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方法文章

体外荧光素异硫氰酸酯标记的载药铁蛋白穿过大鼠血脑屏障的渗透性研究：一种用于纳米制剂分子递送研究的模型

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DOI：

10.3791/54279

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2016年8月22日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Dipartimento di Scienze Biomediche e Cliniche Luigi Sacco, Università di Milano, 2Dipartimento di Biotecnologie e Bioscienze, Università di Milano-Bicocca

本文内容

摘要

建立一种方法 体外 基于大鼠脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养的血脑屏障模型被建立并验证。该系统被证明是研究纳米制剂对荧光分子跨屏障渗透作用的有效工具。

摘要

脑微血管内皮细胞在周细胞和星形胶质细胞终足的支持下，导致血脑屏障（BBB）对大分子水溶性药物的通透性较低，从而给有效的药物治疗带来困难。近年来，为促进药物向脑部靶向递送，已提出多种策略以提高药物在该部位的递送效率和生物活性，包括用于药物穿越血脑屏障的创新性纳米递送系统。在此背景下，一种 体外 基于简化血脑屏障（BBB）细胞模型的方法为研究纳米制剂对分子跨BBB渗透性的影响提供了有效工具。本研究描述了一种双层BBB模型的构建，该模型由共培养的商用原代大鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞组成。同时介绍了一种多参数验证方法，包括跨内皮电阻和高分子量葡聚糖表观通透性的测定，以评估模型的有效性。为验证该BBB模型在研究不同纳米制剂对荧光分子跨屏障转运影响中的可行性，本文描述了将荧光素异硫氰酸酯（FITC）负载于铁蛋白纳米颗粒中的应用。通过转运通量测定和共聚焦显微镜分析，证实了铁蛋白可增强FITC的跨BBB渗透能力。结果表明，该系统可用于验证用于BBB药物递送的纳米系统的有效性。

引言

中枢神经系统（CNS）疾病（例如癌症、癫痫、抑郁症、精神分裂症以及HIV相关性神经系统疾病）对药物治疗的耐药性由多种不同机制导致，其中包括药物难以透过血脑屏障（BBB）。BBB是一种将脑组织与血液中循环物质隔离开来的边界结构。在此屏障中，由周细胞和星形胶质细胞终足支持的一层脑微血管内皮细胞（BMECs）对分子量大于400 Da的水溶性药物具有高度选择性1。另一种与药物相关的耐药机制则与BMECs上存在的药物外排转运蛋白（P-糖蛋白和多药耐药蛋白）有关，这些蛋白协同作用以减少药物向中枢神经系统的渗透，并促进药物从脑组织中排出2。

在过去十年中，已开发出大量纳米技术方法，以应对药物穿越血脑屏障（BBB）所面临的临床和生物学挑战3-6。在这一背景下，铁蛋白纳米球（FnN）代表了一种全新且极具前景的解决方案。FnN是由24个自组装的铁蛋白（Fn）单体组成的直径为12 nm的球形结构，其内部为空心结构，内径为8 nm。铁蛋白亚基可在酸性pH条件下解离，并通过将pH恢复至中性以形状记忆方式重新组装，从而实现多种有机分子的包封。因此，FnN为多功能药物递送系统的开发提供了一个颇具吸引力的模型7,8。此外，FnN可通过与转铁蛋白受体（TfR）1的特异性识别而与脑微血管内皮细胞（BMECs）相互作用，该受体表达于这些细胞的管腔膜上9。

迄今为止，不同的 体外 已开发出多种血脑屏障（BBB）模型，以阐明不同药物穿越BBB的通透性、对BBB的毒性作用，或分子与外排转运蛋白之间的相互作用。事实上，这些模型被认为具有有效性 体外 在进行后续工作之前，快速筛选活性分子的方法 体内 研究中使用的模型由单层脑微血管内皮细胞（BMECs）或共培养的BMECs与星形胶质细胞（较少见为周细胞）构成，这些细胞来源于动物（大鼠、小鼠、猪和牛）或人类细胞系。10,11,12跨内皮细胞电阻（TEER）和表观通透性（P应用程序)具有特定分子量的示踪剂代表用于确定质量的两个关键参数 体外 模型。本文描述了血脑屏障（BBB）的使用 体外 基于大鼠脑微血管内皮细胞（RBMECs）与大鼠皮层星形胶质细胞（RCAs）共培养的模型，用于研究包载异硫氰酸荧光素（FITC）的铁蛋白纳米笼经血脑屏障的渗透性。

