在生长、缩短或保持稳定的MT。然而，由于细胞中心区域及邻近微管组织中心（MTOC）处MT阵列的密度相对较高，对整个MT阵列进行标记会使得对远离细胞周边区域的MT末端进行图像分析变得困难75-77。在活细胞中采用荧光微管蛋白与荧光EB3双色共标记的实验已定性表明，绝大多数被微管蛋白标记的MT同时也被EB3标记78。此外，目前尚无高效的方法可对用荧光微管蛋白标记的MT进行自动追踪。这意味着在表达荧光微管蛋白的细胞中，收集MT动态数据和测量结果需要人工逐个追踪单个MT，这一过程既容易出错又十分繁琐。因此，对EB3标记的MT进行自动化计算分析已成为测量MT动态的首选方法，因其可广泛应用于多种细胞类型及不同实验条件下的MT动态研究35,79。

将微管生长动态与 HUVEC 形态及迁移相联系。
从细胞骨架研究者的角度来看，plu sTipTracker 自动追踪分析的一个极为有用的改进是能够测量和评估整个细胞以及特定区域的微管生长动态变化。细胞极化是实现定向迁移的基本前提条件。因此，极化信号通路长期以来被认为是驱动细胞定向迁移的关键因素30,31,51,54,56,80,81。例如，可溶性信号分子如 VEGF 可诱导内皮细胞中肌动蛋白聚合以及微管向 VEGF 信号源方向的生长2,82-87。此外，在响应与细胞外基质（ECM）的物理相互作用（例如对基质顺应性及维度的机械感知）时，HUVEC 通过局部调控微管相关蛋白（MAPs）来促进在延伸的分支状突起内微管的生长，从而引导 HUVEC 沿信号方向迁移5,31,88。因此，细胞对外部信号刺激产生的极化现象凸显了实验上评估细胞骨架动态局部变化的必要性。

同时对微管（MT）生长动态（使用EB3方法）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）迁移进行活细胞成像极为困难，因为微管的生长发生在秒级时间尺度上，而细胞形态变化和定向迁移则发生在小时级时间尺度上。然而，这两个过程密切相关。此外，在秒级时间尺度上对荧光标记的EB3进行连续快速成像会导致EB3信号发生光漂白。尽管通过每30分钟进行一次短时成像序列（1-2分钟采集）的方法已成功缓解这一问题，但该方法仅能在少数EB3表达水平理想且对重复激光照射无不良反应的内皮细胞（ECs）中实现5。

一种可用于解析微管（MT）生长动态如何影响细胞形态变化和迁移的替代方法是plusTipTracker感兴趣区域（ROI）工具35（见方案6.6）。该方法可将整个细胞内的微管生长轨迹按用户自定义区域进行划分，从而提取并分析特定区域内的微管生长轨迹。例如，对细胞内"分支"区域与"非分支"区域的比较发现，与非分支的细胞周边区域相比，微管在分支区域中的生长速度更慢但持续性更强5。在极化的伤口边缘HUVEC细胞中，对前缘和后缘微管生长动态的比较表明，MCAK介导的微管解聚作用特异性地在前缘受到抑制，而在后缘则不受抑制。进一步对表达Rac1和/或MCAK磷酸化突变体的HUVEC细胞前缘与后缘微管生长动态进行区域性分析发现，Rac1激活的Aurora-A激酶能够特异性且局部地抑制前缘的MCAK活性，从而促进HUVEC的极化和定向迁移31。因此，结合自动追踪微管生长动态与对伤口边缘HUVEC细胞分支突起和/或前缘区域内微管生长动态的区域性评估，使我们能够将微管生长动态与HUVEC的形态和迁移行为联系起来。

本文所述方案旨在为HUVEC的培养和实验研究提供一种通常简便且高度可重复的方法。然而，许多方案细节较为复杂且耗时，因此在实施实验方法时可能出现错误或困难。尽管在方案中已尽量指出了可能遇到的问题，但本文进一步提供了对那些较少见或在方法步骤中仅以简要注释形式提及的问题的详细故障排除建议。

