用于RNA和DNA提取的福尔马林固定石蜡包埋组织芯的制备

摘要

这种改进的提取方案可从组织病理学组织块中更精确靶向的目标区域提高RNA和DNA的得率。

摘要

福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPET）是分子研究中一种具有重要价值且注释详尽的样本材料。然而，由于组织成分的异质性以及核酸提取得率较低，FFPET在分子分析中的应用面临挑战。文献检索显示，目前极少有实验方案能够解决上述问题，更未见任何经过验证的、可从FFPET特定区域同步提取RNA和DNA的方法。本方法有效解决了这两个难题。通过在显微镜玻片上标记感兴趣的癌组织区域，并将这些注释信息转移至FFPET组织块，实现了组织特异性取材。使用0.6 mm的微阵列打孔针从目标区域获取组织芯。采用商业化的FFPET核酸提取系统进行核酸提取，并对匀浆、脱蜡及蛋白酶K消化步骤进行了优化，以增强组织消化效果并提高核酸得率。改进后的方案可获得足量且高质量的核酸，适用于多种下游分析，包括多指标基因表达检测平台、mRNA表达的逆转录实时PCR分析，以及DNA甲基化的甲基化特异性PCR（MSP）分析。

引言

基因组生物标志物研究旨在识别能够准确、可靠地反映疾病状态，并以具有临床实用性的分子相关指标。¹ 生物标志物的开发依赖于对经过良好注释的组织样本进行回顾性分析。疾病组织与正常组织样本通常以两种形式保存：一种是存放在专业生物样本库中的新鲜冷冻组织，另一种是临床档案中保存的福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPET）块。新鲜冷冻组织可提取高质量的核酸，已被广泛应用于基因组生物标志物的发现研究中。^2,3 然而，生物样本库中可用的组织样本数量较少，且此类组织的研究容易产生偏倚，倾向于纳入体积较大的样本、罕见类型的疾病，以及在具备更强组织保存能力的专科医疗中心就诊的患者。⁴ 相比之下，FFPET是人类和动物疾病组织保存的常规方法。尽管FFPET块能够保持细胞形态，但固定过程会导致核酸与其他细胞成分发生交联。交联后的RNA和DNA仍可被回收，但仅以降解且高度片段化的形式存在。^5,6 尽管如此，这些DNA和RNA片段仍适用于越来越多的检测方法进行分析，包括mRNA表达检测、DNA高甲基化分析以及靶向测序等。^7,8 为了充分利用研究中可获得的大量且多样化的FFPET资源，亟需一种高效且可靠的核酸提取方案。

组织中的生物标志物研究大部分集中于癌症。与其他类型的病变组织一样，癌组织通常在细胞保存状态和细胞类型方面表现出显著的区域性异质性。由于生物标志物研究依赖于将病变组织的组分与分子特征相关联的能力，因此该过程的关键步骤是精确采集保存良好且富含目标疾病细胞的组织。在福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPET）中，常采用两种富集技术：激光显微切割（LCM）和切片机切片。LCM可实现高度靶向的组织采集，可用于从异质性组织中分离特定且保存良好的细胞类型^9,10。然而，LCM需要昂贵的设备，且对大量样本进行操作时耗时过长，难以普及。切片机切片是一种更广泛使用的方法，通过从FFPET组织块上切下薄片获取样本^11,12。切片机所获得的切片通常包含细胞保存状态（例如，坏死组织与保存良好组织）和组织组成（例如，癌组织与良性实质组织）均不均一的区域，因此可能导致本应分别分析的分子特征被混合均质化。因此，亟需一种高通量的方法，以实现对目标细胞的有效富集。第三种方法——从FFPET组织芯中提取核酸——可提供此类富集，适用于高通量实验流程，并已被其他研究者用于从独立的组织芯中分离RNA或DNA^7,13,14。

已有多种已发表的方案详细说明了从福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPET）中提取核酸的方法（表1）。然而，那些从同一样本组织中同时提取RNA和DNA的方案，目前仅针对切片机获取的组织切片进行了优化，尚未针对组织芯进行优化^15,16。类似地，一些已发表的方案虽然通过组织芯或载玻片显微切割提高了组织特异性，但仅提供了DNA提取的流程，未涉及RNA提取^7,17。本文展示了一种从同一组织芯中同时提取DNA和RNA的优化方案。组织芯通过将组织微阵列（TMA）打孔针插入已标记在FFPET蜡块上的目标区域获得。标记过程是先用记号笔在显微镜玻片上标注目标区域，再将该标注转移至对应的FFPET蜡块表面（图1）。

