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在球形乳液液滴中重建基础有丝分裂纺锤体

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DOI：

10.3791/54278

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2016年8月13日

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1Department of Bionanoscience, Delft University of Technology

本文内容

摘要

有丝分裂纺锤体的组装和定位依赖于微管动力学、马达蛋白和交联蛋白共同产生的作用力。本文介绍了我们近期开发的方法，该方法利用球形乳液液滴的几何限域，自下而上地重建基本的有丝分裂纺锤体。

摘要

有丝分裂纺锤体的组装、定位和方向取决于微管动力学、微管马达蛋白和交联蛋白共同产生的力。生长中的微管可产生推力，而当去聚合的微管与皮层动力蛋白（dynein）或染色体连接时，可将微管缩短所释放的能量转化为拉力。此外，纺锤体内部的马达蛋白和可扩散的交联蛋白通过连接并滑动反向平行的微管，参与调控纺锤体的结构。在活体（in vivo）条件下，解析各个组分对整体受力平衡的相对贡献一直存在困难。本文介绍了我们近期为从头（自下而上）在体外（in vitro）重建基本有丝分裂纺锤体而开发的方法。利用微流控技术，将中心体和微管蛋白（tubulin）包裹在油包水乳液微滴中，形成几何受限的（双）微管星状体。通过进一步引入皮层锚定的动力蛋白、朝向微管正端的马达蛋白以及可扩散的交联蛋白，该系统可用于重建类似纺锤体的结构。本文所述方法为重建更完整的有丝分裂纺锤体提供了起点，有助于深入研究各个组分的独立作用，并获得关于有丝分裂纺锤体内力平衡的系统性定量认识。

引言

在有丝分裂过程中，复制后的基因组染色体排列在细胞赤道板上，以确保姐妹染色单体均等地分配到新形成的子细胞中。染色体的定位和分离依赖于其与来自两个相对中心体的纺锤体微管的连接。除了确保染色体的准确分配外，有丝分裂纺锤体的方向还决定了细胞分裂平面1。细胞分裂方向的协调在发育的多个阶段以及组织稳态中至关重要2。具体而言，受调控的有丝分裂纺锤体定位可导致细胞内容物的不对称分布，甚至产生大小不同的子细胞2。有丝分裂纺锤体的组装和定向始于前期，由协同作用和相互拮抗的力生成系统之间复杂的相互作用所调控3,4。所产生的力包括拉力和推力，这些力既来源于纺锤体与细胞皮层的接触，也来源于纺锤体内部，并可通过微管动力学以及分子马达和交联蛋白产生（图1）。

当微管生长并抵靠细胞皮层等刚性结构时，可产生推力。根据系统内产生的总阻力大小，这种推力可能导致有丝分裂纺锤体的重新定位（低阻力情况下），或引发微管屈曲或解聚（高阻力情况下）5-8。推力的大小取决于微管的长度，因为长度是决定微管是否发生屈曲的关键因素9。此外，源自一个中心体的微管可对另一个中心体产生推力，该机制被认为在早前期推动中心体分离3,10。

除了由微管生长产生的推力外，接触细胞皮层的微管末端也能介导拉力11多项来自不同实验室的研究表明，皮层力发生器的受控活动是实现有丝分裂纺锤体不对称定位所必需的 体内1对这些牵拉力至关重要的是定位于细胞皮层的胞质动力蛋白（下文简称“dynein”），这是一种朝向微管负端的动力蛋白8,12,13例如，在芽殖酵母中，皮层动力蛋白与微管晶格的侧向相互作用导致依赖于马达蛋白的微管沿细胞皮层滑动14然而，驱动蛋白（dynein）能够与去聚合的微管形成端部连接，从而产生皮层拉力8微管缩短所产生的能量可能引起作用力，其量级通常高出约一个数量级（~50 pN（参考文献15）高于单个马达蛋白产生的力（约 7–8 pN（参考文献 16皮层动力蛋白与去聚合微管的末端连接促进芽殖酵母中纺锤体的定位17 和 秀丽隐杆线虫13运动蛋白依赖的滑动与微管去聚合驱动的皮层牵拉力是协同作用还是相互排斥 体内 目前尚不清楚。

除了微管推动作用力和驱动蛋白介导的皮层拉力外，还有多种其他蛋白质从有丝分裂纺锤体内部调控中心体的定位。例如，驱动蛋白-5（kinesin-5）以四聚体形式存在，能够交联反向平行的极间微管，从而产生向外滑动的作用力18-20。在所有已研究的真核生物中，驱动蛋白-5家族成员均参与中心体分离和双极纺锤体的组装，但秀丽隐杆线虫（C. elegans）除外（详见参考文献21的综述）。