与使用聚丙烯酰胺基质包被盖玻片（方案 2.2）相关的一个常见问题是，该过程涉及多个复杂步骤，包括活化玻璃盖玻片、将聚丙烯酰胺偶联至玻璃表面、活化聚丙烯酰胺，以及随后将细胞外基质（ECM）偶联至聚丙烯酰胺。其中一个特别困难且可能存在风险的步骤是在聚丙烯酰胺包被的盖玻片经 2 mM sulfo-SANPAH 处理后（如上文步骤 2.2.2.6），将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）接种至纤连蛋白/聚丙烯酰胺凝胶上。在细胞外基质偶联完成后，必须彻底清除实验体系中的 sulfo-SANPAH，这对 HUVECs 在这些基质上的成功培养至关重要。最有效的方法是使用 ddH2O 洗涤，并将盖玻片置于 ddH2O 中在摇床上孵育过夜。如果在聚丙烯酰胺-细胞外基质上培养的细胞无法存活，或细胞活力低于预期，建议在纤连蛋白偶联后（步骤 2.2.2.9）增加并重复 sulfo-SANPAH 的洗涤步骤，以期缓解此问题。

与方案3（cDNA转染及在盖玻片上培养HUVEC）相关，电穿孔实验成功的关键因素之一是在胰蛋白酶消化细胞以从塑料培养瓶中脱离细胞时，以及电穿孔完成后（上述步骤3.3–3.4）对HUVEC的处理。在胰蛋白酶处理过程中必须密切监测HUVEC，避免超过细胞脱离所需的最短时间 "汇总" 在培养瓶表面（通常为1-2分钟）。胰蛋白酶处理时间过长是导致HUVEC死亡的主要原因，这种情况通常在细胞接种至纤连蛋白包被的盖玻片（步骤3.4）后无法贴附于基质时才被发现。

同样重要的是，HUVECs（以及大多数原代细胞类型）在电穿孔缓冲液中长时间悬浮时状态不佳。在较大规模的实验中，例如当实验者需要对五个或更多条件进行电穿孔时，最好将细胞分别离心收集于独立的离心管中（每管对应一次转染），并在电穿孔前逐个将细胞与电穿孔缓冲液混合。这种方法可最大限度地缩短细胞在电穿孔缓冲液中的孵育时间，提高HUVECs的存活率。此外，电穿孔后立即用完全培养基进行复苏也至关重要。电穿孔后若延迟一分钟或更长时间才进行复苏，可能导致HUVECs几乎完全死亡，因此应避免此类延迟。

相关的细胞迁移实验（方案9）中，将HUVECs以极高密度培养的技术依赖于对传统HUVECs细胞培养方法（见方案3）的一项关键改进（见步骤9.2），该改进要求将包被纤维连接蛋白的盖玻片彻底干燥，以便使HUVECs仅在盖玻片的极小区域内生长。通常情况下，如果盖玻片未完全干燥，或先前包被纤维连接蛋白的步骤（步骤2.1或2.2）效率不足，则加在盖玻片上的含细胞培养基会失去表面张力并扩散至盖玻片边缘，从而降低盖玻片上细胞的密度。解决这一潜在问题的方法之一是吸除盖玻片上的培养基，然后将盖玻片（仍置于35 mm培养皿中）放置于生物安全柜后部，静置5–10分钟，利用安全柜内的气流辅助干燥。若风干后盖玻片表面仍可见液体残留，应吸除液滴，并再次于生物安全柜中风干5–10分钟。需要注意的是，目前尚无方法可完全避免该问题的发生，但随着对实验方案的反复操作，该问题会逐渐减少。此外，建议在准备细胞迁移实验（或一般性实验）所用盖玻片时，额外准备若干盖玻片及备用HUVECs，以应对实验过程中可能出现的问题。

在考虑这些故障排除要点的同时，还应强调所讨论方案的实用性及其对未来细胞生物学研究的意义。聚丙烯酰胺方法的应用范围广泛，不仅包括细胞-细胞外基质（ECM）相互作用的二维研究（如上所述），还包括三维研究5。该应用对于增进我们理解人脐静脉内皮细胞（HUVECs）如何在生理环境中调控细胞形态和迁移至关重要，并应为研究人员提供形态学变化如何与细胞骨架变化相协调的基本认识。尽管本文所述方案主要聚焦于微管（MT）生长动态的测量，但其中大多数方案均可并应被调整用于测量细胞-ECM相互作用中其他多种可通过显微镜观测的方面。就微管动态而言，存在大量微管相关蛋白（MAPs），包括至少14个驱动蛋白家族89，它们均可能在HUVEC极性建立和定向迁移中发挥作用，而所有这些均可利用本文提供的方案进行研究。

未来的研究还应关注正常状态与疾病状态下细胞与细胞外基质（ECM）的相互作用。本文所述的 HUVEC 实验方案适用于正常血管稳态过程的研究，也适用于包括心脏病、视网膜病变、肿瘤生长与转移等多种疾病状态的研究。将光学透明的细胞外基质与力学性能适宜的聚丙烯酰胺基底结合显微成像技术，可实现对细胞-ECM 相互作用的研究，从而以高空间和时间分辨率监测内皮细胞的血管生成过程。此类实验方法已开始揭示内皮细胞在形态、极性、迁移方面的关键差异，以及调控这些过程的蛋白质所发挥的作用5,31,90。未来的研究应致力于阐明 ECM 的力学顺应性与维度性机械感知如何协同作用，局部调控靶向并调节细胞骨架动态的蛋白质。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

