高通量筛选碳水化合物降解酶的新型不溶性显色底物检测试剂盒

摘要

一种用于酶筛选的高通量检测方法被描述。该多重即用型检测试剂盒包含预先选定的 C显色 P聚合物 H水凝胶（CPH）基质与复杂 我不溶性 C显色 B生物质（ICB）底物。靶向酶为多糖降解酶 内-酶和蛋白酶。

摘要

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) 在 体内 具有多种功能，并广泛应用于生物燃料、纺织、洗涤剂、造纸和食品工业中的工业加工过程。深入理解 CAZymes 对基础生物学和工业应用均具有重要意义。自然界中存在大量 CAZymes（尤其在微生物中），已有数十万种被收录并描述于 carbohydrate active enzyme 数据库（CAZy）中。然而，假定酶的发现速度已超过我们对其活性进行生化表征的能力。造成这一现象的原因之一在于，基因组和转录组测序技术及其相关生物信息学工具的进步使得候选 CAZymes 能够被快速识别，而用于确定酶生化特性的技术发展则相对缓慢。为弥补这一技术差距，本文介绍了一种基于不溶性显色底物的新型高通量检测试剂盒。共制备了两种不同类型的底物：Chromogenic Polymer Hydrogel（CPH）底物（由纯化的多糖和蛋白质制成）和 Insoluble Chromogenic Biomass（ICB）底物（由复杂的生物质材料制成）。CPH 和 ICB 底物均以 96 孔高通量检测系统形式提供。CPH 底物可制成四种不同颜色，可混合使用，从而提高检测通量。本实验方案描述了 96 孔板检测方法，并展示了该检测方法在筛选酶、酶复合物及发酵液活性中的应用。

引言

近年来，基因组和宏基因组挖掘技术迅速发展，克隆和表达重组酶的中高通量策略也取得了显著进展。此外，生物信息学资源及相关数据库（如CAZy）^1,2也大幅扩展。然而，在将微生物酶多样性应用于工业的过程中仍存在诸多挑战，酶活性的实验测定已成为当前的一大瓶颈。例如，据估计，利用现有方法，我们仅能可靠预测CAZy数据库中不超过4%的蛋白质的功能活性。尽管已有多种方法可用于监测酶活性，但这些方法均存在一定局限性。基于色谱结合质谱分析的成熟技术可用于评估糖苷水解酶（GH）活性产生的寡聚片段^3,4，但这些方法操作繁琐，通量普遍较低。基于还原糖测定的方法，如二硝基水杨酸⁵法和Nelson-Somogyi⁶法，被广泛用于GH活性检测，但这些检测方法通量有限，且易受副反应干扰。个别显色性多糖底物（如偶氮蓝交联底物，AZCL）也常用于酶活性测定，但逐一采购各类底物并手动将底物粉末分配至检测板孔中，操作繁琐且成本较高⁷。

我们开发了一代基于氯三嗪染料的新型显色聚合物水凝胶（CPH）底物，该底物与96孔过滤板联用时可构成高通量检测系统。此外还开发了额外的不溶性显色生物质（ICB）底物，可用于评估在木质纤维素生物质等复杂聚合物混合物中底物的可及性。每种底物可呈现四种颜色之一，不同颜色的底物可在同一孔中组合使用。本方案表明，该方法可广泛应用于多种多糖和蛋白质，并可用于糖苷水解酶（GHs）、裂解性多糖单加氧酶（LPMOs）及蛋白酶的筛选。文中提供了96孔板使用的具体操作流程，代表性结果展示了CPH与ICB底物试剂盒作为酶筛选工具的高效性。