此外，Ase1/PRC1家族的可扩散交联蛋白也被发现定位于极间微管的微管重叠区域。 体内 和 体外22-27Ase1驱动微管重叠区域扩展所产生的力足以抵消由驱动蛋白-14介导的滑动力 体外28,29在细胞中，Ase1/PRC1 对于纺锤体中区重叠微管区域的稳定形成是必需的25-27,30，表明可扩散交联剂产生的力可能对纺锤体的组装起到重要作用。最后，有丝分裂染色质和动粒通过多种途径影响有丝分裂纺锤体的组装与定位3由于这些组分不属于本文所述的重建实验的一部分，因此将不对其进行详细讨论。

关于上述不同的分子组分和作用力如何协同参与纺锤体的组装与定位，目前存在多种理论，但我们距离实现对其的定量理解仍有较大差距。除了在活细胞中开展实验外，利用纯化组分进行的体外（in vitro）实验也为实现这一目标提供了强有力的途径。本文展示了对近期发表的方法（Roth et al.31）进行改进和拓展后的可视化操作指南，该方法通过极简的组分，在油包水乳液微滴中重建基础的纺锤体结构。利用微流控技术，可生成尺寸与有丝分裂细胞相当的球形微滴。在这些微滴中，可将纯化的中心体与微管蛋白结合，用于研究微管星状体的动力学行为、力的产生以及星状体之间的相互作用。通过引入皮层定位的力产生元件（如动力蛋白）和极间力产生元件（如驱动蛋白-5/Ase1），我们重建出日益复杂的、类似纺锤体的结构，使其逐渐接近体内（in vivo）的真实情况。

方案

1. 微流控芯片的制备

注意：在研究纺锤体组装的自下而上方法中，使用油相中的水包油乳液微滴。这些是被磷脂单层和表面活性剂包裹、与周围油相隔离的水相微滴。这些乳液微滴在微流控聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片中生成。通过改变通道几何形状和流速可调节微滴大小。在本文所述的微流控设计中，生成的微滴直径约为15 µm，以模拟哺乳动物有丝分裂细胞的几何限域环境。

  1. 光刻掩模设计与模具制备
    1. 设计一个包含三个进样通道的光刻掩模31。进样通道1连接水相，其中含有液滴内容物（见第3节 "基本微管星状体的重建"）。进样通道2连接油相（见第2.1节 "脂质/油相制备"）。使用进样通道3在观察前用额外的脂质/油相对乳液液滴进行稀释（可选）（图2a-b）。
      注：所有进样通道后均设有粉尘过滤器（由2 µm宽通道构成的迷宫结构），用于捕获灰尘、PDMS颗粒及（蛋白质）聚集体，防止其堵塞微流控通道（图2d）。通道宽度为75 µm，脂质/油相与水相在宽度为12.5 µm的交汇处相遇并形成乳液液滴（图2c）。
    2. 订购并获取印制在薄膜基底上的光刻掩模，要求为负性极性（即掩模整体为暗色，设计结构部分透明）。
  2. 模具制备
    1. 在洁净室环境中，使用旋涂仪将SU-8 3025光刻胶旋涂至4英寸硅片上（500 rpm，10秒；随后1,800 rpm，45秒）。
    2. 通过光刻掩模对涂覆有SU-8的硅片进行曝光。按照制造商说明进行显影，以形成厚度约为40 µm的通道结构。
  3. 制备微流控芯片
    1. 使用塑料刮刀在类似船形的容器中将10份PDMS预聚物与1份固化剂（总量约40 g）混合均匀。将装有PDMS的船形容器置于真空腔中约30分钟，以去除气泡。用铝箔包裹模具边缘，形成一个边缘高出约1 cm的杯状结构。
    2. 将PDMS混合物（约占总体积的75%）倒入模具中，再次置于真空腔中约30分钟（以进一步去除气泡），随后在烘箱中100 °C下固化1小时。
    3. 将剩余的PDMS旋涂于载玻片上（先200 rpm旋转5秒，再4,000 rpm旋转30秒），然后在100 °C下固化1小时。使用压缩空气或N2气流清除载玻片上的灰尘，无需预先清洗。
      注：涂覆PDMS的载玻片既可用于微流控芯片，也可用于流动池的制备（参见2.2节）。
    4. 使用剃刀刀片小心地将PDMS从模具上剥离，并打孔（进样孔直径0.5 mm，出样孔直径0.75 mm）。使用实验室电晕表面处理仪对微流控芯片和PDMS涂层载玻片进行数秒的电晕处理。
    5. 将微流控芯片放置于载玻片上（通道面朝下），在100 °C下烘烤过夜（图3a）。将微流控芯片储存在无尘环境中，可保存数月。

2. 微流控装置

注意：使用上述微流控装置和微流控芯片生成油包水乳液液滴。脂质/油相的组成可根据实验需求进行调整。溶于油相的脂质将在水-油界面处形成单分子层，其极性头部基团朝向内部水相。为了靶向蛋白质（例如 可添加少量生物素化磷脂酰乙醇胺（biotinyl-PE）脂质至液滴边界，从而实现驱动蛋白（dynein）的募集（参见第4.1节）。 "驱动蛋白向液滴皮层的靶向定位"通过链霉亲和素介导的多聚化形成液滴。通过添加表面活性剂稳定液滴，并将其储存于PDMS包被的流动池中。