特别感谢 Clare M. Waterman 博士在指导和讨论方面的帮助，感谢 Michelle Baird 和 Mike Davidson 提供了本研究中使用的多种荧光 cDNA 载体，感谢 Kathryn Applegate 和 Gaudenz Danuser 开发了用于微管分析的 plusTipTracker 软件。本工作部分由美国国家心肺血液研究所（NHLBI）和美国国立卫生研究院（NIH）向 K.A.M 提供的资助支持（资助号：4K22HL113069）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Aurora A 抑制剂 ISelleck ChemicalsS1451
2% Bis 溶液Bio-Rad1610142
3-氨基丙基三甲氧基硅烷Sigma-AldrichA3648
40% 丙烯酰胺Bio-Rad1610140
405、488、561、640 nm 高功率 MLC400 激光组合模块安捷伦科技99462
过硫酸铵Sigma-AldrichA3678
抗–小鼠IgG免疫沉淀珠TrueBlot 试剂；Rockland 公司88-1688-31
抗–兔IgG免疫沉淀 beadsTrueBlot 试剂；Rockland 公司88-7788-31
ET455/50m，DAPI-ET 发射滤光片Chroma Technology Corp.ET455/50m
ET525/36m 发射滤光片Chroma Technology Corp.ET525/36m
ET605/70m 发射滤光片Chroma Technology Corp.ET605/70m
ET700/75m 发射滤光片Chroma Technology Corp.ET700/75m
牛血清白蛋白第五组分RPI 产品A30075-100.0
Clara 冷却型电荷耦合器件相机Andor Technology77026010
Cy3 驴抗兔杰克逊免疫研究实验室711-165-152
DPBS赛默飞世尔科技14190250
Dyelight 649 标记的山羊抗大鼠Jackson ImmunoResearch112-496-068
EGM-MV SingleQuot 供应 &和生长因子（内容如下）LonzaCC-4143
胎牛血清 25 ml
牛脑提取物 2.0 ml
硫酸庆大霉素 0.5 ml
表皮生长因子 0.5 ml
氢化可的松 0.5 ml
青霉素/链霉素（10,000 IU 青霉素/ml，10,000 µg Strep/ml  10.0 ml
EGTASigma-AldrichE3884-100G
电子快门Sutter 仪器77016099
纤连蛋白EMD MilliporeFC010
戊二醛赛默飞世尔科技S80026
HALT蛋白酶抑制剂赛默飞世尔科技PI-78425
HEPESSigma-AldrichH4034
HRP标记的山羊抗小鼠杰克逊免疫研究实验室115-036-062
HRP标记山羊抗兔杰克逊免疫研究实验室111-036-045
免疫印迹PVDF膜Bio-Rad162-0174
羊毛脂赛默飞世尔科技8006-54-0
硫酸镁Sigma-AldrichM2643-500G
显微镜尼康 TiEMEA53100
电动载物台ASI TechnologiesMS-2000
封片剂DakoCS70330-2
小鼠抗Aurora AAbcamab130156
小鼠抗GAPDHAbcamab9484
小鼠抗MCAKAbcamab50778
小鼠抗微管蛋白（DM1A）细胞信号技术公司3873S
指甲油电子显微镜科学公司72180
NIS Elements 软件尼康MQS310000
Nucleofector V 试剂盒LonzaVACA-1003含有电穿孔缓冲液
石蜡赛默飞世尔科技P31-500
青霉素-链霉素（10,000 IU 青霉素/ml，10,000 µg Strep/mlMP Biomedicals91670249
凡士林道康宁2021854-1113
管道Sigma-AldrichP6757-100G
plusTipTracker
兔抗GFPAbcamab290
兔抗–pT288–Aurora AAbcamab18318
大鼠抗–α-tubulinAbD SerotecMCA78G
硼氢化钠赛默飞世尔科技678-10
旋转盘 Andor TechnologyYokagawa CSU-X1
Sulfo-SANPAH赛默飞世尔科技PI-22589
SuperSignal West Pico 化学发光底物赛默飞世尔科技34080
Triton X-100赛默飞世尔科技BP151-500
胰蛋白酶康宁MT25053CI
Tween-20赛默飞世尔科技BP337

参考文献

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