无论使用何种底物，所述检测试剂盒的一个显著优势在于，经过活化步骤后，试剂盒可在15分钟内准备就绪并投入使用。这避免了像某些其他方法那样，需要耗费时间从原始底物材料开始逐项组装检测体系⁷。CPH和ICB底物具有优异的储存稳定性（室温下至少可保存一年）、pH稳定性和温度稳定性⁸，且无需特殊设备或专业培训。CPH或ICB检测基于96孔滤板进行，在滤板中完成酶与底物的反应。如果酶对特定底物具有活性，则会生成可溶性染色寡聚物，形成有色的上清液，随后可通过真空 manifold 或离心机将该上清液过滤至标准透明96孔板中⁸。

底物使用在可见光谱（VIS）范围内有吸收的氯三嗪染料进行染色，如果将不同颜色（红色、蓝色、黄色和绿色）的多种CPH底物混合于同一孔中，且酶作用于不止一种底物时，可通过线性回归分辨出各自的信号。反应完成后，含有上清液的微孔板可使用标准的多功能微孔板读数仪在可见光范围内测定吸光度。将不同颜色的多种底物混合于同一孔中，可提高检测系统的通量，在96孔板中最多可完成384个实验（每孔含4种不同颜色的底物）。

CPH 底物是评估酶特异性活性的有力工具，而 ICB 底物则用于评价酶在复杂底物混合物环境中降解特定组分的能力，这种环境更接近酶在生物质中通常所遇到的情况。尽管 ICB 底物无法提供有关单个酶特异性的信息，但它们仍是评估酶、酶组合或发酵液商业性能的有效工具。

方案

1. 采用CPH底物在96孔板中进行显色分析

1. 激活检测试剂盒板
   1. 向每孔中加入 200 µl 激活液（随试剂盒提供），以激活 96 孔过滤板（含蓝色 CPH-木聚糖）检测试剂盒板（材料列表），随后在室温下静置孵育 10 分钟，不进行振荡。
   2. 使用真空 manifold（内部装有间隔块，并以任意标准透明 96 孔板作为收集板）抽真空，以去除残留的激活液。也可改用离心机，在 2,700 × g 条件下离心 10 分钟完成此步骤。
   3. 通过向每孔加入 100 µl 无菌水清洗 CPH 底物，并施加真空（或离心力）以去除稳定剂。重复此步骤两次，此时板已准备就绪，可供使用。
2. 酶反应
   注意：始终设置仅含缓冲液的阴性对照，若条件允许，还应设置已知活性的酶作为阳性对照。使用适当数量的重复样本进行实验。CPH 底物在 pH 3.0 至 10.0 范围内稳定，每孔中缓冲液与酶溶液的总体积不得超过 180 µl。也可使用植物提取物或培养液代替纯化的酶溶液。
   1. 向检测试剂盒板的每孔中加入 150 µl 100 mM 醋酸钠缓冲液（pH 4.5）和 5 µl endo-纤维素酶溶液（终浓度为 1 U/ml）。
   2. 将产品板（一种适用于微孔板读数仪的透明孔板）置于检测试剂盒板下方，用于收集反应板在振荡过程中可能渗漏的液体。
   3. 将检测试剂盒板置于水平摇床中，在 25 °C 下以 150 rpm 振荡孵育 30 分钟。
      注意：孵育期间确保检测试剂盒板内反应体系充分混合，对获得一致且可重复的结果至关重要。CPH 底物在高达 90 °C 的温度下仍保持稳定。当使用 CPH 底物检测含有未知酶浓度的培养液时，孵育时间可延长至 24 小时。需注意，合适的孵育时间取决于酶的活性水平；但通常情况下，若在 24 小时内未检测到明显活性，则表明该酶可能无法降解所测试的底物。具有活性的酶会将 CPH 底物中的不溶性显色多糖降解为可溶性显色寡糖，后者表现为有颜色的上清液。
   4. 将洁净的产品板放入真空 manifold 内，并将间隔块置于其中。
   5. 将检测试剂盒板置于上方，施加真空（最大负压为 -60 kPa）。也可改用离心机，在 2,700 × g 条件下离心 10 分钟。
      注意：含有显色寡糖的滤液现已收集于产品板中，可用于后续分析⁸。
3. 检测与定量
   1. 通过肉眼观察，检查产品板各孔中液体体积是否大致相同。
   2. 使用酶标仪在 595 nm 波长下测定收集板中蓝色 CPH-木聚糖的吸光度。
   3. 数据分析时，从加酶孔的读数中减去仅含缓冲液的阴性对照孔的读数。根据重复孔的数据计算平均值及均值标准误（SEM）⁸。