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方案

1. 建立血脑屏障模型

注意：为建立血脑屏障模型，我们建议使用 commercially available 的原代 RBMECs 和 RCAs。所有步骤必须使用无菌试剂和一次性耗材，并在层流罩内进行操作。 

  1. 细胞培养
    1. 使用多聚-L-赖氨酸（100 µg/ml，室温孵育1小时）或纤维连接蛋白（50 µg/ml，37 °C孵育1小时）包被细胞培养瓶，以分别促进RCA或RBMEC的贴壁。随后，在内皮细胞培养基（sECM）中解冻1 × 106个RCA和5 × 105个RBMEC，该培养基补充有5%胎牛血清、1%内皮细胞生长添加剂和1%青霉素/链霉素。将RCA以20 ml sECM接种于T175培养瓶中，RBMEC以10 ml sECM接种于T75培养瓶中。
      注意：RCA和RBMEC的解冻与接种代次需根据拟在血脑屏障（BBB）模型中测试的实验条件数量，对细胞密度和培养时间进行相应调整。从1支含1 × 106个RCA和1支含5 × 105个RBMEC的冻存管开始，可制备最多20个含BBB的Transwell插入式培养小室。
    2. 将细胞在37 °C、5% CO2的湿化环境中培养约6天，直至RCA达到约80%汇合度，RBMEC达到90%以上汇合度。使用胰蛋白酶-EDTA溶液（胰蛋白酶1:250）消化5分钟（T75培养瓶加1 ml，T175培养瓶加2 ml），用sECM（按2:1比例）终止消化反应，将细胞悬液以750 × g离心5分钟，弃上清后将细胞沉淀重悬于60 ml sECM中。
    3. 将RBMEC分种至3个T175培养瓶中，在sECM中继续培养3天，之后接种至插入式培养小室中。通过光学显微镜下使用血球计数板（Burker计数室）观察台盼蓝1:1稀释的细胞悬液，计数活RCA的总数。
  2. 细胞接种至插入式培养小室
    1. 对6孔透明Transwell插入式培养小室的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜一侧使用多聚-L-赖氨酸（100 µg/ml）处理，另一侧使用纤维连接蛋白（50 µg/ml）处理，以分别促进RCA和BMEC的贴附。操作时需使用镊子夹持小室，避免接触PET膜。
      1. 将插入式培养小室放入6孔板中，向其上室加入纤维连接蛋白溶液（至少500 µl）。37 °C孵育1小时后，吸除纤维连接蛋白溶液，将小室从6孔板中取出并倒置放置于一个150 cm2培养皿底部，该培养皿在此作为已包被小室的无菌支撑物。
      2. 轻柔地将800 µl多聚-L-赖氨酸加至小室底部（如图1A所示；即RCA接种面），在室温下孵育1小时。
      3. 吸除溶液后，室温干燥15–30分钟。此时小室已可进行细胞接种，也可在4 °C下置于6孔板中保存数天，待后续进行BBB构建。
        注意：请至少保留3个已包被但未接种细胞的小室作为空白对照，用于通过FD40通量测定验证BBB模型的建立。
    2. 将RCA（35,000/cm2）接种至经多聚-L-赖氨酸包被的小室底部，将800 µl细胞悬液滴加至倒置的小室上（图1A）。室温孵育4小时，以确保细胞有效贴附于膜上。
    3. 吸除残余液体，将小室转移至含有2 ml sECM的孔中，并将6孔板置于37 °C、5% CO2的湿化环境中培养，每2天更换一次sECM。
    4. 3天后，当RCA已完全覆盖小室下表面时，按以下步骤将RBMEC接种至小室上表面：
      1. 从T175培养瓶中消化RBMEC，并按照步骤1.1.2和1.1.3所述方法计数活细胞总数。
      2. 将RBMEC（60,000/cm2）以1,000 µl sECM接种至小室上表面（图1B），同时保留3个小室仅含星形胶质细胞，作为TEER背景对照。将6孔板置于标准培养条件下。至少继续培养3天，每2天更换内室和下室的sECM。