此前为开发本方案所开展的工作包括对多种市售核酸提取系统的比较。在该比较中，如下文所述对商业试剂盒方案进行的修改可获得最高产量和质量的DNA与RNA（Selvarajah 等，待发表）。组织芯样本比通常用于FFPET提取方案的5–10 µm切片更厚^{11,12,14,18-20}，且可能含有更多可变含量的石蜡。为弥补这一差异，通过重复使用二甲苯和乙醇处理，并引入机械驱动的均质化步骤，增强了脱蜡效果（图1）。此外，延长蛋白酶K消化时间以提高DNA得率。总体而言，本方案成本较低，能够在大规模、特征明确的人群中建立分子特征与组织病理学特征之间的关联。整个方案可在2天内稳定完成，包括3小时的实际操作时间，且几乎无需特殊或昂贵的设备。

以下分步方案为生产商方案的修改版本²¹。有关特定试剂、设备及生产商信息，请参见材料/设备表。

方案

1. 组织取芯

1. 检查显微镜玻片，并使用细头永久性记号笔标出感兴趣区域。剪下一足够大的石蜡膜片，以覆盖玻片上的感兴趣区域。将膜片牢固地贴在玻片上，并将边缘包裹住，防止膜片滑动。使用细头永久性记号笔，在组织整体轮廓以及组织内的感兴趣区域内进行描边，描边应紧贴但位于该区域外侧。
2. 取下膜片并转移至对应的组织包埋块上。通过翻转或旋转膜片，使其组织整体轮廓与包埋块中观察到的组织形状相匹配（图1）。将膜片部分牢固按压在包埋块表面，防止滑动。
3. 使用永久性记号笔的笔尖，沿着感兴趣区域的轮廓制作浅但可见的（约0.2 mm）压痕，然后取下膜片。分别向1.5或2.0 ml微量离心管中加入1 ml漂白剂、70%乙醇和水。
4. 将0.6 mm打孔器套装中的受体（红色）打孔针浸入含漂白剂的管中，上下滑动数次以清洗针头。依次用70%乙醇和水重复上述步骤（此步骤至关重要，以确保彻底去除残留漂白剂）。
5. 将打孔针插入感兴趣区域内，深入组织3 mm后拔出。用探针将组织芯推出，收集至低吸附性的1.5或2 ml离心管中。将组织芯储存于-20 °C（长期）或4 °C（短期）备用。
6. 按照步骤1.4清洁打孔针，然后继续处理下一个区域或样本。

2. 脱去FFPE组织芯中的石蜡

1. 在1.5或2 ml离心管中进行脱蜡：向组织芯中加入1 ml二甲苯，剧烈涡旋振荡10秒，然后在50 °C下加热3分钟。
2. 在室温（RT）下以最大速度（21,130 × g）离心2分钟，将离心管置于冰上5分钟（使蜡质残留物在上层凝固）。
3. 用移液器吸头小心移除弯月面周围积聚的石蜡及上清液，并重复二甲苯处理步骤（步骤2.1–2.2）。
4. 加入1 ml无水乙醇（100%），剧烈涡旋振荡10秒。在室温下以最大速度离心2分钟，小心弃去乙醇。重复上述步骤一次。

3. 脱蜡组织芯的匀浆化

1. 在均质化前，用 700 µl 无水乙醇（100%）重悬组织芯。使用电动组织匀浆器，在中等转速下将组织芯研磨成细小颗粒（约 1 分钟）。每次处理不同样本之间需清洁匀浆探针，以尽量减少交叉污染。
   1. 准备 15 ml 离心管，分别加入约 10 ml 次氯酸钠溶液、RNase 中和液和 70% 乙醇。样本匀浆后，按上述顺序依次在三种清洗溶液中清洗匀浆探针。清洗过程中，将匀浆器调至最高速运行。
   2. 用纸巾擦拭探针，并在处理下一个样本前确保探针完全干燥。目视检查探针刀片是否残留组织碎片，如发现残留，应再次清洁。次氯酸钠溶液、乙醇和 RNase 中和液需每日更换。
2. 匀浆完成后，加入约 300 µl 无水乙醇，使样本总体积达到 1 ml。以最大转速离心 15 分钟，小心吸除乙醇，将沉淀物在空气中干燥约 15–20 分钟，随后进行 RNA 提取。