2. 采用ICB底物的96孔显色检测法

1. 酶反应
   1. 向每孔含有红色ICB-小麦秸秆的检测试剂盒板中加入150 µl 100 mM乙酸钠缓冲液（pH 4.5）和5 µl 31 U/ml endo-木聚糖酶溶液（最终孔中酶浓度：1 U/ml）。
      注意：检测试剂盒板（含ICB底物的96孔滤板）的制备方法如文献所述（见材料清单）。ICB底物在pH 3.0至10.0范围内的缓冲液中稳定。实验中应始终设置仅含缓冲液的阴性对照、商用酶作为阳性对照，并使用适当数量的重复孔以满足统计学要求。
      1. 不要像激活CPH底物板那样激活ICB底物，而是通过加入100 µl水洗涤三次，并进行真空过滤或离心，以去除稳定剂。
   2. 将产物收集板置于底物板下方，以收集在振荡过程中可能从底物板泄漏的液体。
   3. 在25 °C、150 rpm振荡条件下孵育反应2小时。
      注意：活性酶会将ICB底物中的不溶性显色多糖降解为可溶性寡糖，表现为有颜色的上清液。ICB底物在高达90 °C的温度下仍保持稳定。若使用未经纯化的酶（如培养液），应将孵育时间延长至最多24小时。
   4. 将产物收集板放入真空装置内，并将间隔块置于其中。
   5. 将检测试剂盒板置于上方，施加真空（最大负压-60 kPa）或使用离心机，使反应产物从检测试剂盒板过滤至产物收集板的各孔中。
      注意：含有显色寡糖的滤液现已进入收集板，可用于后续分析⁸。
2. 检测与定量
   1. 通过肉眼观察，检查收集板各孔中液体体积是否大致相同。
   2. 使用酶标仪在517 nm波长下读取收集板中红色ICB-小麦秸秆样品的吸光度。
   3. 数据分析时，从加酶孔的读数中减去仅含缓冲液的阴性对照值。根据重复孔的数据计算平均值及平均值的标准误差（SEM）⁸。
      注意：若用于筛选未知酶，建议进行系列稀释，以获得更详细的酶活性动态范围数据。

结果

该检测方法的高通量和多重检测能力基于排列在96孔滤板中的不溶性显色聚合物（或蛋白质）水凝胶（CPH）底物。将酶及阴性对照加入检测试剂盒板中（图1A），酶会降解相应的底物，产生有色的上清液（图1B）。反应完成后，将上清液转移至透明孔的产物板中，可直接使用适用于96孔板的分光光度计测定吸光度（图1C）。

不同酶浓度（0.00 - 0.75 U/ml）下CPH-阿拉伯木聚糖对木聚糖酶的剂量反应示例见图1D，其中可直观观察到酶浓度降低的效果。可通过更详细的分光光度法定量分析，绘制吸光度与酶浓度的关系曲线（图1E）。信号强度对应于酶活性。误差棒（三次重复实验的平均值标准误，SEM）显示了该检测的可重复性。有关该检测可重复性的更详细实验已在其他文献中发表⁸。

图 1. CPH-阿拉伯木聚糖的木聚糖酶处理。 A) 检测试剂盒板的示意图，将CPH底物（e.g.，CPH-阿拉伯木聚糖）加入96孔滤板的孔中，随后加入酶1和酶2以及仅含缓冲液的对照（酶1具有endo-木聚糖酶活性）；B) 酶1对CPH-阿拉伯木聚糖的降解产生有色上清液；C) 通过真空辅助将上清液过滤至产物板后，使用分光光度法测定吸光度；D) 产物板包含在不同浓度的endo-β-1,4-木聚糖酶、100 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.5）中室温反应60分钟后，CPH-阿拉伯木聚糖反应生成的四种不同颜色的产物；E) 使用分光光度法对D中的反应产物进行定量分析。请点击此处查看该图的放大版本。