  1. 脂质/油相的制备
    1. 将溶于氯仿的1,2-二油酰基-sn-以玻璃移液管在玻璃试管中按4:1的摩尔比混合甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（DOPS）和生物素化磷脂酰乙醇胺（biotinyl-PE）（使用前用氯仿充分冲洗移液管）。总共制备约250 µg脂质，得到脂质浓度约为0.5 mg/ml。
    2. 用氮气小心地将脂质混合物干燥2-流，随后置于真空室中约1小时。将干燥的脂质溶解于矿物油和2.5%表面活性剂中，浓度为0.5 mg/ml（配制约500 µl）。
    3. 将脂质/油样品置于超声波清洗仪中，在40 kHz条件下超声处理30分钟，以充分溶解脂质。
  2. 流动池制备
    1. 将PDMS旋涂于盖玻片（5秒，200 rpm，随后30秒，4,000 rpm）和载玻片（5秒，100 rpm，随后30秒，1,500 rpm），以形成均匀的PDMS层（参见第1.3节）。
      注意：为了获得最佳成像质量，请确保使用与显微镜物镜匹配的盖玻片厚度。本实验中为1.5号（约0.17 mm）。
    2. 将涂有PDMS的盖玻片和载玻片在烘箱中100 °C下固化1小时。通过将实验室密封膜薄片（宽约3 mm）以较近间距（约2 mm）粘附在PDMS涂层的载玻片上，制备流动池。未使用的通道若储存于无尘环境中，可于后续时间再次使用。
    3. 用PDMS包被的盖玻片覆盖流动池，并在100 °C下加热约1分钟以熔化实验室封膜进行密封，轻轻按压（图3c）。用瓦拉普（Valap）封闭实验室密封膜与玻璃之间的边界图3c). 将流动池存放在无尘环境中，可保存数月。
  3. PDMS 杯的制备
    1. 对于长期成像，通过在一片聚二甲基硅氧烷（PDMS，约3 mm厚）上打一个直径4 mm的孔来制作PDMS小杯
    2. 将PDMS切片和PDMS包被的盖玻片进行等离子处理，然后将二者叠放在一起。将PDMS小室在100 °C下烘烤过夜（o/n）。图5a).
  4. 乳液液滴的形成
    1. 在倒置明场显微镜下观察液滴形成。使用聚醚醚酮（PEEK）管（外径：510 µm，内径：125 µm）将压力控制器连接至微流控芯片。图3a）。从入口2将脂质/油相完全填充至微流控芯片中。
    2. 引入基于MRB80的水相（见第3节） "重建基础微管星状体") 从入口1进入。通过调节脂质/油相和水相的压力来控制液滴大小，以生成直径约为15 µm的液滴（图3b).
      注意：使用此装置时，脂质/油相压力设为约 800 mbar，水相压力设为约 200 mbar，以生成所需尺寸的液滴。
    3. 在获得所需液滴大小和足量液滴（每样本约 10 µl）后，从出口通道收集液滴并加载至流动池中（完全充满流动池）。
    4. 小心地用瓦拉普封口剂（Valap）封闭流体池的两端（流体池若未完全封闭，可能导致液滴大幅移动，从而难以成像）。此外，应避免产生气泡，气泡的形成也会引起液滴移动。
    5. 使用前后用异丙醇充分冲洗PEEK管，以防止样品交叉污染和堵塞。

3. 重建基本微管星状体

注意：液滴内容可根据实验需求进行调整。所有缓冲液均基于 MRB80（80 mM PIPES、1 mM EGTA、4 mM MgCl2（pH 6.8）），所有样品均需在冰上制备。通常情况下，液滴中始终包含中心体、微管聚合所需组分、氧气清除系统以及封闭剂（参见第 3.1 节）。可根据需要加入微管力生成系统及其所需的辅因子和靶向因子（参见第 4.1 和 4.2 节）。