4. 使用蛋白酶K进行消化

1. 将沉淀重悬于150 µl蛋白酶K消化缓冲液中，轻弹管壁以充分松动沉淀。加入10 µl耐高温蛋白酶K，通过轻弹混匀（切勿涡旋振荡）。将管内物质在56 °C孵育15分钟，并保持轻微振荡。
2. 将管置于冰上孵育3分钟。充分冷却对下一步高效沉淀至关重要。于最大转速离心15分钟。

5. 分离RNA与DNA

1. 小心转移上清液，避免扰动沉淀，至新的1.5 ml离心管中用于RNA纯化。
2. 保留沉淀用于DNA纯化（沉淀可在室温下保存2小时，在2-8 °C下保存最多1天，或在-20 °C下长期保存）。

6. RNA 纯化

1. 将含有 RNA 的上清液在 80 °C 下孵育 15 分钟（不得超过此时间）。随后短暂离心管子，以收集管盖内壁的液滴。
2. 加入 320 µl Buffer RLT 以调节结合条件，并用移液器吹打混匀。接着加入 720 µl 乙醇（100%），并涡旋振荡。
3. 将最多 600 µl 的样品（包括可能形成的任何沉淀物）转移至已置于 2 ml 收集管中的 RNA 离心柱（试剂盒提供），并将剩余样品暂存。在 ≥8,000 × g 条件下离心 15 秒，弃去穿流液并重复使用收集管。
4. 将剩余样品（包括可能积聚在管盖内的液滴）转移至离心柱中，在 ≥8,000 × g 条件下离心 15 秒，弃去穿流液。
5. 向离心柱中加入 350 µl Buffer FRN，在 ≥8,000 × g 条件下离心 15 秒，弃去穿流液，并在下一步中重复使用收集管。
6. 将 10 µl DNase I 储存液与 70 µl Buffer RDD 轻柔混匀，直接加至离心柱膜上，在室温下孵育 15 分钟。
7. 向离心柱中加入 500 µl Buffer FRN，在 ≥8,000 × g 条件下离心 15 秒，保留穿流液用于下一步。为提高小 RNA 的回收率，将离心柱放入新的 2 ml 收集管中，并将上一步所得穿流液重新加至离心柱上。
8. 在 ≥8,000 × g 条件下离心 15 秒，弃去穿流液，并在下一步中重复使用收集管。向离心柱中加入 500 µl Buffer RPE，在 ≥8,000 × g 条件下离心 15 秒，弃去穿流液，并在下一步中重复使用收集管。
9. 向离心柱中加入 500 µl Buffer RPE，在 ≥8,000 × g 条件下离心 15 秒，连同穿流液一起弃去收集管。
10. 将离心柱放入新的 2 ml 收集管中，打开管盖，在最大转速下离心 5 分钟。连同穿流液一起弃去收集管。
11. 将离心柱放入新的 1.5 ml 收集管中，直接向离心柱膜上加入 20 µl 无 RNase 水，室温孵育 1 分钟。在最大转速下离心 1 分钟以洗脱 RNA。将洗脱的 RNA 样品储存在 -80 °C 下。

