细胞黏附性在生物材料研究和组织工程的多种方法中至关重要。本文介绍了一种利用湿化学法对重要聚合物聚四氟乙烯（PTFE）进行肽类表面修饰的逐步技术。
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本文内容
摘要
摘要
赋予材料表面细胞黏附特性是生物材料研究和组织工程中的常用策略。这一策略尤其适用于那些已在医学领域长期使用并获得批准的聚合物，因为这些材料的性能已被充分表征，且可避免引入新合成聚合物所带来的法律问题。聚四氟乙烯（PTFE）是制造血管移植物最常用的材料之一，但该聚合物缺乏促进细胞黏附的特性。内皮化， 即， 移植物内表面被内皮细胞融合层完全覆盖被认为是实现最佳性能的关键，主要原因是可降低人工界面的血栓形成倾向。
本研究探讨了内皮细胞在肽修饰的聚四氟乙烯（PTFE）材料上的生长情况，并将其结果与未修饰基底上的结果进行比较。通过使用试剂萘钠活化含氟聚合物，随后进行偶联反应，实现内皮细胞黏附肽Arg-Glu-Asp-Val（REDV）的固定。细胞培养采用人脐静脉内皮细胞（HUVECs），结果显示在两周培养期内，肽固定化材料上表现出优异的细胞生长效果。
引言
医学领域中已获批使用一段时间的多种聚合物并未表现出增强的生物相容性， 即，缺乏细胞黏附性、诱导纤维化包裹以及具有血栓形成倾向等。生物材料与生物系统之间的相互作用主要发生在植入物的表面。因此，研究集中于表面改性，旨在为特定应用创造适宜的表面特性，同时保持材料本体性质不受影响。聚四氟乙烯（PTFE）作为一种生理惰性聚合物，广泛应用于疝修补手术网片等多个医学领域 1，医疗端口 2 以及最重要的血管移植物 3.
尤其是在接触血液的情况下，聚四氟乙烯（PTFE）的疏水特性会导致血浆成分的非特异性吸附，进而引起血小板黏附，常常导致血栓事件和移植物闭塞4。此外，PTFE 与大多数聚合物一样，不支持细胞黏附和覆盖，而这一特性正是诱导血管移植物内腔表面形成有益的内皮细胞（ECs）层所期望具备的5。仿生内皮层预期能够实现其天然对应物的多种功能，尤其是抗血栓形成特性6。一种通用的仿生改性策略是仅赋予材料细胞黏附性，同时保持材料本体性能不受影响。此外，还可通过引入抗黏附（防污）特性来减少血小板黏附7。已有多种肽被报道可显著增强细胞黏附，这些肽大多来源于细胞外基质蛋白，可通过与属于整合素类的细胞受体结合发挥作用8。其中最著名的例子是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp, RGD）肽，它可与大多数细胞类型相互作用。其他氨基酸序列则可被特定细胞上特异性表达的整合素识别。例如，精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸（Arg-Glu-Asp-Val, REDV）和酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸（Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, YIGSR）已被发现能够特异性地与内皮细胞结合9。此类肽已成功共价固定于多种本征非黏附性材料表面，包括金属和聚合物10,11。
多孔聚四氟乙烯（更准确地说是膨体聚四氟乙烯，ePTFE）与聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是制造血管移植物最重要的材料12。传统的物理处理技术，如等离子体改性13或光化学方法14，受限于多孔结构或管状结构的内部孔隙或管腔难以有效处理。由于含氟聚合物具有高度惰性，能抵抗大多数化学试剂的攻击，因此对PTFE进行湿法化学处理是一项困难的任务15。