  1. 乳液滴中星体形成的通用设置（图3d）
    1. 预先配制葡萄糖氧化酶混合液（20 mg/ml 葡萄糖氧化酶溶于 200 mM DTT 和 10 mg/ml 过氧化氢酶），分装成小份，于 -80 °C 保存。
    2. 预先配制含κ-酪蛋白、牛血清白蛋白（BSA）、Tween-20 和荧光标记葡聚糖（作为中性示踪剂）的“封闭混合液”（见表1），分装成小份，于 -80 °C 保存。避免反复冻融。确保所有组分均为新鲜配制。
    3. 按照 Moudjou et al.32 的方法从人淋巴母细胞KE37细胞系中纯化中心体，并以小份形式于 -150 °C 保存。
    4. 室温下解冻中心体，使用前于 37 °C 孵育约 20 分钟，以确保微管正常成核。
      注意：此步骤可促进实验过程中微管的成核。
    5. 与此同时，在冰上配制“反应混合液”，其中包含微管蛋白（荧光标记与非荧光标记）、三磷酸鸟苷（GTP）、氧气清除系统（葡萄糖、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和1,4-二硫苏糖醇（DTT））、分子力生成器（例如 微管马达蛋白/交联蛋白）、三磷酸腺苷（ATP）以及ATP再生系统（磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、丙酮酸激酶（PK）和乳酸脱氢酶（LDH））（见表2）。
    6. 将气动离心机转子预先在冰上冷却。将样品置于冷却的气动离心机转子中离心（30 psi，3 分钟）。加入预热的中心体（优化中心体用量，以获得每个液滴含1–2个中心体为宜）。
    7. 使用第2.3节所述方法，将上述混合液制备成乳液滴。
组分储存浓度终浓度（在检测中）体积备注
Dextran-647nm75 μM3.75 uM (0.6 μM)5 μl
κ-casein20 mg/ml12.5 mg/ml (2 mg/ml)62.5 μl
Tween-205%0.375% (0.06%)7.5 μl
BSA200 mg/ml12 mg/ml (1.9 mg/ml)6 μl
MRB8019 μl
终体积 100 μl以 2 μl 分装保存

表 1：“封闭混合液”的组分。 用于在油包水乳液液滴中重建纺锤样结构所需的封闭混合液组分。相关描述见正文第3部分"重建基本微管星状体"。有关材料的详细信息，请参见"材料表。

组分储存浓度终浓度体积备注
封闭混合液1.6 μl
微管蛋白（Tubulin）500 μM30 μM0.6 μl
Tubulin-488/56150 μM3 μM0.6 μl
GTP50 mM5 mM1.0 μl
Dynein-TMR178 nM30 nM1.7 μl
链霉亲和素（Streptavidin）5 mg/ml200 nM0.4 μl仅用于皮层动力蛋白（cortical Dynein）
Kinesin-51.6 mM80 nM0.5 μl
ATP25 mM1 mM0.4 μl仅用于马达蛋白
PEP0.5 M25.6 mM0.5 μl仅用于马达蛋白
PK/LDH800 U/1,100 U23 U/32 U0.3 μl仅用于马达蛋白
Ase1-GFP400 nM80 nM2.0 μl
葡萄糖（Glucose）2.5 M50 mM0.3 μl最后一步
葡萄糖氧化酶（Glucose-oxidase）50x1.0x0.3 μl最后一步
MRB80x
终体积 9 μl

表 2： “检测混合液”的组分。 用于在油包水乳液液滴中重建纺锤样结构的检测混合液组分。相关说明见正文第3节"重建基本微管星状体"。有关材料的详细信息，请参见材料表。

4. 介绍纺锤体组装因子

注意：在本实验所描述的检测中，使用了一种人工二聚化的绿色荧光蛋白（GFP）标记的酿酒酵母（S. cerevisiae）动力蛋白截短版本，该蛋白通过氨基末端的谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签实现二聚化33。该蛋白通过含有两个蛋白A IgG结合域的亲和标签进行纯化。此处使用的变体在羧基末端标记了四甲基罗丹明（TMR），并利用氨基末端的SNAP标签对纯化后的蛋白进行生物素化。有关构建细节，请参见Roth 等31；有关纯化细节，请参见Reck-Peterson 等33。GFP-生物素-动力蛋白-TMR可通过形成生物素-链霉亲和素复合物，靶向至液滴-皮层结构，从而将动力蛋白与生物素化磷脂酰乙醇胺（biotinyl-PE）脂质连接（图3e）。

  1. 驱动蛋白靶向液滴皮层
    1. 将GFP-biotin-dynein-TMR加入“检测混合液”中（见表2），终浓度为30 nM。将链霉亲和素（Streptavidin）加入“检测混合液”中（见表2），终浓度为200 nM。
      注意：驱动蛋白在微管上的逐步运动依赖ATP水解。因此，需在“检测混合液”中加入ATP及ATP再生系统（含PEP和PK/LDH）（见表2）。
      注意：重组全长S. pombe GFP-Cut7（kinesin-5）由德国德累斯顿工业大学分子生物工程中心Diez实验室惠赠。重组全长组氨酸标签标记的S. pombe GFP-Ase1由荷兰瓦赫宁根大学Jansons实验室提供，并以80 nM终浓度加入“检测混合液”。

5. 成像

注意：实验过程中，可通过改变温度来控制微管的生长。在选择成像条件时，需在高质量成像与长时间监测纺锤体组装之间进行权衡。为了比较不同条件下纺锤体形成的动力学过程，可将含有不同组分的液滴混合，并在同一流动通道中进行成像观察。