2. 血脑屏障验证

  1. 跨上皮电阻（TEER）测量
    1. 第3天rd 共培养当天，通过将含有血脑屏障的插入式培养小室放入合适的测量 chamber（带有盖子，且 chamber 和盖子均含有一对电压感应和电流电极）中检测 TEER，chamber 内加入 4 ml sECM。连接至上皮组织伏特/欧姆计进行测量。
    2. 在对细胞构成的血脑屏障（BBB）系统进行TEER测量的同时，记录3个承载电阻抗电极阵列（RCAs）的插入物的TEER值，并从BBB系统测得的数值中减去这些值。将所得的TEER值乘以插入物的表面积（4.2 cm²），以获得最终的TEER值。2以 Ω × cm 表示结果2.
    3. 从第3个rd 共培养当天起，每天测量TEER。注意：在TEER初始上升阶段后，记录的数值应至少连续两天保持稳定（通常在第5天至第10天之间）。th 以及 7th 共培养当天）。此时，血脑屏障模型已准备好进行第二步验证（第2.2节）和/或跨血脑屏障实验。
      注意：第2.1节中描述的操作可在用于后续通透性实验（第3节）的同一血脑屏障系统上进行。操作需在无菌条件下进行。
  2. FITC-40 kDa葡聚糖跨血脑屏障转运
    1. 根据以下步骤，测量FD40从血脑屏障模型上室到下室的通量，并与3个空白插件（参见第1.2.1节注释）的通量进行比较：
      1. 在BBB模型的上室中加入1 mg/ml FD40（用sECM稀释），分别于1、2和3小时后从下室取出200 µl sECM，使用荧光分光光度计测定荧光强度（λex 488 nm，λem 515 nm，狭缝5）
      2. 通过使用相同的分析参数测量500 µl新鲜培养基，获得sECM背景荧光值。从所有FD40荧光值中减去sECM背景荧光值。
      3. 通过将测得的荧光值与已知浓度绘制的标准曲线进行比较，确定透过的FD40量（即0.312、0.625、1.25、2.5 µg/ml 的荧光示踪剂溶解于 500 µl sECM 中。
      4. 计算表观渗透系数（P应用程序根据平均通量值计算：
        P应用程序 J/AC
        其中，J 为分子的通量（mol/s），A 为渗透面积（cm²）2）而 C 是上室中该分子的浓度（摩尔/立方厘米）3).
        注意：必须专门使用三个或以上已达到合适TEER值的BBB系统进行本验证程序，且不应将其用于后续的通透性实验（第3节）。无菌并非必需。

3. 载有FITC的铁蛋白（FnN）跨血脑屏障转运

注意：一种在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达并组装成纳米笼（FnN）的人源铁蛋白（Fn）重组变体，可用于包载不同的荧光分子，可从意大利米兰比可卡大学Prosperi教授的NanoBioLab获取。FnN按照先前报道的方法13负载FITC，且Fn及所负载分子的浓度均已准确测定。 

