详细描述小鼠C1498细胞系及其相关白血病小鼠模型的实验方案

摘要

本文提供了一种可用于表征C1498细胞培养的技术流程 体外 以及小鼠注射后诱导的急性白血病。通过流式细胞术、免疫荧光显微镜、细胞化学和May-Grünwald Giemsa染色进行表型和功能分析。

摘要

自1941年以来，已开展将C1498细胞通过静脉注射注入同源或同源背景小鼠的研究。此类注射可导致急性白血病的发生。然而，该疾病的具体性质在现有文献中尚未得到充分描述。本文提供了一项用于表征C1498细胞的技术方案。 体外 并确定所诱导白血病的性质 体内该实验的第一部分旨在确定培养的C1498细胞的造血谱系及其分化阶段。为此，采用多参数流式细胞术染色检测造血细胞标志物。随后通过免疫荧光显微镜、细胞化学染色以及May-Grünwald Giemsa染色，分别评估髓过氧化物酶的表达、酯酶活性及细胞形态。本方案的第二部分重点描述所诱导的白血病疾病 体内后者可通过测定血液和造血器官中白血病细胞与固有细胞的频率来实现例如、骨髓和脾脏）以及非淋巴组织（例如，肝脏和肺）进行特异性染色和流式细胞术分析。随后通过骨髓的迈-格染色（May-Grünwald Giemsa staining）和特异性酯酶染色来确认白血病的性质。本文展示了在年龄匹配的C1498细胞注射小鼠与PBS注射小鼠中应用该方案所获得的结果。

引言

急性髓系白血病（AML）的特征是造血髓系细胞不受控制地增殖，并在不同成熟阶段受阻。这种失调可能影响粒细胞、单核细胞、红细胞或巨核细胞的分化通路¹。AML细胞在骨髓中积聚，导致造血功能受损，进而引起血小板减少、淋巴细胞减少和贫血。白血病细胞还可侵入血液和非淋巴器官。

C1498 小鼠模型数十年来一直被用作急性白血病的模型，因为该模型的癌细胞于1941年从一只患有白血病的10月龄C57BL/6（H-2^b）雌性小鼠中分离得到。文献报道，将高度增殖的C1498细胞通过静脉、皮下或腹腔注射途径注入易感小鼠后，这些细胞会侵袭血液、造血器官（例如，脾脏和淋巴结）以及非造血器官（例如，肝脏、肺、卵巢和肾脏）^2-4。然而，有研究报道该小鼠模型可诱导粒细胞性^2,5或粒单核细胞性⁶白血病。更近的一项发表于2002年的研究将此类癌症描述为小鼠NKT细胞白血病⁷。因此，关于C1498细胞系的性质及其在小鼠中所诱导的白血病类型，现有文献存在分歧。这些差异主要源于总体上缺乏针对该细胞及其所引起的白血病疾病的详细且最新的公开信息，因为许多相关研究是在20世纪50至70年代完成的。

本文提供了一项详细实验方案，用于描述如何对C1498细胞进行表征，并分析通过尾静脉注射C1498细胞至小鼠体内所诱导的白血病疾病的特性。本方案的第一部分重点描述体外培养的C1498细胞 体外使用针对表面和细胞内造血标志物的荧光标记抗体，通过流式细胞术分析其表型。采用免疫荧光显微镜检测髓过氧化物酶（myeloperoxidase）的存在，并通过酯酶活性的细胞化学染色评估细胞的造血谱系及分化阶段，同时进行May-Grünwald Giemsa染色。随后将C1498细胞注射入小鼠体内，所诱导的急性白血病模型在本文第二部分中予以描述。采用相同的技术方法检测骨髓、外周血、脾脏以及非造血器官（肝脏和肺脏）中白血病细胞及固有细胞的频率与表型。

该方案具有高度可重复性，本文提供的数据将有助于研究人员评估新治疗策略的效果。该白血病小鼠模型已用于测试免疫治疗方案以及多种癌症化疗药物^8,9。其疗效通过测定肿瘤负荷的演变和生存率进行评估。本方案可用于在治疗过程中进一步了解白血病细胞及其他造血细胞群体的分布与存续情况。