  1. 基本成像设置
    1. 使用封闭式培养室在温度可控的环境中进行成像。在26 °C下孵育约30分钟后可观察到单个微管。成像过程中，可通过将温度升高至约30 °C以促进微管生长。
      注意：以下设置针对我们的显微镜系统，不同系统和操作软件下可能有所差异。本文所述所有检测均在配备旋转盘共聚焦头的电动倒置显微镜系统上完成，并使用如Andor iQ 3.1等成像软件进行操作。所有图像均采用100X油浸物镜和EmCCD相机获取。
    2. 将激发激光488、561和641 nm的强度设置为约10%。进入“采集”面板，点击“AOTF”选项卡，将激光强度滑动至10%。点击“记录”以保存设置。
    3. 对于z轴投影，以1 µm间隔采集图像堆栈（约每液滴20张图像）。进入主"相机”面板，点击“编辑z”，将“Z步进”设为1.0。点击“下一步”以保存设置。
    4. 在“采集”面板中点击“相机”选项卡，将EM增益滑条调至300以设置最大线性EM增益。在同一选项卡中将曝光时间设为200 msec。点击“记录”以保存设置。
  2. 活细胞成像
    1. 进行活细胞成像时，使用软件控制每2分钟进行一次z轴投影，持续1–2小时，同时将曝光时间缩短至约100 msec（如5.1.4所述），并将z轴间隔增加至2 µm（如5.1.3所述）。在主“相机”面板中设置时间序列，点击“重复t”并设置为2分钟间隔，总时长120分钟。
    2. 对于活细胞检测，使用PDMS杯代替常规流动池，以确保液滴尽可能保持静止。
  3. 两种条件的联合成像
    1. 利用微流控技术生成液滴，并将其储存在预先用PDMS包被并置于冰上的载玻片表面。此操作可防止微管在第二组液滴形成前发生成核。在生成第二组液滴前，需用MRB80冲洗PEEK管和微流控芯片，并用脂质/油相完全重新填充微流控芯片。
    2. 生成含或不含荧光葡聚糖的液滴（或使用不同波长荧光染料标记的葡聚糖），以便通过颜色区分不同液滴。在生成第二批液滴后，通过移液轻轻混合液滴，并将其加载至单一流动池/PDMS杯中。
  4. 图像分析
    1. 使用Fiji（在线可获取的开源软件）进行图像分析34。
    2. 对于活细胞检测，使用“图像”-“超堆栈”-“堆栈转超堆栈”功能将图像堆栈转换为超堆栈。设置正确的z切片数和时间帧数。
    3. 为生成z轴投影，选择“图像”-“堆栈”-“z投影”，并选择“最大强度”投影模式。
    4. 进行3D重建时，首先进入“图像”-“属性”，正确设置像素宽度、像素高度、体素深度和帧间隔，点击“确定”。然后选择“图像”-“堆栈”-“3D投影”，勾选“插值”选项，点击“确定”。

结果

前文所述方法利用油包水乳液滴的几何限域，实现了复杂程度逐步增加的纺锤体样结构的重建。本节描述了这些实验方法典型结果的定性演示。

在有丝分裂过程中，当双极纺锤体组装时，细胞会变圆，形成直径约为 15 µm，如在人类细胞中所测量的那样。这种典型的有丝分裂细胞形态提供了一种几何边界，既限制又引导纺锤体的大小和方向35,36微流控技术提供了几何限制水平，能够准确模拟活细胞中观察到的情况，因此允许从底层重建有丝分裂纺锤体 体外.

当微管的生长受到几何边界的限制时，微管星状体本身即可表现出复杂的行为。随着微管的延伸，新加入的微管蛋白二聚体所产生的推力会驱动两个中心体移向乳滴的相对两侧。起初，中心体可在受限的空间内自由扩散（图4a，左图）。大约20–30分钟后，首个微管开始可见，随着微管向各个方向生长并与皮层接触，中心体的扩散受到限制。当中间长度的微管（约乳滴直径的50%）形成时，它们可通过空间位阻相互排斥，微管彼此之间、与其他中心体以及与皮层之间产生推挤作用。这导致形成典型的“双极”纺锤体样结构，两个中心体彼此相对（图4a，中图）。当微管长度超过乳滴直径的约50%时，中心体会被进一步推向乳滴的相对边界，微管则沿乳滴皮层生长（图4a，右图）。需要注意的是，这些实验中微管的生长速率对温度和微管蛋白浓度均极为敏感。因此，这些参数将显著影响首次观察到成核现象以及达到稳态星状体位置所需的时间。

在细胞中，皮层牵拉力通过微管正端与皮层相关动力蛋白（dynein）之间形成承载负荷的连接而产生。在动物细胞中，这种连接依赖于Gαi/LGN/NuMA复合物，该复合物通过Gαi1的N端肉豆蔻酰化被靶向定位至质膜。在这些重建实验中，通过将动力蛋白直接通过生物素-链霉亲和素-生物素复合物与生物素化脂质偶联，从而绕过了对Gαi/LGN/NuMA复合物的需求。这些键具有相对较高的稳定性（KD ~10-14 M）37，并且形成迅速（通常在乳滴形成后10分钟内完成，早于微管成核的明显出现）（图4b）。当存在皮层动力蛋白时，中心体通常保持更靠近中心的位置；而在缺乏动力蛋白的情况下，中心体会被推向乳滴皮层的相对两侧（图4c）。我们认为这是两种效应共同作用的结果，它们阻止并抵消了微管的推力：（1）动力蛋白直接促进微管的灾变，从而限制微管长度，防止微管过度弯曲；（2）皮层牵拉力在单个星状微管组织中心上产生净向心力8，以对抗星体之间的排斥力。

