糖尿病研究领域面临的关键挑战是阐明调控胰岛β细胞复制的分子机制，并开发出促进β细胞再生的方法。本文介绍了一种高内涵筛选方法，用于鉴定和评估小分子促进β细胞复制的活性。
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摘要
摘要
胰岛素生成性β细胞的丧失是糖尿病的核心特征。尽管目前正在探索多种潜在的替代疗法，但扩增内源性胰岛素生成性胰岛β细胞仍是一种具有吸引力的策略。β细胞的自发再生能力有限，因此，一项关键的研究方向是深入理解抑制β细胞增殖的分子通路，并鉴定能够克服这些抑制作用的药物。本文介绍了一种基于自动化高内涵成像的原代细胞筛选方法，用于鉴定促进β细胞复制的小分子化合物。该方法克服了以往多种方法的局限性。首先，采用原代胰岛细胞而非永生化细胞系，可最大程度地保留 体内 生长抑制因素。其次，采用混合组成的胰岛细胞培养物而非β细胞系，可识别出谱系特异性及广谱性的生长刺激因子。第三，通过使用384孔板格式，该技术使原代胰岛的应用变得切实可行，从而克服了原代胰岛作为有限资源的制约。第四，通过优化胰岛分离、分散、铺板和培养参数，克服了因胰岛培养质量不稳定而导致的实验变异性问题。第五，通过优化免疫染色参数、自动化数据采集和数据分析，克服了准确且一致地测量胰岛内分泌细胞低基础复制率的困难；自动化同时提高了通量并减少了实验者偏倚。该检测方法的显著局限性包括：使用分散的胰岛细胞培养物会破坏胰岛结构，使用啮齿类动物而非人胰岛，以及使用原代细胞所带来的通量和成本固有局限。重要的是，该策略可轻松适用于人胰岛复制研究。该检测方法非常适合用于研究物质对β细胞的促有丝分裂效应及其调控β细胞生长的分子机制。
引言
糖尿病是一组以葡萄糖稳态失衡为共同终末表现的疾病。尽管糖尿病各亚型的致病机制不同，但均导致β细胞质量减少这一共同后果。 即胰岛素生成能力丧失1,2目前，糖尿病的治疗策略依赖于外源性胰岛素的长期给药、药物刺激胰岛素生成或提高胰岛素敏感性，极少数情况下采用胰岛细胞或全胰腺移植3,4遗憾的是，这些策略的效果短暂和/或无法充分模拟内源性胰岛素分泌功能。尽管开发出能够促进β细胞再生的方法具有重要意义，但目前尚无此类有效手段。因此，糖尿病研究的一个重要目标是开发出生成新β细胞或扩增内源性β细胞质量的方法。5尽管来自胚胎干细胞等可再生资源的β细胞再生技术正在取得进展，但出于对安全性和效率的担忧，探索包括成熟β细胞扩增在内的替代策略仍被列为优先方向6,7重要的是，新生β细胞的主要来源 体内 是已存在的β细胞，而非特化的前体细胞8,9尽管β细胞似乎具有有限的增殖能力，但β细胞质量的轻微增加（约30%）可能足以恢复许多糖尿病患者的葡萄糖稳态。此外， 原位 通过药物刺激β细胞质量是一种潜在的低成本且可扩展的治疗策略。本文介绍了一种高内涵筛选方法，用于鉴定和表征能够促进β细胞生长的小分子。
多种体外实验方法可用于鉴定促进初级β细胞复制的基因产物和/或分子。早期测量β细胞复制诱导作用的研究采用胎鼠胰腺培养或完整分离的胰岛培....