  1. FITC与FITC-FnN的跨血脑屏障转运
    1. 测量经验证的血脑屏障模型中从上室到下室的FITC-FnN通量（通常在5th - 7th 共培养第7小时和24小时，按照以下步骤，与游离染料相比。
      1. 向每种配方的至少6个BBB系统上室中加入FITC-FnN（50 µg/ml FnN，1.1 µM FITC）或等量的游离FITC，分别在7小时后从至少3个插入式培养插件的下室中取出2 ml sECM溶液，并在24小时后从另外3个插入式培养插件的下室中取出2 ml sECM溶液。
      2. 使用荧光分光光度计测量所收集样品500 µl的荧光强度（λex 488 nm，λem 515 nm，狭缝 5）
      3. 使用相同的分析参数测定500 µl培养基以获得sECM背景荧光。从所有FITC或FITC-FnN荧光值中减去sECM背景荧光。
      4. 通过将测得的荧光值与两种已知浓度绘制的标准曲线进行比较，确定透过的FITC或FITC-FnN的浓度即. 6.87、13.75、27.5、55 nM）的游离或纳米制剂染料溶解于500 µl sECM中。
  2. RBMECs中FITC-FnN的定位
    1. 从BBB系统的上室中移除sECM，用PBS洗涤小室，然后向每个实验组至少两个小室的上室加入500 µl多聚甲醛（4%磷酸盐缓冲液-PBS），室温下固定10分钟，以固定RBMECs。
    2. 用 PBS 清洗插入物三次，以去除残留的多聚甲醛。
      注意：从此时起，无需保持无菌。
    3. 裁剪适当大小的PET膜片，并按照以下步骤对细胞进行免疫染色：
      1. 用含0.1% Triton X-100的PBS溶液对RBMECs进行10分钟的透化处理。随后在室温下用含2%牛血清白蛋白（BSA）和2%山羊血清的PBS溶液封闭1小时。将样本与1:20稀释的抗Von Willebrand因子（VWF）抗体在室温孵育2小时。
      2. 用 PBS 洗涤三次后，将细胞在室温下暴露于含合适二抗（1:300 稀释）和 DAPI（1:1,500 稀释）的 2% BSA、2% 小牛血清溶液中孵育 2 小时，以显示抗 VWR 信号并检测细胞核。
    4. 将插入片段用抗荧光淬灭封片液（每个片段一滴）固定在显微镜载玻片上，然后加盖盖玻片封片。使用40X油镜通过共聚焦显微镜进行观察分析。 放大倍数为1.5倍，分辨率1,024 × 1,024像素。

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结果

在构建血脑屏障（BBB）模型过程中，由于聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜具有透明特性，可通过光学显微镜监测细胞在插入膜上的贴壁与生长情况。脑周细胞（RCAs）以35,000个细胞/cm2的密度接种后，在室温孵育4小时即可高效贴附于插入膜的底面（图2A），并在3天内生长至覆盖膜表面，呈现纺锤形形态（图2B）。脑微血管内皮细胞（RBMECs）以60,000个细胞/cm2的密度接种后，约在37 °C孵育3小时即可明显贴附于PET膜的上表面（图2C）。在随后的几天中，由于RBMEC层与下方的RCA层重叠，使用光学显微镜观察发育中的RBMEC层可能较为困难（图2D）。