可扩散交联蛋白 Ase1 产生的作用力倾向于增加反向平行微管重叠区域的大小29. 与此一致，在存在 Ase1（且无动力蛋白）的情况下，中心粒常彼此靠近，而 Ase1 定位于成束的极间微管上图4d). 驱动蛋白-5家族成员通过在纺锤体内部产生推力来驱动中心体分离（见引言）。在存在Cut7（即 S. pombe 驱动蛋白-5同源物），即使存在Ase1，中心体也被推向乳液滴的相对两侧图 4e）。通过结合皮层和极间力的产生机制，这些实验中的复杂程度可进一步提高，最终实现对双极有丝分裂纺锤体组装的全面理解。这些结果的详细定量描述将在未来公布（Roth 等 论文在准备中

除了在固定时间点观察中心体的位置，并将其行为与所观察到的微管长度相关联外，通过随时间追踪定位过程也可获得有价值的信息。通过缩短曝光时间并降低激光强度，现在可以以约每2分钟一次的频率连续追踪星状体定位过程至少1小时，且光漂白程度仅约为30%。这使得能够从自由扩散的中心体（0分钟）经中心化星状体（12分钟）到去中心化星状体（36分钟及以后）的全过程进行监测（图5c）。该方法有助于研究稳态行为以及纺锤体组装的动力学过程。通过在同一样品中组合含有不同组分的液滴，例如可直接比较在有或无皮层力生成器的液滴中中心体定位和纺锤体组装动力学的差异（图5b）。

显示微管、动力蛋白、驱动蛋白和动粒动态的细胞分裂示意图。
图 1： 作用于有丝分裂纺锤体的力。 多种产生力的分子作用于有丝分裂纺锤体的微管，促进纺锤体的形成和定位。延伸至细胞皮层的微管对中心体产生推力。皮层动力蛋白（紫色）捕获去聚合的微管，并对中心体产生拉力。在纺锤体内，Kinesin-5/Cut7 运动蛋白为反向平行的微管提供向外滑动的力，而 PRC1/Ase1 家族的交联蛋白则产生相反的向外滑动力。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于芯片实验室应用的带有稀释通道、尺寸和芯片布局的微流控装置示意图。
图 2：微流控芯片设计。（A）包含4个微流控芯片的4英寸光刻掩模设计。（B）单个芯片的详细结构。每个芯片包含一个出口通道和三个入口通道，其后接一个防尘过滤器。入口通道1用于水相，通道2用于脂质/油相，通道3可用于额外的脂质/油相对所形成的液滴进行稀释。（C）脂质/油相（来自上下方向）与水相（来自左侧）交汇处的详细结构。在该交汇点处，液滴将形成并流向右侧的出口通道。（D）带有2 µm通道的防尘过滤器的详细结构。请点击此处查看该图的放大版本。

微流控芯片示意图：PDMS包被载玻片、微管动力学、中心体、动力蛋白相互作用。
图3： 水包油乳液液滴形成的实验方法。 （A）明场显微镜下的微流控芯片及微流控管路。水相和脂质/油相管路分别连接至芯片的入口1和入口2。（B）微流控芯片中水相与脂质/油相遇的限制区域。通过调节压力可控制液滴大小。（C）PDMS包被的流动池设计。将液滴加载至流动池后，用额外的Valap封闭两端开口。（D）液滴形成的示意图。液滴用于包封中心体、微管蛋白以及其他有丝分裂纺锤体形成所需的组分。（E）皮层动力蛋白靶向的示意图。生物素化的（Bio）动力蛋白通过链霉亲和素（Strp）靶向结合至生物素化的脂质上。请点击此处查看该图的放大版本。

微管蛋白与动力蛋白相互作用的荧光显微镜观察；Ase1 和 Cut7 蛋白的定位。
图 4： 具有逐步增加复杂性的纺锤体重建实验的代表性结果。 （A）包含两个中心体的液滴的最大强度投影，显示短、中、长三种微管的示例。中心体和微管通过添加 10% HiLyte-488 标记的 Tubulin 进行可视化。比例尺 = 10 µm。（B）在无（–，左）或有（+，右）链霉亲和素（Strp）的情况下，GFP-biotin-dynein-TMR 的定位。（C）在无（–，左）或有（+，右）皮层定位的 GFP-biotin-dynein-TMR 时，微管星状体的定位。（D）在存在 Ase1 的情况下，微管星状体（左图，绿色）的定位（中图，红色）。（E）在同时存在 Ase1 和 Cut7（kinesin-5）的情况下，微管星状体（左图，绿色）的定位（中图，红色）。请点击此处查看该图的放大版本。