方案

动物饲养及所有实验程序均经当地动物护理伦理委员会 CEEA.NPDC（许可编号 512012）批准，所有实验均依照法国及欧洲关于实验动物护理与使用的指南进行。

1. 体外 C1498细胞系的表征

1. 体外培养 C1498 细胞
   1. 通过向 500 ml RPMI 培养基中加入 50 ml 胎牛血清（FBS）、5 ml 青霉素（100 U/ml）-链霉素（100 µg/ml）、500 µl 50 mM β-巯基乙醇、5 ml N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、5 ml 非必需氨基酸和 5 ml 丙酮酸钠，配制完全 RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640 培养基。
   2. 在完全 RPMI 培养基中培养 C1498 细胞系。用移液器吹打收集悬浮细胞，并转移至 50 ml 离心管中。以 350 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。
   3. 加入 20 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）（1×）溶液，以 350 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。
   4. 将细胞重悬于 10 ml 流式细胞分选缓冲液（FACs 缓冲液）中（500 ml PBS 溶液中含 2.5 g 牛血清白蛋白（BSA）粉末和 2 ml 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液）。用台盼蓝染色后，使用 Thoma 细胞计数板对细胞进行计数。
2. 利用免疫染色和流式细胞术分析对 C1498 细胞系进行表型鉴定
   1. 细胞表面染色
      1. 配制 FACs 缓冲液。
      2. 将收获的细胞用 FACs 缓冲液调整至 10⁷ 个细胞/ml，并将 10⁶ 个细胞（100 µl）分装至各流式细胞管中，用于每项染色实验。
      3. 用以下抗体或其相应的同型对照抗体（用 FACs 缓冲液稀释后）100 µl 对细胞进行标记：
         1. 对于前体细胞和分化细胞的标志物，使用抗 CD11b/抗 CD18（1）、抗 Ly-6G（1）、抗 CD19、抗 B220（2）、抗 NK1.1、抗 CD49b、抗 CD4（1）、抗 CD8（2）、抗 CD3（3）、抗 CD21/35、抗 CD115 和抗 TCRVβ 抗体对细胞进行标记。
         2. 对于造血干细胞/祖细胞标志物，单独使用抗 CD34/抗 CD117/抗 Sca-1、抗 CD150/抗 CD117/抗 Sca-1、抗 CD117/抗 CD127 或抗 CD16/32-生物素抗体的组合。
         3. 对于细胞功能标志物（例如，黏附、抗原呈递、共刺激分子和受体），使用抗 CD18（2）/抗 CD11a、抗 MHC I 类、抗 MHC II 类、抗 CD31、抗 CD44、抗 CD80-生物素、抗 CD86 和抗 CD274 抗体对细胞进行染色。
      4. 将所有流式细胞管在 4 °C 下孵育 30 分钟。
      5. 向每管中加入 2 ml FACs 缓冲液，洗涤细胞两次：以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
      6. 向每管中加入 100 µl FACs 缓冲液，并加入 100 µl 荧光标记的链霉亲和素（在 FACs 缓冲液中稀释至 1/100，最终稀释度为 1/200），对生物素偶联抗体进行二抗染色。将管子在 4 °C 下孵育 30 分钟。
      7. 洗涤细胞两次：向每管中加入 2 ml FACs 缓冲液，以 350 × g 离心 5 分钟，用移液器吸弃上清液。
      8. 将细胞重悬于 500 µl 冷 PBS 中，将管子置于冰上，并用铝箔包裹以避光。使用流式细胞仪¹⁰分析结果。
   2. 胞内染色
      1. 通过将 125 ml 4% 多聚甲醛（PFA）溶液加入 375 ml PBS 溶液中，配制固定缓冲液。
         注：配制 500 ml 4% PFA 溶液时，将 400 ml PBS 溶液置于通风橱中的搅拌器上加热至约 60 °C。加入 20 g PFA 粉末，并调节 pH 值直至 PFA 溶解。待溶液冷却后，调节 pH 至 6.9，并用 PBS 定容至 500 ml。
      2. 通过将 0.5 g 皂苷和 0.5 g BSA 加入 500 ml PBS 溶液中，配制透化缓冲液。
      3. 将收获的细胞用 FACs 缓冲液调整至 10⁷ 个细胞/ml，并将 10⁶ 个细胞（100 µl）分装至各流式细胞管中，用于每项染色实验。以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
      4. 用 200 µl 1% PFA 溶液固定细胞，在 4 °C 下孵育 10 分钟。
      5. 向每管中加入 2 ml 透化缓冲液，以 350 × g 离心 5 分钟，用移液器吸弃上清液。向每管中加入 100 µl 透化缓冲液。
      6. 将以下抗体或其相应的同型对照抗体用透化缓冲液稀释后，加入 100 µl 对细胞进行标记：抗 CD3（2）/抗 CD8（1）、抗 CD3（3）/抗 CD4（2）、抗 CD107b 和抗 CD3（3）/抗 TCRVβ。
      7. 在 4 °C 下孵育细胞 30 分钟。
      8. 向每管中加入 2 ml 透化缓冲液，洗涤细胞两次。以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
      9. 向细胞中加入 100 µl 透化缓冲液。加入用透化缓冲液稀释的 100 µl 荧光标记链霉亲和素，对生物素偶联抗体进行二抗染色。将管子在 4 °C 下孵育 30 分钟。