7. DNA 纯化

1. 通过逐步加入45 µl蛋白酶K缓冲液（400 mM Tris 7.5，400 mM NaCl，3 mM MgCl₂，4% SDS）、45 µl H₂O和400 µg高活性蛋白酶K，重悬RNA提取过程中获得的沉淀。
2. 将上述溶液在56 °C孵育24小时（推荐）或过夜。也可在90 °C孵育2小时而不振荡，并短暂离心微量离心管以收集管盖内壁的液滴。
3. 让样品冷却至室温，然后加入4 µl RNase A（100 mg/ml）。在室温下孵育2分钟。
4. 向样品中加入200 µl Buffer AL，通过涡旋充分混匀。接着加入200 µl 100%乙醇，再次通过涡旋充分混匀。将全部样品转移至提供的离心柱中，放入2 ml收集管中，在≥8,000 x g条件下离心1分钟。
5. 弃去含有穿流液的收集管，将离心柱放入新的2 ml收集管中。向离心柱中加入700 µl Buffer AW1，在≥8,000 x g条件下离心15秒，弃去穿流液并重复使用该收集管。
6. 向离心柱中加入700 µl Buffer AW2，在≥8,000 x g条件下离心15秒，弃去穿流液并重复使用该收集管。接着向离心柱中加入700 µl 100%乙醇，在≥8,000 x g条件下离心15秒，然后弃去含有穿流液的收集管。
7. 将离心柱放入新的2 ml收集管中，打开离心柱盖子，在最大转速下离心5分钟。弃去含有穿流液的收集管。
8. 将离心柱放入新的1.5 ml收集管中，加入25 µl预热的无核酸酶水（50 °C）。将离心柱和收集管在50 °C孵育10分钟。在最大转速下离心1分钟，然后向离心柱中加入25 µl无核酸酶水（室温），并在室温下孵育1分钟。
9. 在最大转速（21,130 x g）下离心1分钟，收集含有基因组DNA的穿流液（总共约50 µl DNA）。将离心柱储存于-20 °C（以备后续可能需要再次洗脱）。

结果

本方案介绍了一种从组织芯中回收DNA和RNA的优化方法，该方法对专为组织切片设计的商业提取系统进行了改进。优化内容包括引入组织匀浆步骤、在DNA提取过程中使用活性更强的蛋白酶K，以及延长组织消化时间。图示与统计分析采用了双因素方差分析（2-way ANOVA）、线性回归及相关性分析。

蛋白酶消化的优化
商用试剂盒中包含一种室温稳定的蛋白酶K溶液，我们将其替换为一种活性更强的蛋白酶K，从而获得了更高的DNA产量（图2A）。为进一步提高DNA产量，将消化时间从2小时延长至24小时。两个时间点之间的产量差异无统计学意义，但24小时消化在不同样本间的DNA产量更为稳定。然而，将孵育时间进一步延长至48小时并未进一步改善DNA回收率（图2B；p = 0.74）。

福尔马林固定石蜡包埋的前列腺癌组织样本中典型的DNA回收

采用优化后的方案，从333例前列腺癌FFPET样本中同时提取了RNA和DNA，样本保存时间介于3至14年之间。每个样本使用3个组织芯（平均总组织体积为0.95 ± 0.13 mm³）作为起始材料。尽管存在其他基于微流控凝胶电泳的方法可用于估算浓度并评估核酸分子的片段大小分布，但这类方法无法实现可重复的核酸定量，也不能像基于荧光检测的分析方法那样区分RNA与DNA²²。此外，由于基于微流控的凝胶电泳在分析来自FFPET的片段化核酸时结果不可靠²³，因此本研究采用荧光法定量核酸产量（详见试剂列表）。平均产量为2,270 ng RNA和820 ng DNA（图3A）。本研究中约90%的FFPET样本可获得≥100 ng DNA和≥500 ng RNA。有趣的是，FFPET样本的保存时间与核酸回收量之间无显著相关性（图3B）。总体而言，不同样本间的RNA与DNA产量呈正相关（R² = 0.39；p <0.0001），但每个样本中回收的RNA量超过DNA量的两倍以上（图3C）。

由于初步试验和优化工作是在前列腺组织上进行的，下一步是考察该方案在其他几种存档组织类型中的表现。从手术切除和尸检来源的福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPET）样本开始，包括良性肝脏组织（1例1个样本）、脑癌（1例8个样本）、膀胱癌（2例2个样本）以及乳腺癌（3例3个样本），该方案获得了 >90% 样品中的 100 ng DNA 和 RNA（图3D尽管尸体解剖组织中的核酸得率低于手术组织，但代表性结果表明，该方案在来源于不同部位的癌症组织中均能产生相似的得率。