本文介绍了一种相对简便的共价修饰方法。该方法借鉴了使聚四氟乙烯（PTFE）可键合的工艺，在材料表面引入了功能基团，这些基团可作为进一步偶联生物活性分子的锚定点。
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方案
1. 萘钠活化溶液的制备及表面活化
注意：反应需在通风良好的通风橱中进行。遵循处理高度易燃溶剂和腐蚀性金属（如金属钠）的一般规则。萘即使在极少量时也具有非常难闻的气味（类似樟脑丸）！除非另有说明，反应均在室温下进行。叠氮化钠具有高毒性！四氢呋喃（THF，99.9%，参见材料列表）储存于约20%（体积比）分子筛中。对于含明显水分的THF，需用金属钠进行蒸馏。若存在痕量水，则无法生成萘钠。
- 在装有聚四氟乙烯（PTFE）涂层磁力搅拌子的100 ml带螺帽玻璃瓶中，向1.4 g（10.9 mmol）萘溶于20 ml四氢呋喃（THF，经3 Å分子筛干燥）的溶液中加入0.25 g（10.9 mmol）金属钠。
注意：将钠切成小块并适度加热（35 - 40 °C）可显著促进其溶解。最终溶液呈深色，略带绿色，可在严格干燥条件下储存。 - 从0.5 mm厚的聚四氟乙烯箔材上冲压出直径为12 mm的圆片。标记其中一侧（例如，使用字母冲头），并用异丙醇清洗。
- 用镊子将聚四氟乙烯样品单独浸入活化溶液（步骤1.1）中1 - 2分钟。注意：颜色由白色变为深棕色表明处理成功。
- 随后用THF冲洗两次，再用异丙醇冲洗。
注意：当萘钠溶液颜色变为浅淡如水的棕色时，表明其已耗尽。未使用的萘钠溶液（可能含有金属钠）在废弃前需缓慢加入异丙醇进行分解。 - 将处理后的样品在含20%（w/v）三氯乙酸的30%过氧化氢溶液中氧化3小时，用水洗涤并干燥。此时表面呈轻微棕色。注意：活化与氧化处理显著提高了表面的润湿性。该现象此前已有详细研究14。
- 将氧化后的圆片在干燥THF中用50%（v/v）六亚甲基二异氰酸酯（HMDI）处理2小时，用THF冲洗后晾干。
- 将含异氰酸酯的样品在水中水解2 - 3小时，然后干燥。注意：最终获得的氨基功能化聚四氟乙烯表面比含异氰酸酯的样品更稳定，并可与多种标准交联剂兼容，适用于进一步偶联反应。
2. 肽的固定
- 配制含有20%（v/v）二甘醇二缩水甘油醚（diepoxide）的50 mM碳酸盐缓冲液（pH 9.0）溶液。
- 将氨基化圆片标记面朝上分别放入24孔板中，每孔加入1.5 ml环氧溶液，确保样品完全覆盖。孵育2小时后，用纯水洗涤两次，再用碳酸盐缓冲液洗涤一次。
- 加入50 µl浓度为0.5 mg/ml的肽溶液（例如，REDV）溶于含0.01% NaN的50 mM碳酸盐缓冲液（pH 9）中3，加入到新的24孔板各孔底部，并小心地将环氧功能化圆片倒置放置即将PTFE圆片（标记面朝下）置于肽溶液液滴上，确保由于毛细作用，使孔底部与PTFE圆片之间的空间完全润湿。
- 在湿盒中孵育（例如， 任何可密封的塑料盒（带紧密闭合盖子），底部放置湿润的纸巾以保持湿润环境，孵育至少3小时或过夜。
注意：尽管REDV基序可被视为已充分表征，但仍可包含打乱或反向的氨基酸序列作为额外的阴性对照。 - 用纯水清洗三次，并在50%异丙醇/水溶液中灭菌至少30分钟。接种细胞前，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗样品。
3. 细胞接种
- 采用标准细胞培养方法培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs） 17,18.