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方案
本方案严格遵循斯坦福大学医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）的规定进行。所述方案适用于从六只250–300 g（8–9周龄）雄性Sprague Dawley大鼠中分离胰岛，所获胰岛量足以进行384孔板中228个孔的胰岛细胞增殖评估。
1. 材料准备
- 在开始胰岛分离前，准备包被培养基：收集在15 cm组织培养皿中汇合培养3天的804G大鼠膀胱癌细胞的条件培养基（含20 ml RPMI1640）28。经无菌过滤后，将条件培养基储存于-20 °C，以备后续使用。
- 在开始胰岛分离前，对以下手术器械进行灭菌处理：一把12 cm带齿组织镊、一把11.5 cm精细剪刀、一把14.5 cm外科剪刀、两把16 cm弯头镊、一把12 cm弯头止血钳、一把12 cm手术刀柄，以及一个30目组织筛。
- 通过将纯化的I型与II型胶原酶按60%:40%的比例混合（总胶原酶活性为300,000 - 400,000单位），溶解于60 ml含钙和镁的1×Hanks平衡盐溶液（HBSS）中，制备胰腺消化液。将10 ml消化缓冲液分装至六支10 ml注射器中（每支配备1" 22 G针头），置于冰上备用。
注意：每只大鼠注射10 ml消化液。请根据实验动物数量相应调整配制量。 - 在通风橱内配制4.5 ml麻醉混合液：混合1.3 ml氯胺酮（100 mg/ml）、0.2 ml赛拉嗪（100 m....
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结果
为了评估β细胞或α细胞的复制情况，需要采用四色检测方案。首先，通过DAPI染色（通道1，386 nm）识别所有细胞对象。接着，计数β细胞（事件1）：同时表达PDX-1+（通道2，650 nm）和核周胰岛素（通道3，549 nm）的细胞对象。随后，计数正在复制的β细胞（事件2）：在β细胞（事件1）中同时表达Ki-67（通道4，485 nm）的细胞（图3）。复制β细胞的百分比计算公式为：(事件2/事件1) × 100。为了定量分析α细胞的复制，首先通过DAPI染色（通道1）识别全部细胞对象，然后通过PDX-1染色缺失（通道2）和核周胰高血糖素染色阳性（通道3）来确定α细胞（事件1）。复制中的α细胞（事件2）是指同时表达Ki-67（通道4）的α细胞数量（图 4）。复制α细胞的百分比计算公式为：(事件2/事件1) × 100。
在开始实验.......
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讨论
研究调控β细胞生长与再生的分子通路的实验方法，是糖尿病研究人员的重要工具。本文介绍了一种基于大鼠胰岛的筛选平台，可用于鉴定和表征小分子β细胞复制刺激剂。
尽管本方案的大多数步骤经验丰富的研究人员均可轻松完成，但仍有少数步骤需要特殊的技术。首先，在胰岛分离过程中，对胆管进行插管而不破坏其完整性需要一定的操作经验。一个有效的策略是先轻微膨胀胆管，以确保在完全注入胰腺消化液之前针头位置正确。其次，从外分泌组织中高效分离胰岛需要密切注意消化时间和适当的振荡。应通过间歇性旋转确保消化过程中受热均匀。第三，实验成功的关键在于手动挑选胰岛时能够熟练区分胰岛与外分泌组织碎片；这一技能随着实践会逐步提高。第四，胰岛的分散和铺板应使所有胰岛被分散为单细胞和由两到三个细胞组成的小细胞团的混合物。铺板前对胰岛的过度或不足消化均会影响实验结果。新铺板的胰岛细胞应在48小时内保持未受干扰状态，使其贴壁，并在铺板后达到约50%的融合度后再进行后续操作。图1展示了铺板后不同时间点成功培养的胰岛细胞的形态。第五，对胰岛细胞培养物更换培养基时应小心操作，以避免破坏贴壁较弱的细胞。第六.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）NIDDK 资助项目 DK098143 和 DK101530（JPA），以及斯坦福大学 Spectrum 儿童健康研究所（CHRI）和 SPARK 项目（UL1 TR001085，JPA）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 250 g 雄性 Sprague Dawley 大鼠 | Charles River | 品系编号 # 400 | |
| 12 cm 齿状组织镊 | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| 11.5 cm 精细剪刀 | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| 14.5 cm 外科剪刀 | Fine Science Tools | 14001-14 | |
| 16 cm 弯头镊子 | Fine Science Tools | 11003-16 | |
| 12 cm 弯头止血钳 | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| 12 cm 手术刀柄 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| 组织筛网-30 目 | Bellco Glass | 1985-85000 | |
| Cizyme RI，375,000 CDA 单位 | VitaCyte | 005-1030 | |