在酶筛选中使用该检测方法有多种选择。一种选择是使用含有不同多糖的96孔板进行筛选， 例如， 少量（纯化的） 内-活性未知的酶。在这种情况下，结果将显示目标酶能够降解哪些多糖。为了展示这一原理，一个 内皮在25 °C下，对不同CPH底物测试了纤维素酶活性。分别使用三种不同酶浓度（0.5 U/ml、1.0 U/ml和5 U/ml）孵育30分钟。结果在产物板中清晰可见图2A）。该产品的说明书 内-供应商提供的纤维素酶标明对木葡聚糖（刺槐）、大麦β-葡聚糖、葡甘露聚糖、桦木木聚糖具有侧向活性，对半乳甘露聚糖具有较低的侧向活性。与此一致，检测到除纤维素酶活性外，还对CPH-β-葡聚糖（大麦）、CPH-木葡聚糖（刺槐）、CPH-木聚糖（山毛榉木）具有额外活性，对CPH-半乳甘露聚糖具有较低活性图2B）。未对葡甘露聚糖进行测试。在与前述实验相同的条件下，使用市售酶（三种不同酶浓度：0.1 U/ml、0.5 U/ml 和 1.0 U/ml）消化相同的CPH底物作为阳性对照。所有底物均可被阳性对照酶降解，且信号强度随酶浓度升高而增加。图 2C).

图2. 八种不同的CPH底物在25 °C下振荡孵育30分钟。 A) 不同CPH底物经消化后的产物板 内-纤维素酶，不同浓度。 B) 活性及多种副活性的定量分析 内-纤维素酶。误差棒表示三次重复的平均值标准误差。 C) 不同商业酶对相应CPH底物的活性（内切纤维素酶与2-HE-纤维素；E-LAMSE与CPH-松蕈素、CPH-裂褶多糖、CPH-β-葡聚糖（大麦）；E-XYAN4与CPH-木聚糖；E-XEGP与CPH-木葡聚糖；E-BLAAM与CPH-直链淀粉；E-BMACJ与CPH-半乳甘露聚糖；所有酶均来自Megazyme）。误差线表示两个重复样本的平均值标准误。 请点击此处以查看此图的放大版本。

不溶性显色生物质（ICB）底物是对显色底物体系的有益补充，因为它们在一定程度上保留了植物细胞壁中多糖的天然排列结构，而植物细胞壁是生物质的主要组成成分。在本示例中，我们使用CPH和ICB底物来分析液体培养条件下分泌的Phanerochaete chrysosporium酶。检测试剂盒板的布局如图3A所示，包含19种CPH底物和5种ICB底物（每种底物设4个孔，图3B）。P. chrysosporium培养三天后，收集培养上清液进行分析。向每个孔中加入125 µl 200 mM缓冲液，并添加25 µl培养上清液。使用pH 4.0的醋酸钠缓冲液、pH 6.0或pH 8.0的磷酸钠缓冲液，测试了三种不同的pH条件（图3C）。将酶标板置于25 °C、150 rpm振荡条件下孵育2小时。

反应产物被转移至产物板（图3D）并进行分析。P. chrysosporium 产生了可降解多种葡聚糖、淀粉和木聚糖的酶（图3E）。对于半纤维素中的阿拉伯聚糖（甜菜来源）和果胶半乳聚糖，以及RGI（大豆来源），检测到的信号较弱。所产酶在酸性条件（pH 4.0）下的活性高于中性或弱碱性条件（pH 8.0）。对ICB底物较低的作用活性（图3F）表明，当多糖处于更接近天然的状态时，酶的效率与作用于纯多糖时不同，因此ICB底物能够更真实地反映酶在应用于原始或预处理植物材料时的实际效率。