对血脑屏障模型的正确验证始终需要进行TEER测量，并可通过评估低通透性示踪剂（如FD40）的跨血脑屏障P

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讨论

本文所述的体外方法是一种经过验证的有效手段，可用于研究荧光分子在与纳米颗粒形成纳米制剂后穿越血脑屏障（BBB）的递送过程。本研究中采用FnN作为模型，其是研究货物分子跨BBB转运的理想候选载体。FnN被认为是实现药物/试剂跨BBB递送的金标准纳米载体，因为它可被BMECs管腔膜上表达的TfR1受体特异性识别，并通过受体介导的内吞途径促进纳米颗粒的摄取。此外，FnN是一种天然纳米颗粒，因此具有良好的生物相容性。最后，FnN可通过一种简单且高效的方式包载低分子量的水溶性分子。根据对纳米颗粒特性的若干考量，本实验方案也可用于评估其他不同类型有机或无机纳米颗粒的跨BBB渗透能力。研究纳米制剂化药物/试剂渗透性的首要前提是确保空白纳米颗粒的安全性。另一个关键问题是所研究的纳米颗粒与PET滤膜之间的相互作用。该方面需预先评估，以排除纳米颗粒在膜孔中发生显著滞留，避免其跨BBB渗透行为受到干扰。本课题组近期已应用该策略研究了一种聚合物包覆的氧化铁纳米颗粒作为荧光标记抗逆转录病毒药物的跨BBB递送系统14。在该研究中，我们将纳米制剂在大鼠脑微血管内皮细胞（RBMECs）中的电镜定位与荧光检测相结合。此外，还可采用...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢伦巴第大区卫生局和萨科医院（NanoMeDia 项目）提供的研究经费资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
大鼠脑微血管内皮细胞 InnoprotP10308从 Sprague Dawley 大鼠脑组织中分离，第1代冻存，冷冻运输
皮质星形胶质细胞 InnoprotP10202从出生2天的大鼠脑组织中分离，第1代冻存，冷冻运输
内皮细胞培养基试剂盒InnoprotP60104ECM（500 ml）、胎牛血清（25 ml）、内皮细胞生长添加剂（5 ml）和青霉素/链霉素（5 ml）。使用前在37 °C 水浴中预热，并避光保存
不含酚红的胰蛋白酶-EDTAEuroCloneECM0920D使用前在37 °C 水浴中预热
异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖 40,000SigmaFD40S避光保存
多聚甲醛 Sigma158127在通风橱中稀释
不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液EuroCloneECB4004L
曲拉通 X-100SigmaT8787
牛血清白蛋白 SigmaA7906
山羊血清 EuroCloneECS0200D
小鼠单克隆抗血管性血友病因子抗体DakoM0616
偶联 AlexaFluor 546 的抗小鼠 IgG 抗体ThermoFischer ScientificA-11003避光保存
DAPI（4’ ,6-二脒基-2-苯基吲哚） ThermoFischer ScientificD1306避光保存
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂ThermoFischer ScientificP36934
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐SigmaP1274同一溶液可多次使用
牛血浆来源的纤连蛋白 SigmaF1141同一溶液可多次使用
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）小室FalconF3090透明聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜；表面积：4.2 cm2；孔径 0.4 µm/表面积
T75 Primo TC 培养瓶EuroCloneET7076
T175 Primo TC 培养瓶EuroCloneET7181
EVOM2 上皮组织电压/电阻计   World Precision Instruments GermanyEVOM2
Endohm-24SNAP 杯World Precision Instruments GermanyENDOHM-24SNAP
带相机的明场/荧光显微镜Leica MicrosystemsDM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module 带相机的倒置活细胞显微镜 
共聚焦显微镜Leica MicrosystemsTCS SPE
荧光分光光度计JascoFP-8000

参考文献

  1. Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 (1), 3(2009).
  2. Löscher, W., Potschka, H. Drug resistance in brain disease and the role of efflux transporters. Nat Rev Neurosci. 6, 591-602 (2005).
  3. Xu, G., Mahajan, S., Roy, I., Yong, K. -T. Theranostic quantum dots for crossing blood-brain barrier in vitro and providing therapy of HIV-associated encephalopathy. Front Pharmacol. 15 (4), 140(2013).
  4. Masserini, M. Nanoparticles for Brain Drug Delivery. ISRN Biochem. , (2013).
  5. Sagar, V., Pilakka-Kanthikeel, S., Pottathil, R., Saxena, S. K., Nair, M. Towards nanomedicines for neuroAIDS. Rev. Med. Virol. 24 (2), 103-124 (2014).
  6. Kreuter, J. Drug delivery to the central nervous system by polymeric nanoparticles: What do we know. Adv. Drug Deliver. Rev. 71, 2-14 (2014).
  7. Arosio, P., Ingrassia, R., Cavadini, P. Ferritins: a family of molecules for iron storage, antioxidation and more. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (7), 589-599 (2009).
  8. Jääskeläinen, A., Soukka, T., Lamminmäki, U., Korpimäki, T., Virta, M. Development of a denaturation/renaturation-based production process for ferritin nanoparticles. Biotechnol. Bioeng. 102 (4), 1012-1024 (2009).
  9. Jefferies, W. A., Brandon, M. R., Hunt, S. V., Williams, A. F., Gatter, K. C., Mason, D. Y. Transferrin receptor on endothelium of brain capillaries. Nature. 312, 162-163 (1984).
  10. Deli, M. A., Abraham, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  11. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 71, 113-128 (2011).
  12. Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Mol Pharm. 11 (7), 1949-1963 (2014).
  13. Bellini, M., et al. Protein nanocages for self-triggered nuclear delivery of DNA-targeted chemotherapeutics in Cancer Cells. J. Control. Release. 196, 184-196 (2014).
  14. Fiandra, L., et al. Nanoformulation of antiretroviral drugs enhances their penetration across the blood brain barrier in mice. Nanomedicine. 11 (6), 1387-1397 (2015).
  15. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (BBB): a focus on BBB impermeability and receptor-mediated transport. J. Vis. Exp. , e51278(2014).
  16. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-13 (2007).

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