| Hanks' 平衡盐溶液（含 Ca++ 和 Mg++） | Gibco | 24020-117 | |
| 盐酸氯胺酮（200 mg/20 ml） | JHP Pharmaceuticals | NDC# 42023-113-10 | 用于配制麻醉混合液 |
| 赛拉嗪（5 g/50 ml） | LLOYD | NADA# 139-236 | 用于配制麻醉混合液 |
| Histopaque 1077 | Sigma | H-1077 | 用于配制 Histopaque 1100 |
| Histopaque 1119 | Sigma | H-1119 | 用于配制 Histopaque 1100 |
| 新生小牛血清 500 ml | Hyclone | SH30118.03 | |
| Hanks' 平衡盐溶液 | Hyclone | SH30268.01 | |
| Dulbecco 改良 Eagle 培养基/低糖 | Hyclone | SH30021.01 | |
| 功能/活性检测溶液 | Mediatech | 99-768-CV | |
| RPMI1640 培养基 | Hyclone | SH30096.01 | 用于配制条件培养基 |
| 804G 大鼠膀胱癌细胞系 | 可应要求提供 | 用于配制条件培养基 | |
| 胎牛血清，经鉴定合格 | Gibco | 26160 | |
| GlutaMax-I | Gibco | 35050-061 | |
| 青霉素（5,000 IU/ml）/链霉素（5 mg/ml） | MP Biomedicals | 1670049 | |
| 甲酰胺 500 ml | Fisher BioReagents | BP227-500 | |
| 抗原修复溶液 250 ml（pH 6.0） | Vector Laboratories | H-3300 | 用于配制 0.15 M 柠檬酸钠溶液 |
| 无水右旋糖 | EMD Chemicals | DX0145-1 | 用于配制 1 M 葡萄糖溶液 |
| 正常驴血清（粉末） | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| 小鼠抗人 Ki67 抗体 | BD Biosciences | 556003 | |
| 山羊抗人 PDX-1 抗体 | R&D Systems | AF2419 | |
| 多克隆豚鼠抗胰岛素抗体 | Dako | 2016-08 | |
| 多克隆兔抗胰高血糖素抗体 | Dako | 2014-06 | |
| 多克隆兔抗生长抑素抗体 | Dako | 2011-08 | |
| 多克隆鸡抗波形蛋白抗体 | abcam | ab24525 | |
| 生物素-SP 标记驴抗小鼠 IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | |
| 链霉亲和素，Alexa Fluor 488 标记 | Invitrogen | S32354 | |
| 罗丹明标记驴抗山羊 IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-025-147 | |
| 罗丹明标记驴抗豚鼠 IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-025-148 | |
| 罗丹明标记驴抗兔 IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-025-152 | |
| Cy5 标记驴抗豚鼠 IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | |
| Cy5 标记驴抗山羊 IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | |
| Cy5 标记驴抗兔 IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-175-152 | |
| Cy5 标记驴抗鸡 IgG | Jackson ImmunoResearch | 703-175-155 | |
| DAPI | Millipore | S7113 | |
| 一次性试剂储液槽 25 ml | Sorenson BioScience | 39900 | |
| 384 孔黑色/透明细胞培养处理板 | BD Falcon | 353962 | |
| 96 孔黑色/透明细胞培养处理板 | Costar | 3603 | |
| 多通道移液器 | Costar | 4880 | |
| 12 通道真空吸液器 | Drummond | 3-000-096 | |
| 细胞刮刀 | Falcon | 353085 | |
| Isotemp 水浴锅型号 2223 | Fisher Scientific | ||
| 高内涵筛选仪器：ArrayScan VTI | Thermo Scientific |
参考文献
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. Islet pathology and the pathogen....
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