RNA和DNA完整性评估及其在下游分析中的代表性表现

采用一种专为FFPET样本优化的商用多指标基因表达分析平台，对8个选定的FFPET前列腺癌样本以及一个新鲜的PC-3前列腺癌细胞系样本（作为阳性对照）中47个基因的RNA表达水平进行了分析。PC3样本中的mRNA拷贝数通常高于FFPET样本（图4A）。然而，在比较所有基因的相对表达水平时，FFPET前列腺癌样本显示出与PC-3 RNA相似的表达谱，表明这两种来源的RNA均适用于RNA表达谱分析。

为了验证采用本方案提取的基因组DNA的性能，对来自FFPET样本的经亚硫酸氢盐转化的DNA提取物进行了甲基化特异性PCR（MSP）扩增²⁴。ALU重复元件的MSP分析被用作基因组甲基化对照，该元件在人类基因组中存在数百万个拷贝，且通常高度甲基化²⁵，预期在不同样本间表现出极小的变异。如图4B所示，不同样本间的ALU MSP甲基化水平几乎没有差异。此外，基于GSTP1基因的MSP检测显示，在良性样本的DNA中未检测到可扩增信号；该基因已知在前列腺癌中呈高甲基化，而在良性样本中则不发生甲基化²⁶。与预期一致，在癌组织DNA中检测到较低的qPCR循环阈值（Ct值），表明甲基化的GSTP1拷贝富集。本方案所回收核酸的有效性还在典型的下游实验中进一步验证，所用样本包括来自良性肝组织、脑组织（死后）以及两个手术切除的乳腺癌样本。基于RT-qPCR的表达分析和MSP检测在乳腺癌和肝组织FFPET样本中均表现良好，但RT-PCR检测未能从死后脑肿瘤样本中扩增出一种本应高表达的mRNA（图4C），提示RNA可能已降解，原因可能是组织固定延迟所致。

图1：FFPET样本提取流程概览。 该图展示了如何根据显微镜切片的组织病理学选择，在组织块上定位感兴趣区域。随后使用活检打孔器从每个组织区域获取三个0.6 mm的组织芯，合并后进行匀浆处理，接着同时提取RNA和DNA。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：核酸（DNA 和 RNA）产量，单位为 ng/mm³ 两种蛋白酶K（耐高温高活性酶）对FFPET的处理，以及后者在不同孵育时间下的测试。 (A不同供应商的蛋白酶K性能比较。使用试剂盒中提供的耐热酶与另一制造商的更强效酶，对一份代表性FFPET样本进行DNA提取。B) 确定最佳蛋白酶K孵育时间以最大化DNA产量。采用3个FFPET样本，在三种不同孵育时间下评估高浓度蛋白酶K消化的效果。误差线表示平均值的标准误（SEM）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图3：核酸（DNA 和 RNA）产量，单位为 ng/mm³ 总样本年份和代表性组织类型中FFPET的分布情况。 （A）从福尔马林固定石蜡包埋组织中提取的总回收核酸。所示核酸量基于采用优化方案提取的333个FFPET样本的结果。B) 石蜡包埋组织样本（FFPET）的总DNA和RNA回收量与其样本年龄的相关性图。所用提取的FFPET样本采集年份为2000年至2012年。 (C) 333个前列腺样本中同时提取的DNA和RNA得率之间的相关性。DNA与RNA得率之间存在正相关关系。D) 使用其他存档组织类型演示该方案。采用优化后的方案从14个癌症（乳腺、膀胱和脑）及正常（肝脏）样本中提取核酸。误差线代表标准误（SEM）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图4：从组织芯中共同提取的RNA和DNA在下游应用中的表现。（A）FFPE前列腺癌组织及新鲜PC-3细胞系对照的mRNA计数。每个数据点代表3次独立技术重复的平均值。新鲜PC-3细胞系RNA值以黄色柱状图表示，FFPET组织值以彩色圆点表示。（B）FFPET前列腺癌样本DNA的甲基化特异性PCR检测。使用50 ng/反应的亚硫酸氢盐转化DNA，对10个样本进行检测，获得预期的循环阈值。所有FFPET样本的ALU MSP检测具有相似的循环阈值（p >0.67）。GSTP1 MSP检测显示，前列腺癌中的甲基化水平（循环阈值更低）高于良性前列腺组织。（C）对其他组织类型提取的DNA和RNA质量的评估。对从正常肝脏（尸检）、脑组织（尸检）和乳腺癌（均为FFPET）中分别提取的核酸（RNA和DNA）进行了HPRT1基因表达和Alu基因甲基化检测。前列腺组织的结果作为对照显示。注意：除一个尸检样本的mRNA扩增失败外，其余各类组织均观察到类似结果。每个数据点或柱状图代表一个样本，误差线表示标准误（SEM）。请点击此处查看该图的放大版本。