      10. 向每管中加入 2 ml 透化缓冲液，以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。
      11. 将细胞重悬于 500 µl 冷 PBS 中，然后置于冰上避光保存。使用流式细胞仪¹⁰分析结果。
3. 制备用于显微镜观察的细胞悬液涂片
   1. 用 5 ml 冷 FACs 缓冲液将第 1.1.4 步获得的 10⁶ 个收获的 C1498 细胞洗涤两次，然后将细胞稀释于 1 ml 冷 FACs 缓冲液中。将管子置于冰上。
   2. 将载玻片放入带有预附滤纸的一次性染色缸中，并将染色缸放入细胞离心机中。
   3. 向每个染色缸和滤纸中加入 100 µl FACs 缓冲液，以 4.52 × g 离心 2 分钟。
   4. 向每个染色缸和滤纸中加入 100 µl 细胞悬液，以 4.52 × g 离心 2 分钟。
   5. 小心地从染色缸中取出载玻片，在进行髓过氧化物酶染色（第 1.4 步）、酯酶染色（第 1.5 步）或 May-Grünwald Giemsa 染色（第 1.6 步）前将载玻片空气干燥。
4. 免疫荧光法髓过氧化物酶染色
   1. 将载玻片浸入冷甲醇：丙酮（1:1）溶液中 2 分钟，以固定载玻片上的细胞，然后空气干燥载玻片。
   2. 使用疏水笔在细胞周围画圈，以限制液体在含细胞区域的扩散。
   3. 用 200 µl 冷 PBS 溶液冲洗细胞 10 分钟。
   4. 用含 10 µl 正常驴血清和 10 µg/ml 纯化抗 CD16/32 抗体的 200 µl 3% BSA/PBS 缓冲液封闭细胞。
   5. 加入 200 µl 抗小鼠髓过氧化物酶抗体（用 3% BSA/PBS 缓冲液稀释至 20 µg/ml）。在湿盒中 4 °C 过夜孵育细胞。
   6. 用 200 µl 冷 0.1% BSA/PBS 洗涤细胞。
   7. 加入 200 µl 抗山羊 IgG 抗体（用 3% BSA/PBS 缓冲液稀释至 1/250）。在湿盒中室温孵育 2 小时。
   8. 用 200 µl 0.1% BSA/PBS 缓冲液洗涤细胞 3 次，再用冷 PBS 洗涤 2 次。
   9. 用 200 µl Hoechst 染色液（用 PBS 稀释至 1/1,000，终浓度为 1 µg/ml）在室温下染色细胞核 2 分钟。
   10. 用清水洗涤载玻片，空气干燥后封片。在细胞上滴加一滴封片剂 1，将盖玻片的一边置于载玻片上，用镊子小心地将其缓缓放下覆盖在细胞上。轻轻按压盖玻片以去除气泡。
5. 酯酶细胞化学
   注：将所有试剂预热至室温。
   1. 固定液配制
      1. 配制柠檬酸-丙酮-甲醛（CAF）溶液：将 2.5 ml 柠檬酸溶液、6.5 ml 丙酮和 0.8 ml 37% 甲醛加入玻璃瓶中。轻轻混匀，4 °C 保存。
   2. 萘酚 AS-D 氯乙酸酯酶（CAE）活性检测
      1. 将去离子水加热至 37 °C。
      2. 在 50 ml 管中，将 1 ml 亚硝酸钠溶液加入 1 ml 染料溶液中。轻轻混匀，静置 2 分钟。加入 40 ml 预热的去离子水、5 ml pH 6.3 缓冲液浓缩液和 1 ml 萘酚 AS-D 氯乙酸酯溶液。混匀后转移至 Coplin 染色缸中。
      3. 用 CAF 溶液（见第 1.5.1.1 步）固定载玻片上的细胞（见第 1.3 节）30 秒，然后用去离子水冲洗 45 秒。
      4. 将载玻片转移至第 1.5.2.2 步配制的溶液中，在避光湿盒中 37 °C 孵育 30 分钟。
      5. 干燥载玻片，然后将其浸入去离子水中冲洗 2 分钟。
      6. 滴加数滴苏木精溶液对细胞进行复染，孵育 1 分钟。
      7. 用中性水（pH 7）洗涤载玻片，空气干燥。在细胞上滴加一滴封片剂 2，将盖玻片的一边置于载玻片上，用镊子小心地将其缓缓放下覆盖在细胞上。轻轻按压盖玻片以去除气泡。
   3. α-萘酚丁酸酯酶（NBE）活性检测
      1. 使用前将 α-萘酚丁酸酯溶液预热至 37 °C。
      2. 将一片亚硝酸钠片剂溶于 6.25 ml 去离子水中。
      3. 在 50 ml 管中，加入 1.5 ml 亚硝酸钠片剂溶液和 1.5 ml 副品红溶液。轻轻混匀，静置 5 分钟。加入 40 ml 磷酸盐缓冲液。逐滴小心加入 10 N NaOH 调节 pH 至 6。加入 5 ml α-萘酚丁酸酯溶液，混匀全部溶液，转移至 Coplin 染色缸中。
      4. 在室温下用 CAF 溶液固定载玻片上的细胞 10 秒，然后用去离子水冲洗 45 秒。
      5. 将载玻片转移至含有第 1.5.3.2 步配制溶液的 Coplin 染色缸中，在避光湿盒中 37 °C 孵育 1 小时。
      6. 用中性水（pH 7）冲洗载玻片 2 分钟，空气干燥。
      7. 滴加数滴亚甲蓝溶液对细胞进行复染，孵育 4 分钟。
      8. 将载玻片浸入去离子水中 2 分钟，空气干燥。封片时，在细胞上滴加一滴封片剂 2，将盖玻片的一边置于载玻片上，用镊子小心地将其缓缓放下覆盖在细胞上。轻轻按压盖玻片以去除气泡。
6. May-Grünwald Giemsa（MGG）染色
   1. 将第 1.3 节制备的细胞进行染色：将载玻片浸入含 May-Grünwald 溶液的 Coplin 染色缸中 3 分钟。
   2. 将载玻片转移至含 pH 6.8 缓冲液的 Coplin 染色缸中 1 分钟。
   3. 将载玻片放入含 Giemsa R 溶液（用 pH 6.8 缓冲液稀释至 1/20）的 Coplin 染色缸中染色 10 分钟。用中性水（pH 7）洗涤 10 秒。
   4. 沥干并空气干燥载玻片。封片时，在细胞上滴加一滴封片剂 2。将盖玻片的一边置于载玻片上，用镊子小心地将其缓缓放下覆盖在细胞上。轻轻按压盖玻片以去除气泡。