图3. 利用含19种CPH和5种ICB底物的多底物板，对培养3天的 Phanerochaete chrysosporium 液体培养物上清液进行筛选。A) 板式设计示意图，每种单独底物设4个孔（灰色背景=CPH底物，橙色背景=ICB底物）。B) 含底物的检测板实物图。C) 实验所用缓冲条件示意图（200 mM醋酸钠，pH 4.0；磷酸钠，pH 6.0；磷酸钠，pH 8.0）。D) 25 °C反应2小时后的产物板实物图。E) 在517 nm处检测吸光度，并针对每种单独的CPH底物进行作图；F) 相应酶作用下的ICB底物检测结果。请点击此处查看该图的放大版本。

也可使用不同颜色的CPH底物混合物，在一个孔中研究协同效应，并在使用单一酶或酶混合物处理后，分析反应上清液。

在下图图4所示的示例中，红色CPH-纤维素和黄色CPH-木聚糖底物以大致相等的比例混合，加入96孔滤板的各个孔中。图4A显示了在室温下处理1小时后产生的有色反应产物，反应条件分别为：无酶（对照）、纤维素酶cel（2 U/ml）、木聚糖酶xyl（1 U/ml）以及两种酶的混合物（每种处理设3个重复），反应缓冲液为100 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.5）。在分析时，通过扫描350 nm至700 nm波长范围内的吸收光谱，采用分光光度法对反应产物进行定量（图4B）。通常仅通过肉眼观察即可初步判断酶是否作用于单一或多种底物，但也可利用简单的线性回归方法⁸解析来自不同染料的吸收光谱数据，从而更准确地评估混合物中每种底物的降解程度。

使用CPH底物的混合物可显著提高检测通量，使单次实验（一个孔）中能够同时针对多达4种不同底物进行筛选。图示示例中使用了四种不同的底物：蓝色CPH-β-葡聚糖（大麦）、黄色CPH-木聚糖（山毛榉木）、绿色CPH-直链淀粉和红色CPH-果胶半乳聚糖（羽扇豆）。底物板的布局如图所示 图 4C 和检测板的图片 图4D在25 °C、150 rpm条件下，于100 mM醋酸钠缓冲液（pH 4.5）中反应30分钟。首先测试单个酶在酶浓度递增时与相应CPH底物的反应情况（图4E）并按预期在产物板中接收到有色上清液（图4F，第1A-12D行。E行包含两种不同的CPH底物：黄色CPH-木聚糖和蓝色CPH-β-葡聚糖，它们被相应的酶以不同比例降解 内-木聚糖酶和 内皮-葡聚糖酶。反应结束后，结果可在产物板中观察到：反应产物颜色越深绿偏蓝，表明生成的产物越多 内-葡聚糖酶存在（图4F，4E-6E）并转变为较浅的黄绿色，当 内-木聚糖酶浓度增加（图4F，10-12E）。在F行中也可观察到相同现象，其中两种底物红色CPH-果胶半乳聚糖和黄色CPH-木聚糖被降解 内-半乳糖苷酶和 内皮-木聚糖酶。四种不同颜色的CPH底物均存在（图4F，1G-12F）单个酶可降解相应的CPH底物，通过添加额外的酶可获得多种有色反应产物的组合。