组织芯
	组织投入量 (mm³)	提取的核酸	验证		质量检测：DNA			质量检测：RNA
			（样本数）	样本年龄（年）	总得率 (ng)	片段大小 (bp)	PCR	总得率 (ng)	片段大小 (bp)	PCR	NanoString
Pikor et al.	43 - 129	DNA	无数据	无数据	无数据	无数据
Montaser-Kouhsari et al.	18 - 29.5	RNA	763	0-25				843	无数据
本文	1.71	DNA 和 RNA	>350	3-12	820	100 - 500		2270	100-500
组织切片
	组织投入量	提取的核酸	验证		质量检测：DNA			质量检测：RNA
			（样本数）	样本年龄（年）	总得率 (ng)	片段大小 (bp)	PCR	总得率 (ng)	片段大小 (bp)	PCR	NanoString
Heikal et al.	5 x 5 µm	DNA	12	7-22	88-300	103-351
Chung et al.	1 x 20 µm	RNA	9	>5				16,000-   23,000	100-200
Antica et al.	2 x 4 µm	RNA	18	无数据				未知 (621 ng/µl)	80-202 +
Ghatak et al.	5 x 5 µm	DNA 和 RNA	5	1	14 256	<1030		16 000	109-400 +
Hennig et al.	1 x 10 µm	DNA 和 RNA	210	1-25	无数据	无数据		无数据	无数据
激光捕获显微切割
	组织投入量 (mm²)	提取的核酸	验证		质量检测：DNA			质量检测：RNA
			（样本数）	样本年龄（年）	总得率 (ng)	片段大小 (bp)	PCR	总得率 (ng)	片段大小 (bp)	PCR	NanoString
Snow et al.	1-2	DNA	110	0-2	430	无数据

表1：  组织芯、组织切片和激光捕获显微切割样本的已发表DNA和RNA提取方案比较。 还包括使用PCR和Nanostring检测方法对这些方案进行的若干分子终点评估。

讨论

为了成功从目标组织区域提取 DNA 和 RNA，精确的取芯至关重要。本方案描述了使用组织打孔器分离直径为 0.6 mm 的组织芯，并概述了将显微镜玻片上的标记准确转移到相应 FFPET 块的流程。由于原厂商方案旨在用于切片厚度远小于组织芯的微米切片（组织芯厚度约为其 50 倍），因此需对该方案进行修改，以高效地从组织芯中提取核酸。由于组织芯中可能含有相对于常规组织切片更多的石蜡，因此需要通过重复的二甲苯和乙醇处理步骤实现有效的脱蜡。脱蜡后的步骤成功与否，取决于充分的机械组织芯均质化以及高效的蛋白酶 K 消化。可进一步优化蛋白酶 K 的消化条件。

值得指出的是，该方法可识别组织块表面与相应组织病理学切片中所确定的兴趣区域。由于穿刺获取的组织可能深达3或4 mm，本方案的使用者可能会关注组织块表面下方存在哪些细胞或组织。尽管这一担忧是合理的，但多项研究（详见参考文献²⁷）已证实，组织芯能够真实地代表病理组织块的组织学和分子特征，尤其是在从兴趣区域采集双份或三份复本组织芯的情况下。

由于本方案采用的改良型商用提取试剂盒能够从同一样本组织中同时提取DNA和RNA，因此该方法节省了宝贵的生物材料，并允许对同一样本中获得的两种核酸进行直接比较。同时提取RNA和DNA可使实验工作量和组织消耗减少一半，并实现对基因表达以及DNA中存在的表观遗传和遗传特征进行精确的整合分析。由于从这些代表性组织核心样本中提取的RNA和DNA产量通常分别超过600 ng和300 ng，而目前大多数PCR和高通量测序应用通常仅需10–100 ng，因此本方案纯化的大多数样本应足以支持多项下游检测。该方案已在不同独立实验室中验证具有良好的可重复性（Selvarajah et al.，正在准备中）。本方案获得的RNA质量足以用于RT-PCR或常用的多指标分析平台进行基因表达分析，而提取的DNA在甲基化特异性PCR检测中也表现良好。未来有必要进一步研究该方法回收的核酸在高通量测序中的应用价值。