2. 在体 内 急性白血病的开发与表征

注意：四周龄雌性同源C57BL/6J-Ly5.1小鼠在无特定病原体条件下（i.e., 无菌环境）饲养。小鼠在5至6周龄期间进行注射。

1. 静脉注射 C1498 细胞
   1. 用移液器收集悬浮培养的C1498细胞，转移至50 mL离心管中，在350 × g下离心10分钟。用10 mL冷的PBS洗涤细胞两次，制备成10⁷个细胞/mL的细胞悬液⁷ 细胞/ml 的 PBS 悬液。注射前将细胞悬液置于冰上。
   2. 将小鼠置于固定器中，并在超净工作台内无菌条件下进行注射。
   3. 使用29G针头连接注射器，将细胞注入尾静脉。抓住尾部远端，用浸有70%乙醇的纱布擦拭消毒。检查注射器内是否有气泡，确认无气泡后，缓慢注射100 µl C1498细胞悬液（10⁶ 尾静脉注射细胞。
   4. 注射完成后，将针头从尾部拔出，并用无菌纱布在注射部位按压以止血。将动物放回笼中，并在接下来的数小时至数天内密切观察其健康状况。
2. 眼眶后采血
   1. 监测PBS和C1498注射小鼠的行为，观察白血病疾病的迹象（例如毛发竖立、脱离群体、在笼内活动减少或无活动。
      注意：这通常发生在细胞注射后17至19天之间。
   2. 在安乐死前（见步骤2.2.7），于超净台内无菌条件下，在加热灯下进行眼后窝采血，以防止低体温。
   3. 麻醉时使用 150 mg/kg 的氯胺酮和 10 mg/kg 的赛拉嗪。通过将 1.5 ml 氯胺酮和 0.5 ml 赛拉嗪溶于 18 ml PBS 溶液中来配制麻醉剂溶液。
   4. 麻醉对照组和白血病小鼠。使用26G针头和1 ml注射器，按每10 g小鼠体重腹腔注射200 µl麻醉溶液。通过检查足底反射消失确认麻醉效果。
   5. 将毛细管插入眼睛的内眼角。血液会从眶窦流入毛细管中。用无菌纱布轻轻按压眼部以控制出血。
      注意：使用该技术可采集100至200 µl的血液。
   6. 将血液收集至含EDTA的试管中，在分离单个核细胞前将样本置于冰上保存。
   7. 采用颈椎脱位法处死小鼠，随后进行器官分离（第2.3节）。
3. 器官与细胞分离
   1. 器官分离
      1. 将安乐死的小鼠仰卧置于塑料板上，用针固定动物四肢以方便器官分离。在进行切口前，使用70%乙醇对小鼠消毒。
      2. 使用无菌剪刀，从腹部皮肤向颈部做腹侧切口。切开腹壁以暴露肝脏。剪开肋骨和膈肌以暴露肺脏。将肠道移至一侧，使用无菌剪刀和镊子取出脾脏。
      3. 为分离骨髓，使用无菌剪刀在关节上方股骨顶端处剪断腿部。轻轻拉扯使胫骨与股骨分离，并用镊子和剪刀去除骨骼上的皮肤和肌肉。
      4. 将每个器官和骨骼置于含有冷PBS的50 ml离心管中，并置于冰上。
   2. 从器官中分离细胞
      1. 称重脾脏后再进行细胞破碎。将脾脏、肺和肝脏通过50 ml离心管中的70 µm细胞筛，使用注射器活塞进行机械破碎，并将细胞收集至30 ml冷PBS中。
      2. 为收集骨髓细胞，将股骨和胫骨置于冰上的培养皿中，使用无菌剪刀剪去骨两端，然后插入连接含有5 ml冷PBS的10 ml注射器的26G针头，冲洗骨髓。
         1. 通过针头/注射器反复吹打使骨髓细胞充分解离，然后将细胞悬液经70 µm细胞滤网过滤至50 ml离心管中。
      3. 将所有含有各器官和骨髓细胞的离心管在350 × g下离心10分钟。弃去上清液，用移液器轻轻吹打，将肺和骨髓中收集的细胞重悬于2 ml裂解缓冲液（1×）中，将肝脏和脾脏中分离的细胞重悬于5 ml裂解缓冲液（1×）中。用预冷的PBS将各离心管补至50 ml。
      4. 以 350 × g 离心 10 分钟。将细胞重悬于 FACs 缓冲液中，用于流式细胞术分析或显微镜样品制备。用台盼蓝染色后，使用托马细胞计数板对细胞进行计数。
4. 器官来源细胞的流式细胞术分析细胞表面染色
   1. 在流式细胞术管中，标记10⁶ 使用100 µl FACs缓冲液中含10 µg/ml纯化抗CD16/32抗体从器官中分离的细胞。
   2. 10⁶ 骨髓细胞，加入100 µl以下抗体或抗体组合及其相应的同型对照，用FACs缓冲液稀释：抗CD11b/抗CD3(1)/抗Ly6C/抗Ly6G(2)、抗B220(1)/抗CD45.2/抗CD19、抗CD115/抗CD3(1)/抗Ly6C/抗Ly6G(2)、抗CD45.2、抗Ly6G(2)、抗CD11b、抗CD115或单独抗CD19，用于补偿设置。
   3. 向脾细胞中加入100 µl用FACs缓冲液稀释的以下抗体及其相应的同型对照：用于补偿设置的抗体组合包括anti-CD11b/anti-CD3(1)/anti-Ly6C/anti-Ly6G(2)、anti-B220(1)/anti-CD45.2/anti-CD19、anti-CD45.2、anti-Ly6G(2)、anti-CD11b或anti-CD19。
   4. 向肺细胞和肝细胞中加入 100 µl 抗-CD45.2 抗体及其相应的同型对照抗体，用 FACs 缓冲液按 1:100 稀释。
   5. 将所有细胞溶液在 4 °C 下孵育 30 分钟。
   6. 向每管中加入 2 ml FACs 缓冲液洗涤细胞。在 350 × g 条件下离心 5 分钟，用移液器吸弃上清液。重复此步骤一次。
   7. 将标记的细胞重悬于500 µl预冷的PBS中。在进行流式细胞术采集与分析前，将细胞置于冰上并避光保存。¹⁰.
5. 血液单个核细胞的分离及用于流式细胞术分析的免疫荧光染色
   1. 在开始实验方案之前，将分离液预热至室温。
   2. 将血液样本（100 至 200 µl，来自步骤 2.2）转移至微量离心管中，加入 PBS/1 mM EDTA 溶液，使溶液总体积达到 500 µl。使用 30G 针头和 1 ml 注射器，将 500 µl 分离液小心地铺在含血液的溶液下方。切勿混合血液与分离液。
   3. 在室温下以800 × g离心20分钟（不启用刹车）。离心后，用移液器收集细胞环（不透明的白色层），并将细胞转移至微量离心管中。
      注意：不透明的白色层含有淋巴细胞以及单核细胞，位于下层（分离液）与上层之间。
   4. 加入1 ml PBS溶液，将离心管在350 x g下离心10分钟。用600 µl FACs缓冲液重悬细胞。
   5. 加入10 µg/ml的纯化抗CD16/32抗体，将100 µl细胞悬液分装至六个独立的试管中（每管100 µl）。
   6. 使用FACs缓冲液将以下抗体或相应的同型对照稀释后，各取100 µl标记细胞：用于补偿设置的抗体组合包括anti-CD3 (1)/anti-B220 (1)/anti-CD45.2，或anti-Ly6C/anti-CD115/anti-CD45.2，或单独使用anti-CD45.2和anti-CD115。
   7. 将所有试管在 4 °C 下孵育 30 分钟。
   8. 向每管中加入 2 ml FACs 缓冲液洗涤细胞，然后以 350 × g 离心 10 分钟，用移液器弃去上清液。
   9. 将标记的细胞重悬于500 µl预冷的PBS中。在进行流式细胞术检测与分析前，将细胞置于冰上并避光保存。¹⁰.
6. 制备用于显微镜观察的骨髓细胞悬液涂片
   1. 按照第1.3节所述步骤操作，但在1.3.1步骤中，使用10⁵ 骨髓细胞，并在步骤1.3.4中以72.26 × g离心10分钟，使细胞沉入各腔室。
7. 使用骨髓细胞进行酯酶活性检测
   1. 进行骨髓酯酶细胞化学检测时，按步骤1.5至1.5.3.7操作。
8. 骨髓细胞的May-Grünwald Giemsa染色
   1. 对骨髓细胞进行染色时，遵循第1.6节所述方案，但在步骤1.6.1中，将载玻片在May-Grünwald溶液中孵育5分钟。

结果

为了表征C1498小鼠模型，我们进行了两个主要步骤。首先，对C1498细胞进行表征，以确定其造血谱系及成熟阶段 体外 (图1随后将这些细胞注射到同源品系小鼠体内，并评估所诱导的白血病特征，包括：白血病细胞浸润情况、细胞表型、骨髓中造血细胞（成熟细胞及祖细胞/前体细胞）的定量分析、血液中C1498细胞与成熟造血细胞的频率，以及器官肿胀（脾脏、肝脏和肺脏）程度和细胞组成的评估。