图4. 两种不同的CPH底物组合，即红色CPH-纤维素和黄色CPH-木聚糖，经不同酶处理。A） 两种底物经处理后的反应上清液 内-纤维素酶（细胞）或 内-木聚糖酶（木糖）或两种酶。 B) 反应上清液的吸光度光谱。四种不同CPH底物与不同酶处理的组合。 C) 底物板示意图，包含以下CPH底物：蓝色为CPH-β-葡聚糖（大麦），黄色为CPH-木聚糖（山毛榉木），绿色为CPH-直链淀粉，红色为CPH-果胶半乳聚糖（羽扇豆）。 D) 含有不同CPH底物的检测板示意图。 E) 产品板示意图，显示所添加酶的比例（标称浓度（NC）： 谷氨酸 = 1 U/ml 内皮-葡聚糖酶， 木糖 = 1 U/ml 内-木聚糖酶， amy = 5 U/ml 内皮-淀粉酶和 半乳糖 0.5 U/ml 内-半乳糖苷酶) F) 25 °C孵育30分钟后产物板的照片。 请点击此处查看此图的放大版本。

底物	来源
CPH-2-羟乙基纤维素	N/A
(CPH-2-HE-纤维素)
CPH-支链淀粉	马铃薯
CPH-直链淀粉	马铃薯
CPH-阿拉伯聚糖	甜菜
CPH-阿拉伯木聚糖	小麦
CPH-酪蛋白	牛乳
CPH-壳聚糖	动物来源
CPH-酵母葡聚糖	产碱杆菌粪产碱亚种
CPH-葡聚糖	明串珠菌属 spp.
CPH-半乳甘露聚糖	角豆
CPH-海带多糖	掌状海带
CPH-地衣聚糖	冰岛苔衣
CPH-甲基纤维素	N/A
CPH-pachyman	茯苓
CPH-果胶半乳糖聚糖	马铃薯
CPH-普鲁兰多糖	出芽短梗霉
CPH-鼠李糖半乳糖醛酸聚糖 I (RG I)	马铃薯
CPH-鼠李半乳糖醛酸聚糖 I (-Gal)*	马铃薯
CPH-鼠李糖半乳糖醛酸聚糖	大豆
CPH-木聚糖	山毛榉木
CPH-木葡聚糖	酸豆
来自大麦的CPH-β-葡聚糖	大麦
燕麦来源的CPH-β-葡聚糖	燕麦
来自酵母的CPH-β-葡聚糖	酵母
ICB-拟南芥	莲座叶来自 拟南芥 Col-0（成年植株）
ICB-拟南芥种子	拟南芥
ICB-甘蔗渣	甘蔗 （干燥的成年植株，茎和叶）
ICB-结晶纤维素（滤纸）	商用 Whatman 3MM Chr 层析纸
ICB-胡芦巴种子	胡芦巴属 spp. 种子
ICB-大麻	大麻属植物 （干燥的成年植株，茎和叶）
ICB-羽扇豆种子	Lupinus angustifolius 种子
ICB-花粉 P. pratense	梯牧草 花粉
ICB-云杉	云杉属 spp. （研磨的树干）
ICB-烟草	来自叶片的 Nicotiana benthamiana （幼苗）
ICB-小麦秸秆	小麦属 spp. （干燥的成年植株，茎和叶）
ICB-柳树	Salix spp. （干燥的成年植株，研磨的树干）
ICB-高粱	高粱属 spp. （成年植株的叶片）
（用β-1,4-D-半乳聚糖侧链去除 内-β-1,4-D-半乳糖苷酶

表1. 可用的显色性聚合物水凝胶（CPH）和不溶性显色性生物质（ICB）底物列表。

讨论

我们正在使用新一代的多色CPH和ICB底物，这些底物基于氯三嗪染料（底物的完整列表见表1），并组装在一种定制设计的商用检测试剂盒中。酶对底物的消化会产生小分子、可溶性的染色产物，这些产物可在检测溶液中被检测，并可通过酶标仪进行定量⁹。该检测方法专为评估内切酶活性而设计，其灵敏度与使用偶氮素交联（AZCL）底物的方法相似¹⁰，而针对外切酶活性则有其他可用方法^11,12。该检测试剂盒的局限性在于其仅适用于检测内切酶活性，因为CPH以及ICB底物很可能由于染料和交联分子造成的空间位阻，无法被外切酶降解⁸。