PDMS装置示意图；641 nm照明显微镜；盖玻片上的延时扩散分析。
图5：体外星体定位动态的成像。 in vitro。（A）PDMS杯的设计，可实现持续数小时的液滴成像。（B）含有不同成分的液滴（透射光图像）的生成、储存与成像，以是否含有荧光标记葡聚糖（Alexa 647）为例，左图无添加，右图含有。（C）对含有单个中心体的液滴进行z轴层扫（层间距离2 µm）后，选取单层平面拍摄60分钟延时图像（时间间隔2分钟）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文所述方法展示了在油包水乳液微滴中重建基本有丝分裂纺锤体的最新研究进展。在几何边界内研究纺锤体组装具有诸多优势。有丝分裂纺锤体的微管与其组装所处的几何约束之间存在重要的反馈机制。当微管生长至几何边界时可产生推力，从而导致有丝分裂纺锤体发生位移。此外，微管向物理屏障生长可诱发微管灾难（catastrophe）。同时，在受限几何空间内组装纺锤体可能导致个别组分（如微管蛋白）逐渐耗尽，进而直接影响微管的生长速率36。上述因素均为纺锤体组装的关键决定因素，均可通过本文所述的实验方法进行研究。

所描述的实验方法对液滴组分的微小浓度差异非常敏感。以微管蛋白为例，其浓度的微小变化可能导致微管生长过慢或过快。在此情况下，通常仍可通过调节实验最初约30分钟内的温度来校正微管的生长速率。有丝分裂纺锤体的组装与定位也对（皮层）力产生元件的浓度变化极为敏感。这很可能取决于纯化组分的浓度、纯度和活性，因此每次新纯化的蛋白质都需要仔细进行滴定优化。

此外，成像参数的设置需要根据实验的性质进行某些权衡。最初，溶液中高浓度的可溶性荧光微管蛋白二聚体使得难以清晰成像单个微管。随着微管逐渐延长，可溶性微管蛋白被缓慢消耗，信噪比逐步提高，从而允许对单个微管进行成像。与开放系统装置不同，几何空间的限制阻碍了荧光分子以及氧清除系统组分在大体积储存液中的交换，导致显著的荧光漂白。特别是在长时间监测纺锤体组装和定位时，即使存在高效的氧清除系统，也必须采用较低的光照强度进行成像。

这些方法能够实现类纺锤体结构的自下而上重建 体外除了此处介绍的组分外，许多其他因素也被报道会影响双极纺锤体的形成、定位、取向和形态建成， 等等。3该系统可进一步扩展，用于研究其他力生成器的单独及联合作用。目前该系统中尚未包含的、对纺锤体形成具有重要贡献的因素是丝分裂染色体。已有研究表明，丝分裂期染色质可通过以下机制引导纺锤体形成：（1）染色体动蛋白（chromokinesins），其可产生所谓的“极排斥力”3，（2）由染色质结合的RanGEF RCC1形成的RanGTP梯度38，（3）可与（去聚合的）微管相互作用的动粒39 以及（4）染色质本身，其可在相对的微管之间发挥机械弹簧的作用40.