表征 C1498 细胞表型 体外，细胞使用针对造血前体细胞和成熟细胞所表达分子的抗体进行标记（表1），并通过流式细胞术分析结果。C1498细胞在细胞表面表达Mac-1（CD11b/CD18）呈阳性∼ 7%），B220（> 25%），且表现出CD3的胞内表达ε，T细胞受体（TCR）Vβ 链和 Mac-3（图2A和B）。这些细胞对细胞表面标志物 Ly6G、Ly6C、CD115、CD21/CD35、CD19、CD3、CD4、CD8、NK1.1 和 pan-NK 分子呈阴性，且胞内不表达 CD4 和 CD8（数据未显示）。随后检测其造血干细胞及祖细胞标志物的表达情况（表1）。它们在细胞表面不表达 CD117、CD34、Sca-1、CD150 和 CD16/32（数据未显示）。随后检测这些白血病细胞的黏附分子、抗原呈递分子及共刺激分子的表达情况。结果显示，这些细胞表达表面标志物 LFA-1（CD11a/CD18）、CD44、CD31（PECAM-1）和 H-2D^b 且对MHC II类分子、CD80、CD86和CD274呈阴性（数据未显示）。因此，C1498细胞同时表达髓系（Mac-1、Mac-3）和淋巴系标志物（B220、CD3、TCR）。

为了更准确地表征其造血谱系，采用免疫荧光显微镜检测了髓过氧化物酶的表达。所有细胞均呈髓过氧化物酶阳性，证实了其髓系来源（图3A）。大部分细胞对α-丁酸萘酯酶染色呈阳性（图3B，左图），部分细胞对AS-D氯乙酸萘酚酯酶染色呈阳性（黑色箭头）（图3B，右图）。结果表明，这些细胞包含单核细胞系和粒细胞系的混合物。经May-Grünwald Giemsa染色后，观察到C1498细胞呈现类似原始细胞的形态，具有较高的核质比，细胞核内含有3至5个核仁，存在核周晕环，细胞质中可见大量空泡，且细胞质呈嗜碱性（图3C）。因此，C1498细胞系由单核母细胞和髓母细胞组成。

随后将C1498细胞（CD45.2⁺）通过静脉注射注入CD45.1⁺小鼠体内。小鼠在细胞注射后17至19天内出现濒死状态。为在小鼠因疾病死亡前分析其白血病类型，对其实施安乐死。同时对注射PBS的对照组小鼠在相同时间点进行分析以作比较。C1498细胞注射小鼠的骨髓中出现大量C1498细胞浸润，经May-Grünwald Giemsa染色后可见细胞呈现类似原始细胞的形态（图4A）。这些细胞还保留了单核细胞和粒细胞表型（图4B和C），表现为单核母细胞和髓系母细胞的积聚，符合急性粒-单核细胞白血病的特征。

为了确定白血病细胞浸润后骨髓造血细胞数量是否降低，使用免疫荧光染色和多参数流式细胞术分析，对CD45.2⁺ C1498细胞、B淋巴细胞、单核细胞和粒细胞群体（包括前体细胞、前驱细胞和成熟细胞）进行了定量。白血病细胞占造血细胞的16%至36%（数据未显示）。在C1498细胞注射小鼠中，其他各类细胞的数量均显著低于PBS注射小鼠（B细胞亚群平均减少5倍，粒细胞平均减少4倍，单核细胞亚群平均减少3倍）（图5A至C）。

对白血病小鼠和对照小鼠血液样本中单核细胞频率的研究显示，两者所含淋巴细胞的比例相近（图6A但单核细胞和白血病细胞的频率更高。这些特征具有急性粒-单核细胞白血病的代表性¹¹ (图6B).

急性粒单核细胞白血病的其他特征之一¹²是，接种C1498细胞的小鼠出现肝脏肿大（肝肿大）、肺脏和脾脏肿大（脾肿大）（图7A）。通过免疫荧光染色和流式细胞术分析，在这些器官中检测到不同频率的CD45.2⁺ C1498细胞（图7B）。由于脾肿大可能由大量浸润的单核细胞引起，我们还估算了脾脏中各细胞群体的比例。与对照组脾脏相比，白血病脾脏中B淋巴细胞、单核细胞和粒细胞组分的细胞数量分别平均增加了2倍、2.5倍和3倍（图7C）。

图1. 用于表征的实验方案设置示意图 体外 培养的 C1498 细胞系和 体内 急性白血病的描述。 首先确定体外培养的C1498细胞的造血谱系及其分化阶段。随后将C1498细胞注射至同源性小鼠体内，以诱导急性白血病的发生。通过分离骨髓、外周血、脾脏、肝脏和肺组织，分析C1498细胞浸润后的细胞频率、表型及形态学变化。 IV：静脉注射 MGG：瑞氏-吉姆萨染色. 请点击此处查看此图的放大版本。

图2. C1498细胞表型分析 体外 培养 代表性流式细胞术细胞表面点图和直方图 （A） 和细胞内（B) 与造血成熟细胞分化相关的C1498表达分子如图所示。收集C1498细胞培养物中的细胞，洗涤后使用针对细胞表面CD11b、CD18和B220标志物或其同型对照的荧光标记抗体进行标记。对于细胞内染色，细胞经固定、透化处理后，使用抗Mac-3和CD3抗体进行标记。ε，以及T细胞受体（T-Cell Receptor）V的共同表位β 链或其同型对照。分析时采用活细胞设门进行。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图3. 培养的C1498细胞的功能与形态学表征。从培养物中收获C1498细胞，并通过离心涂片后进行显微镜观察。（A） 采用免疫荧光法检测髓过氧化物酶的表达。（B） 采用细胞化学反应分析C1498细胞中α-萘丁酸酯酶（NBE）和萘酚AS-D氯乙酸酯酶（CAE）的活性。当观察到胞质中出现棕色或紫红色的大颗粒时，分别判定为相应染色阳性。（C） C1498细胞的May-Grünwald Giemsa（MGG）染色。每次染色实验均标明显微镜物镜的放大倍数。每张图像均代表三次独立实验的结果。 请点击此处查看该图的高清版本。

图4. PBS注射与C1498细胞注射小鼠的骨髓形态学。 从小鼠骨髓中分离出PBS注射组和C1498细胞注射组的骨髓细胞，并通过离心涂片后进行显微镜观察。(A) 使用May-Grünwald Giemsa（MGG）染色；(B) α-萘丁酸酯酶（NBE）染色；(C) 萘酚AS-D氯乙酸酯酶（CAE）染色，通过细胞化学方法评估酶活性。在A图中，与PBS注射小鼠相比，C1498注射小鼠骨髓中的杆状核（未成熟）或分叶核（成熟）中性粒细胞可见性降低。B图和C图表明，与对照组骨髓相比，白血病骨髓中单核细胞系和粒细胞系细胞出现积聚现象。所有显微镜分析均使用100倍物镜进行。请点击此处查看该图的放大版本。