- 将肽偶联样品有修饰的一侧朝上放置于24孔板中。使用未经处理的聚四氟乙烯（PTFE）圆片作为对照。
- 接种 5 × 104 每孔加入2 ml培养基中的HUVECs，在37 °C、5% CO₂条件下孵育4小时2 在培养箱中。
- 移除圆片，小心冲洗以去除未贴壁的细胞，并转移至新的24孔板中。加入2 ml新鲜培养基，于所需条件下孵育一段时间（例如， 24 小时，1 周 等等。每两天更换一次培养基。
- 配制1 mg/ml的Calcein-AM二甲基亚砜（DMSO）储备液。
- 细胞培养完成后，移除培养基，用PBS洗涤，并加入含有1 µl/ml Calcein-AM染料的PBS例如， 每毫升 PBS 中加入 1 µl 储存液，轻轻振荡，置于 37 °C 黑暗环境中孵育 45 分钟。
- 用 PBS 洗涤，并立即在配备标准 FITC 滤光片（激发波长 488 nm，发射波长 515 nm）的荧光显微镜下观察并拍摄显微图像，放大倍数为 100 倍。对未处理和经处理的样品均进行三次重复实验。
- 使用 ImageJ 软件测定细胞定植的面积。也可手动计数细胞或使用 ImageJ 进行分析。两种方法均可提供关于细胞在相应表面黏附与生长情况的相似信息。
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结果
关键化学反应步骤的结果通过红外光谱法进行监测（图1）。初始的萘钠活化反应生成双键，同时在较小程度上产生羟基官能团。氧化后，表明碳碳双键（C=C）的信号消失，得到几乎仅含羟基的表面。其他标准偶联步骤的分析未在此展示。活化和氧化过程中观察到的颜色变化与所采用反应的预期化学变化一致：共轭双键体系通常呈棕褐色，其消失会导致颜色变浅（图2）。此外，通过扫描电子显微镜研究了活化和氧化对表面形貌的可能影响。结果表明，该处理对材料表面几乎无不利影响（图2）。
图3和图4展示了REDV固定化对内皮细胞生长的影响。在未经处理的材料表面，几乎不发生细胞黏附和增殖，而经过修饰的材料在两周内显著促进了细胞定植。以临床应用为例（即血管移植物），在商品化的膨体聚四氟乙烯（ePTFE）移植物原始材料...
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讨论
聚四氟乙烯（PTFE）表面修饰方案的详细描述包含一系列连续步骤，首先从聚合物主链中去除氟原子，如图6所示。结果形成一层富含共轭碳-碳双键的结构，这与萘负离子处理后出现的深棕褐色现象一致。随后采用酸性过氧化氢进行标准氧化，得到羟基化的表面，并伴随颜色变浅至浅棕色，表明双键的减少。该过程可通过红外光谱清晰验证。
为了获得更广泛适用的功能性，通过简单地使用二异氰酸酯处理，并将生成的NCO基团水解为伯胺，从而将悬挂的羟基转化为氨基官能团。这种方法具有优势，因为含胺材料可长期储存，而高反应活性的异氰酸酯基团则容易受到空气中湿气的影响。
在初始活化步骤和HMDI处理过程中，必须避免接触痕量水分，因为萘钠和异氰酸酯均极易发生水解。与将样品完全浸入溶液中的标准操作不同，本方案仅需使用少量试剂，因此可显著节省昂贵的多肽用量。
含胺基的表面是多种生物分子偶联的理想起始点。本研究中所采用的二环氧基化合物在多个方面具有优势：其价格相对低廉，具有亲水性，对胺基具有...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢德国美因茨马克斯·普朗克高分子研究所Walter Scholdei提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mm 厚聚四氟乙烯（PTFE）箔 | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV 肽 | Genecust | n/a | 定制合成，纯度 >95% |
| 异丙醇 | Sigma Aldrich | 34965 | |
| 四氢呋喃（THF） | Sigma Aldrich | 401757 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma Aldrich | D8418 | |
| 3 Å 分子筛 | Sigma Aldrich | 208574 | |
| 金属钠 | Sigma Aldrich | 483745 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma Aldrich | D8537 | |
| 萘 | Sigma Aldrich | 147141 | |
| 30% 过氧化氢 | Sigma Aldrich | 95321 | |
| 三氯乙酸 | Sigma Aldrich | T6399 | |
| 二乙二醇二缩水甘油醚 | Sigma Aldrich | 17741 | |
| 六亚甲基二异氰酸酯（HMDI） | Sigma Aldrich | 52650 | |
| 钙黄绿素-AM（Calcein-AM） | Sigma Aldrich | 56496 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich | S6014 | |
| 叠氮化钠 | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 孔板 | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR 光谱仪 Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| 荧光显微镜 Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| 人脐静脉内皮细胞（HUVECs） | Lonza | n/a | |
| 膨体聚四氟乙烯（ePTFE）血管移植物 | Gore | n/a |
参考文献
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