最后，目前所描述的系统对引入的力生成器的活性和定位在时间和空间上的控制能力仍然有限。在细胞中，许多纺锤体组装因子会定位于特定区室，或仅在特定的时间窗口内具有活性。一个显著的例子是动力蛋白（dynein）的活性，其特异性地富集于细胞后侧 秀丽隐杆线虫 单细胞期胚胎以促进纺锤体的不对称定位和细胞分裂。在本系统中，我们目前正在探索利用光遗传学技术中的方法来模拟这种时间和空间上的不对称性活动的可能性。此外，与以下情况相同 秀丽隐杆线虫 具有刚性细胞壁的胚胎和细胞在有丝分裂中通常不会变圆。几何限制的形状将对作用于纺锤体的力产生根本性影响41因此，使用更复杂的微流控系统来重塑非球形液滴中的纺锤体组装和定位将非常重要，这类系统可实现乳液滴的塑形与储存。42,43最后，在组织中，细胞间及细胞与基质间的信号传导和黏附可提供外部线索，这些线索可转化为纺锤体的定向排列，这在上皮细胞和干细胞中常被观察到。本研究尚未考虑所有这些特化因素，这些因素可能为未来构建更复杂的模型带来挑战 体内-样重建有丝分裂纺锤体的组装与定位。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢Dogterom实验室成员的宝贵讨论。感谢Stefan Diez和Marcel Janson提供试剂，感谢Samara Reck-Peterson在动力蛋白纯化方面的帮助。本工作得到了欧洲研究理事会（ERC Synergy grant：MODEL-CELL）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1. 微流控芯片的制备
光掩模（薄膜基底上的光掩模）Selba S.A. 瑞士
SU-8 3025MicroChem
硅片（4 英寸 p/硼掺杂硅片 <1-0-0>，10–20 Ω-cm，500–550 μm，SSP，带两个平边）WRS Materials4P0SSP-005
匀胶机 PolosSPIN150I
PDMS 预聚物 RVT615 A+BLubribond9481
电晕处理仪Electro-technic productsBD-20ACV
2. 微流控系统搭建
名称公司目录编号备注
DOPS（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-L-丝氨酸）Avanti Polar Lipids840035
生物素化 PE（1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺-N-(生物素)）Avanti Polar Lipids870285
氯仿Sigma-Aldrich650498
玻璃移液管
玻璃管
真空泵LaboportKNF
真空腔室Kartell聚丙烯真空干燥器
矿物油Sigma-AldrichM5904
表面活性剂（Span80）Sigma-Aldrich85548
超声仪BransonM2800H
盖玻片24 mm × 60 mm，厚度 1.5
载玻片26 mm × 76 mm
打孔器Harris Uni-Core135840/135841/135843
实验室封口膜Parafilm
Valap（凡士林、羊毛脂、石蜡以等浓度熔融混合）自制
明场显微镜LeicaPMIRB 任何倒置明场显微镜均可
压力控制器FluigentMFCS-FLEX-4C-1000
PEEK 管Cluzeau Info. Labo，法国
微流控样品瓶（Micrew 0.5 ml 和 1 ml 管）VWR，荷兰
3. 重建纺锤体形成与定位
名称公司目录编号备注
葡聚糖-647 nm（Alexa Fluor 647 标记葡聚糖，10,000 MW，阴离子，可固定）Life Technologies
Tween-20Sigma-Aldrich
BSA — 牛血清白蛋白Sigma-Aldrich
葡萄糖（D-(+)-葡萄糖）Sigma-AldrichG8270
葡萄糖氧化酶（来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶）Sigma-AldrichG6125
DTT（DL-二硫苏糖醇）Sigma-Aldrich646563
过氧化氢酶（来自牛肝的过氧化氢酶）Sigma-AldrichC9322
微管蛋白（来自牛脑的微管蛋白）Cytoskeleton Inc.
微管蛋白-488/561（来自猪脑的HiLyte-488/罗丹明标记微管蛋白）Cytoskeleton Inc.
GTP（鸟苷-5'-三磷酸，钠盐水合物）Sigma-Aldrich51120
κ-酪蛋白（来自牛乳的κ-酪蛋白）Sigma-AldrichC0406
Airfuge（气动超速离心机）Beckman-CoulterCLS
4. 引入纺锤体组装因子
名称公司目录编号备注
中性亲和素（Neutravidin）Sigma-AldrichA2666
ATP（腺苷-5'-三磷酸，二钠盐水合物）Sigma-AldrichA9187
PEP（磷酸烯醇式丙酮酸单钠盐水合物 ≥97%（酶法））Sigma-AldrichP0564
PK/LDH（来自兔肌肉的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶酶混合物）Sigma-AldrichP0294

参考文献

  1. Kotak, S., Gonczy, P. Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).
  2. Williams, S. E., Fuchs, E. Oriented divisions, fate decisions. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).
  3. Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly. Dev Cell. 19, 797-806 (2010).
  4. Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Mitotic force generators and chromosome segregation. Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).
  5. Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).
  6. Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  7. Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).
  8. Laan, L., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
  9. Dogterom, M., Yurke, B. Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules. Science. 278 (5339), 856-860 (1997).
  10. Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos. Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).
  11. Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos. Cell. 129 (3), 499-510 (2007).
  12. Carminati, J. L., Stearns, T. Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex. J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).
  13. Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans. Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).
  14. Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
  15. Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).
  16. Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).
  17. Ten Hoopen, R., et al. Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae. Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).
  18. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  19. van den Wildenberg, S. M., et al. The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations. Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).
  20. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).
  21. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).
  22. Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins. J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).
  23. Loiodice, I., et al. Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast. Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).
  24. Kapitein, L. C., et al. Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules. Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).
  25. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  26. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  27. Mollinari, C., et al. PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone. J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).
  28. Braun, M., et al. Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart. Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).
  29. Lansky, Z., et al. Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks. Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).
  30. Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling. Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).
  31. Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. Reconstitution of cortical Dynein function. Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).
  32. Moudjou, M., Bornens, M. Method of centrosome isolation from cultured animal cells. Cell Biology: A laboratory handbook. Celis, J. E. 2, 111-119 (1998).
  33. Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
  34. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Lancaster, O. M., et al. Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation. Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).
  36. Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
  37. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  38. Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells. Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).
  39. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  40. Lawrimore, J., et al. DNA loops generate intracentromere tension in mitosis. J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).
  41. Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of cell geometry on division-plane positioning. Cell. 144 (3), 414-426 (2011).
  42. Taberner, N., et al. In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast. Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).
  43. Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).

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在球形乳液液滴中重建基础有丝分裂纺锤体
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