图5. PBS注射与C1498注射小鼠中骨髓细胞群体的定量分析。 从小鼠骨髓中分离PBS注射组和C1498细胞注射组的骨髓细胞，并在完成细胞计数后进行估算。不同细胞群体的频率通过免疫染色及活细胞门控流式细胞术分析确定。(A) B细胞亚群包括从早前B细胞至成熟B淋巴细胞各阶段的CD19⁺B220⁺细胞；(B) 粒细胞为CD3^-和CD11b⁺Ly6G⁺谱系细胞，包含前体细胞以及未成熟和成熟的粒细胞；(C) 单核细胞亚群定义为CD3^-CD115⁺，包括从祖细胞至成熟单核细胞各阶段的细胞。每组n = 7只小鼠，数据以均值±标准误的柱状图形式表示。***，p< 0.0001；**，p< 0.01，采用非配对Student's t-检验比较PBS注射组与C1498注射组小鼠。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6. PBS 和 C1498 注射小鼠外周血单个核细胞亚群的分析。代表性流式细胞术点图显示（A） T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞的比例，分别定义为 PBS 和 C1498 细胞注射小鼠中的 CD3⁺ 和 B220⁺ 细胞。（B） 通过分析 CD115⁺Ly6C^- 和 CD115⁺Ly6C^high 细胞，确定 C1498 白血病小鼠和对照（PBS）小鼠中单核细胞的频率。分析时首先圈选活细胞，并在比较白血病小鼠与对照小鼠时排除 CD45.2⁺ C1498 细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

图7. 白血病小鼠与对照小鼠脾脏细胞群体的估算。（A） 白血病小鼠与对照小鼠肝脏、肺和脾脏肿大的代表性照片。收集脾脏并称重，组织消化后计数脾细胞。 （B） CD45.2免疫染色后不同器官中白血病细胞频率的直方图⁺ 细胞，并通过流式细胞术分析结果。 （C） 免疫染色及流式细胞术分析设门后对脾脏B细胞、粒细胞及单核细胞数量的估算用于鉴定活CD19⁺B220⁺，CD3^-CD11b⁺Ly6G⁺，CD3^-CD11b⁺Ly6C^- 和 CD3^-CD11b⁺Ly6C^高 细胞。肺、脾和肝的标尺长度为1 cm。每组 n = 5 - 8 只小鼠，数据以柱状图表示为均值 ± 扫描电子显微镜 *, p< 0.05; **, p = 0.0033，非配对 t 检验 t-PBS 注射小鼠与 C1498 注射小鼠的比较实验。 请点击此处以查看此图的放大版本。

细胞类型	膜表面或细胞内分子
前体细胞与成熟细胞
NK细胞	NK1.1+, pan-NK+
NKT细胞	NK1.1+, pan-NK+, TCR Vbeta+(8.2), CD3+
T淋巴细胞	TCR Vbeta+, CD3+, CD4+, CD8+
B细胞前体与B淋巴细胞	B220+, CD19+, CD21/35+
粒细胞前体与粒细胞	Ly6G+, Mac-1+, CD11b+
单核细胞前体与单核细胞/巨噬细胞	CD11b+, Mac-1+, Mac-3+, CD21/35+, CD115+, Ly6Chi
祖细胞
多能祖细胞	CD117+ Sca-1+ CD34+ (Lin- CD150-)
淋巴系倾向性多能祖细胞	CD117hi Sca-1hi CD127+ (Lin- )
共同淋巴系祖细胞	CD117lo Sca-1lo CD127+ (Lin- )
共同髓系祖细胞	CD16/32lo CD117+ CD34int (Lin- Sca-1-)
粒细胞-巨噬细胞祖细胞	CD16/32hi CD117+ CD34hi (Lin- Sca-1-)
巨核细胞-红细胞祖细胞	CD16/32lo CD117+ CD34lo (Lin- Sca-1-)
造血干细胞	CD117+ Sca-1+ CD150+ (Lin- CD34-)

表1. 造血细胞谱系及分化标志物。
CD：分化簇；Lin：成熟细胞标志物；lo：低表达；hi：高表达；int：中等表达；NK：自然杀伤细胞；TCR：T细胞受体。

讨论

在以往的研究中，C1498细胞系被描述为可诱导急性粒细胞性⁵、粒单核细胞性⁶或NKT⁷细胞白血病的细胞系。然而，文献中支持这些结论的数据要么缺失，要么不完整。本方案采用多种技术，如流式细胞术、免疫荧光、MGG染色和细胞化学检测，以表征培养的C1498细胞，并确定将其注射到小鼠体内后所诱导白血病的性质。

当我们进行表型分析时 体外 在对C1498细胞进行免疫染色和流式细胞术分析后，我们观察到一些局限性，因为这些细胞表达的细胞表面造血标志物较少，而这些标志物在以往文献中已有描述。^6,7与我们的结果一致，Labelle 等 未通过流式细胞术染色检测到C1498细胞表面表达成熟的TCR。然而，他们在检测到CD3ε和TCRVβ8.2 mRNA后，认为该细胞系为NKT细胞系⁷我们还观察到大多数细胞内存在TCRVβ链和CD3ε分子的表达（> 70%），但由于同时存在Mac-3分子的细胞内表达，无法确定其造血谱系。

髓过氧化物酶、MGG染色以及通过细胞化学方法分析功能性酯酶的检测结果表明，C1498细胞系具有髓系来源特征，由单核母细胞和原粒细胞组成。这些结果与流式细胞术染色分析中获得的Mac-3⁺细胞百分比一致。尽管这些方法并非定量检测，但它们代表了必须执行的关键实验步骤。事实上，迄今为止，这些方法仍是表征那些不表达或仅表达少量特异性表型标志物的造血细胞谱系及分化阶段的最佳现有手段。

流式细胞术染色有助于证明将C1498细胞尾静脉注射入同源小鼠后急性白血病的发生。分离出浸润至外周血及多种器官的CD45.2⁺ C1498细胞，并测定其频率。在完成免疫表型分析后，还对骨髓和脾脏中的固有细胞进行了定量分析。当检测C1498细胞在器官中的表型时遇到了局限性，因为这些细胞表达的造血标志物极少（仅有少数为B220⁺）。为了明确所观察到的急性白血病的性质，采用骨髓样本进行了May-Grünwald Giemsa染色，并检测了单核细胞和粒细胞酯酶的活性。结果显示，C1498细胞保持了其髓母细胞和单核母细胞的形态与功能，揭示了髓单核细胞性白血病的发生。