因此，对一种 commercially available 的方案进行了多项改进，该方案原本针对薄层 FFPET 切片设计，现已被优化为适用于从 0.6 mm 的 FFPET 组织芯中同时提取 RNA 和 DNA。该方案在大量前列腺癌样本以及部分乳腺癌、脑癌和膀胱癌样本中均表现出稳定且较高的提取得率。总体而言，该方案可使研究人员对大规模、注释完善的人类组织样本库开展靶向基因分析。尤为重要的是，该方案支持对 FFPET 样本中感兴趣区域进行高效、精准的取样，操作耗时短，且提取得率足以满足大多数下游应用的需求。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
塑料石蜡膜，"Parafilm 'M'"	Bemis	RK-06720-40	任何通用石蜡膜均可作为替代品
次氯酸钠，"Ultra Bleach"	Likewise	53-2879-2	任何通用漂白剂均可作为替代品。该物质为危险品，接触后可能引起灼伤。
分子生物学级无水乙醇	Fisher BioReagents	BP2818-500	Sigma-Aldrich E7023 可作为替代品
分子级 H2O	G-Biosciences	786-293	Sigma W4502 可作为替代品，其他品牌的分子级 H2O 亦可使用
0.6 mm 打孔器套装（适用于 Beecher Instruments ）	Estigen	MPO6[黄色]	请确保使用该套装中的红色接收打孔针
细尖永久性记号笔	Sharpie	10365796S	在 FFPE 组织上使用该记号笔会使其迅速干燥，因此可能需要准备多支
FFPE 组织块
与 FFPE 组织块对应的染色组织切片
1.5 ml 微型离心管	Fisher BioReagents	05-408-137
2.0 ml 低吸附管（LoBind 微型离心管）	Eppendorf	22431048
1.5 ml 低吸附管（LoBind 微型离心管）	Eppendorf	22431021
组织学级二甲苯	VWR	CA 95057-822	Fisher Scientific X5-500 可作为替代品
分子生物学级 2-丙醇	Sigma	I9516
AllPrep FFPE DNA/RNA 试剂盒	Qiagen	80234	根据 AllPrep DNA/RNA FFPE 手册21 准备缓冲液
缓冲液：RLT、FRN、RPE、ATL、AL、AW1、AW2、DNaseI 溶液	Qiagen	80234	根据 AllPrep DNA/RNA FFPE 手册21 准备缓冲液
耐高温蛋白酶 K	Qiagen	80234
高活性蛋白酶 K	Invitrogen	25530-049	Invitrogen 25530-015 可作为替代品
RNase 中和溶液（Rnase AWAY）	Molecular BioProducts	7003
RNaseA 100 mg/ml	Qiagen	19101
BD Integra 注射器 3 ml 21G × 1/2	BD	305274
电动组织匀浆器（TissueRuptor）	Qiagen	9001271	Fisher Scientific 14-261-29 可作为替代品
-20 °C 和 -80 °C 实验室冷冻柜
配有 2 ml 管转子的微型离心机
数字涡旋混合器
移液器及滤芯吸头
加热块或水浴锅
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐	Amresco	0234
氯化钠	Amresco	0241
无水氯化镁	Sigma	M8266
十二烷基硫酸钠	Sigma	L4509
Acrodisc 25 mm 注射式滤器，带 0.45 µm Supor 膜	Pall	PN 4614
带可回缩 BD PrecisionGlide 针头的 3 ml 注射器	BD Integra	305274
盐酸	BDH	3026
多靶点基因表达检测平台（nCounter ® CAE 探针组和 Nanostring nCounter 平台）	Nanostring nCounter 平台，Nanostring
荧光法定量核酸（Qubit dsDNA HS 检测试剂盒和 Qubit® RNA BR 检测试剂盒）	Invitrogen