该实验采用96孔板进行，每个独立反应在孔中发生。反应液必须在板内充分混匀，以获得可重复的数据。反应后的上清液经滤过进入产物板，可通过吸光度光谱法定量测定每孔的吸光度。该实验的基本原理和布局如图1所示。该实验包括一个含有底物的实验板（96孔滤板），经酶孵育后，上清液被滤入透明孔板中，测定吸光度，从而对酶的特异性和活性进行半定量分析。已有研究表明，利用CPH底物的这一筛选实验也可用于琼脂平板体系，其中可溶性反应产物在过夜孵育后形成有色晕圈。⁸

如图2所示，该检测试剂盒可用于筛选纯化的酶及其潜在的副反应活性。副反应活性可能源于单个酶的混杂特异性，也可能由于所分析的样品是多种酶的混合物，因而需要研究它们之间的协同效应。此外，如先前研究所示，酶混合物、肠道微生物群¹³以及真菌的培养液⁸，还有内源性植物酶和细菌（未发表数据）均可作为酶的来源。

ICB底物可用于处理在生物质降解的工业过程中常遇到的复杂细胞壁组分混合物。这些底物旨在评估多糖的可及性，并为如何有效优化降解酶组合以提高降解效率提供信息。如图3所示，CPH和ICB底物可并行用于酶的筛选——从而揭示酶在偏好底物（CPH）环境以及更接近天然大分子组装结构的复杂环境（ICB，除偏好底物外还包含其他组分）中的特异性和活性信息。使用多种颜色可实现对不同底物上多种酶活性的同时检测，从而提高检测的高通量性和多重性。不同染料的光谱可通过简单的线性回归解析，大多数情况下仅通过肉眼观察即可识别多底物活性。此类实验及其结果的模拟示例如图4所示。

该检测工具箱及其应用的广泛适用性非常适用于对具有未知活性的酶和培养液进行初筛。该检测方法最重要的特点是高通量性、可定制性、操作简便性和灵活性。基于此，我们认为，这一新型工具组合将显著改进并加速工业和学术研究中的酶筛选流程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
检测试剂盒板	Glycospot		定制检测试剂盒板
活化溶液	Glycospot		用于活化CPH底物
350 ml接收板间隔块（用于真空多孔板装置）	Pall Corporation	5015	间隔块
96孔MultiScreen HV滤膜板，0.45 µm，透明，非无菌	Millipore	MSHVN4510	检测板
96孔聚丙烯微量板	Greiner Bio-One	651201	洗涤底物后的收集板
Nunc MicroWell 96孔微量板	Thermo Scientific	269620	产物板
隔膜泵 MZ 2 NT	Vacuubrand	732000	与真空多孔板装置配合使用的真空泵
Infors HT Ecotron	Infors HT	4950132 (Buch & Holm)	水平摇床
SpectraMax M5	Molecular Devices	10067-750 (VWR)	96孔板吸光度读数仪
真空多孔板装置	Pall Corporation	5017	真空多孔板装置
endo-纤维素酶（EGII）（Trichoderma longibrachiatum）	Megazyme	E-CELTR	纤维素酶 [cel]
endo-β-1,4-甘露聚糖酶（Cellvibrio japonicus）	Megazyme	E-BMACJ	甘露聚糖酶 [man]
endo-β-1,3-葡聚糖酶（Trichoderma spp.）	Megazyme	E-LAMSE	β-葡聚糖酶 [glu]
endo-β-1,4-D-半乳聚糖酶（Aspergillus niger）	Megazyme	E-EGALN	半乳聚糖酶 [gal]
endo-β-1,4-木聚糖酶 M4（Aspergillus niger）	Megazyme	E-XYAN4	木聚糖酶 [xyl]
endo-木葡聚糖酶（GH5）（Paenibacillus sp.）	Megazyme	E-XEGP	木葡聚糖酶 [xg]
α-淀粉酶（Bacillus licheniformis）	Megazyme	E-BLAAM	淀粉酶 [amy]