鉴于本方案中所述的关键步骤，在进行细胞化学反应和MGG染色时应特别注意pH值，因为pH值的偏差可能导致结果的错误解读。例如，α-萘丁酸酯酶活性仅在pH为6.0时对单核细胞具有特异性，因为在较高的pH值下，粒细胞和淋巴细胞也可能在此检测中呈阳性。进行MGG染色前不建议对细胞进行固定，我们已证明在使用C1498细胞进行酯酶细胞化学反应时，仅CAF固定可获得满意的结果。为保持CD115分子的表达及其在流式细胞术中的检测，所有样本（例如，血液、骨髓和脾细胞）在操作过程中均应置于冰上。如果在流式细胞术和/或免疫荧光实验中未观察到染色信号，应检查抗体的货号、储存条件及其稀释比例。材料/设备表中列出的抗体货号是专为流式细胞术或免疫荧光应用所选定的。一抗/二抗或其偶联的荧光染料可能因储存不当（例如，暴露于光照或高温）、稀释错误、反复冻融或使用了被污染的缓冲液而失去活性。应运行阳性对照以确保试剂正常工作，可使用已知表达目标蛋白的小鼠骨髓或脾来源细胞。为避免高背景和非特异性染色，需确保细胞充分洗涤，并在免疫荧光实验中保持高湿度环境，同时严格按照说明稀释抗体。同型对照抗体与一抗应使用相同的浓度和稀释比例，以准确确定样本中的背景水平。对于酯酶细胞化学实验，可通过使用包含纯化的小鼠脾源性粒细胞（Ly6G⁺）和单核细胞（CD115⁺）的阳性与阴性对照切片来测试试剂的有效性。

本研究中描述的实验程序表明，C1498细胞注射后小鼠所表现出的多种白血病特征与人类急性粒单核细胞白血病具有共同的典型特征^11,12。浸润的白血病细胞导致骨髓中成熟及未成熟（祖细胞和前体细胞）造血细胞减少。外周血中C1498细胞频率较高（> 20%），单核细胞亦如此。由于白血病细胞的浸润，可观察到肝肿大和脾肿大，且脾肿大伴随B淋巴细胞和髓系细胞的显著增加。使用血液分析仪评估血小板数量时，亦可观察到血小板减少症。

已通过实验证明，使用 体外 实验表明，C1498细胞通过分泌可溶性因子抑制正常小鼠造血功能¹³在多种肿瘤小鼠模型中，未成熟的髓系细胞（包括单核细胞和粒细胞）也被证实可从骨髓迁移至脾脏，在此抑制抗肿瘤特异性T细胞的活化与增殖¹⁴因此，骨髓中观察到的造血细胞减少可能是由于造血功能缺陷和/或细胞迁移所致。后一种机制可以解释外周血中单核细胞增多，或脾脏中髓系组分增大的现象。此外，这些细胞也可能来源于增强的脾脏造血功能。事实上，在稳态条件下，已发现某些脾脏B细胞亚群是成熟B淋巴细胞的前体。¹⁵此外，在炎症条件下，髓质干细胞和祖细胞被发现会迁移至脾脏，以促进成熟单核细胞的生成。¹⁶该方案无法让我们得出有关白血病发病机制的结论，需采用其他功能性及分子检测方法来进一步研究。然而，这些数据包含了急性粒单核细胞白血病临床特征的详细信息，将有助于研究人员评估和理解新型治疗药物的作用效果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C1498细胞系	ATCC	TIB 49
C57BL/6J-Ly5.1	查尔斯河实验室	B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl
<强>细胞培养试剂
2-巯基乙醇，Gibco	赛默飞世尔科技	21985
胎牛血清（FBS）	赛默飞世尔科技	10270
HEPES，Gibco（1 M）	赛默飞世尔科技	15630
非必需氨基酸溶液，Gibco	赛默飞世尔科技	11140
青霉素-链霉素，Gibco	赛默飞世尔科技	15140
RPMI 1640 培养基（Gibco，含 GlutaMAX 补充剂）	ThermoFisher Scientific	61870
丙酮酸钠，Gibco（100 mM）	赛默飞世尔科技	11360
<强>流式细胞术染色试剂
抗小鼠 B220 APC（1）	ebiosciences	17-0452	克隆 RA3-6B2，终浓度 1/100
生物素标记的抗小鼠B220（2）	ebiosciences	13-0452	克隆 RA3-6B2，1/400
抗小鼠 CD3 eFluor450（1）	ebiosciences	48-0032	克隆 17A2，1/100
抗小鼠 CD3 PE（2）	BD 生物科学	555275	克隆 17A2，1/100
抗小鼠 CD3 PE-Cy5（3）	ebiosciences	15-0031	克隆 145-2C11，1/100
抗小鼠 CD4 APC（1）	ebiosciences	17-0041	克隆 GK1.5，1:500
抗小鼠 CD4 PE（2）	ebiosciences	12-0041	克隆 GK1.5，1:200
抗小鼠 CD8 生物素 (1)	ebiosciences	13-0081	克隆 53-6.7，1:100
抗小鼠 CD8 eFluor450（2）	ebiosciences	48-0081	克隆 53-6.7，1/500
生物素标记的抗小鼠 CD11a	ebiosciences	13-0111	克隆 M17/4，1/100
抗小鼠 CD11b PE	ebiosciences	12-0112	克隆 M1/70，1/200
生物素标记的抗小鼠 CD16/32	ebiosciences	13-0161	克隆93，1/400
纯化的抗小鼠 CD16/32（FcR 封闭）	BD生物科学	553141	克隆 2.4G2
生物素标记的抗小鼠 CD18 抗体 (1)	ebiosciences	13-0181	克隆 M18/2，1/100
抗小鼠 CD18 FITC (2)	ebiosciences	11-0181	克隆 M18/2，1/50
抗小鼠 CD19 PE	ebiosciences	12-0193	克隆 1D3，1/200
抗小鼠 CD21/35 PE	ebiosciences	12-0211	克隆 8D9，1/50
抗小鼠 CD31 PE	ebiosciences	12-0311	克隆390，1:100
抗小鼠 CD34 eFluor660	ebiosciences	50-0341	克隆 RAM34，1/20
抗小鼠 CD44 PE	BD生物科学	553134	克隆 IM7，1/50
抗小鼠 CD45.2 FITC	ebiosciences	11-0454	克隆104，1:100
抗小鼠 CD49b/泛NK PE	BD 生物科学	553858	克隆 DX5，1/50
生物素标记的抗小鼠 CD80	ebiosciences	13-0801	克隆 16-10A1，1/200
生物素标记的抗小鼠 CD86	ebiosciences	13-0862	克隆 GL1，1/200
抗小鼠 CD107b (Mac-3) PE	ebiosciences	12-5989	克隆 M3/84，1/40
抗小鼠 CD115 PE	ebiosciences	12-1152	克隆 AFS98，1/100
抗小鼠 CD117 eFluor450	ebiosciences	48-1171	克隆2B8，1/100
抗小鼠 CD127 PE	ebiosciences	12-1271	克隆 A7R34，1/100
抗小鼠 CD150 APC	ebiosciences	17-1501	克隆 9D1，1/20
生物素标记的抗小鼠 CD274（PD-L1）抗体	ebiosciences	13-5982	克隆 MIH5，1/200
抗小鼠 Ly-6A/E (Sca-1) PE	ebiosciences	12-5981	克隆 D7，1/100
抗小鼠 Ly-6C APC	ebiosciences	17-5932	克隆 HK1.4，1/200
抗小鼠 Ly-6G  (Gr-1) 生物素 (1)	ebiosciences	13-5931	克隆 RB6-8C5，1/400
抗小鼠 Ly-6G FITC（2）	ebiosciences	11-9668	单克隆抗体 1A8，1:50
生物素标记的抗小鼠MHC I类分子（H-2Db）抗体	ebiosciences	13-5999	克隆 28-14-8，1/50
抗小鼠MHC II类分子（I-A/I-E）PE-Cy5	ebiosciences	15-5321	克隆 M5/114.15.2，1/1000
PE标记的抗小鼠NK1.1抗体	BD生物科学	557391	克隆 PK136，1/50
抗小鼠 TCRVb FITC	BD 生物科学	553170	克隆 H57-597，1/50
链霉亲和素 PE-Cy5	ebiosciences	15-4317	1/200
免疫荧光染色试剂
抗小鼠髓过氧化物酶（重链抗体）	Santa Cruz Biotechnology	sc-16129	1/10 (20 µg/ml
抗山羊IgG（Texas Red标记抗体）	杰克逊免疫研究实验室	705-076-147	1/250
正常驴血清	杰克逊免疫研究实验室	017-000-001
Hoechst 溶液	BD 生物科学	561908	1/1000
封片剂 1（Fluoromount）	Sigma-Aldrich	F4680
丙酮	VWR	20066
甲醇	默克密理博	106009
<强>酯酶细胞化学染色试剂
AS-D 萘酚氯乙酸酯溶液	Sigma-Aldrich	911
染料溶液（Fast Red Violet LB Base 溶液）	Sigma-Aldrich	912
pH6.3 缓冲液浓缩液（TRIZMAL）	Sigma-Aldrich	913
亚硝酸钠溶液	Sigma-Aldrich	914
柠檬酸盐溶液	Sigma-Aldrich	915
苏木精溶液	Sigma-Aldrich	GHS3
丙酮	VWR	20066
甲醛溶液，37%	Sigma-Aldrich	F1635
α-萘丁酸溶液	Sigma-Aldrich	1801
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	1805
亚硝酸钠片	Sigma-Aldrich	1809
品红溶液	Sigma-Aldrich	1804
亚甲蓝溶液	Sigma-Aldrich	1808	1/10
封片剂 2（Clearmount）	Invitrogen	00-8010
<强>梅-格雷夫斯病ünwald Giemsa 染色试剂
梅-格伦斯费尔德（May-Grünwald）ünwald溶液	RAL 诊断	320070
吉姆萨R溶液	RAL 诊断	320310	1/20
pH 6.8 缓冲液	RAL 诊断学	330368
<强>其他材料、试剂和设备
氯胺酮 1000（100 mg/ml）	VIRBAC	3597132111010
赛拉嗪 SEDAXYLAN（20 mg/ml）	CEVA
牛血清白蛋白（BSA）粉末	赛默飞世尔科技	BP671
PBS 溶液（1 倍浓缩液）	赛默飞世尔科技	14190
多聚甲醛（PFA）	Sigma-Aldrich	158127
皂苷	Sigma-Aldrich	47036
超纯 0.5 M EDTA 溶液，pH 8.0	赛默飞世尔科技	15575
分离液（Pancoll Mouse）	PANBIOTECH	P04-64100
裂解缓冲液（红细胞裂解缓冲液）（10倍浓缩）	BD 生物科学	555899	1/10
NaOH 10 N	赛默飞世尔科技	SS267
台盼蓝溶液（0.4 %）	赛默飞世尔科技	15250-061	1/2
50 ml 离心管（Falcon）	Fisher Scientific	14-432-22
70 µm 细胞滤网（Falcon）	康宁生命科学	352350
腔室 &和滤膜卡（EZ Cytofunnel Shandon）	赛默飞世尔科技	A78710003
显微镜盖玻片，24 x 24 mm	克尼特尔玻璃	VD1 2424 Y100
载玻片（Starfrost - 磨边 90）	克尼特尔玻璃	VS1137# 077FKB
EDTA管	Greiner Bio-One	454034
巴斯德吸管 150 mm（毛细管）	Fisherbrand	1154-6963
26 G 针头	Terumo	NN-2613R
胰岛素注射器及29 G针头	Terumo	BS05M2913
30 G 针头	贝克顿 &和 Dickinson	304000
流式细胞术管（蓝色）	贝克曼库尔特	2523749
防水笔（Dakopen）	Dako	S200230
锋利的无菌剪刀	Nessi-care	SCI-01
无菌镊子	Dominique Dutscher	956506
血球计数板	VWR	631-0397
培养皿（Fisherbrand 塑料）	赛默飞世尔科技	S33580A
微型离心管（1.5 ml）	ThermoFisher Scientific	05-408-129
圆柱形固定器 15 - 30 克	Stoelting	51338
Shandon Cytospin 3 细胞离心涂片机	赛默飞世尔科技
10 ml 注射器	泰尔茂	SS-10L
1 ml 注射器	Terumo	SS-01T
乙醇	默克	1.08543
无菌纱布块	URGO	501580